GmPIN1基因突变调控大豆结瘤和密植的方法及其应用与流程

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及gmpin1基因突变调控大豆结瘤和密植的方法及其应用。
背景技术：
：大豆作为我国重要的经济作物之一，它富含蛋白质和油脂，有非常高的营养价值。然而，随着我国居民生活水平的不断提高，我国的大豆产量已无法满足自身的需求，以至于我国每年需要从国外进口大量的大豆。据统计，我国的大豆进口量已从2001的1394万吨快速增加到2018年的8806万吨[1]。进一步的分析发现，在这近20年的时间里，我国大豆的单位面积产量几乎没有变化,而且我国的大豆单产产量远低于同期的美国、巴西和阿根廷的大豆单产产量[1]。因此，提高我国大豆的单位面积产量是非常必要的。过去几十年的农业生产实践已经表明，肥料的施用能够有效的提高作物的产量。联合国粮农组织的统计数据表明，化肥的施用对农作物增产的贡献率达到40％-60％[2]。在1952年至1992年期间，我国肥料施用量与粮食产量之间的相关系数高达92％以上[2]。然而，作物对肥料的吸收和利用的效率不高。统计数据表明，作物对氮的利用率为30％-60％，磷的利用率为2％-25％，钾的利用率为30％-60％[3]。肥料的大量施用不仅造成浪费而且还会对周边的生态环境和人体健康带来危害。自然界中固氮微生物能够将大气中的氮气转化成植物能够吸收利用的氨。其中豆科植物与根瘤菌形成的根瘤所固定的氮约占生物固氮总固氮量的60％[4]。有研究表明，在相同种植条件下，大豆是固氮量最多的豆科作物[5]。大豆的固氮量在大豆吸收的总氮量中占比高达50％以上[5]。进一步的研究表明，大豆根瘤共生固氮对与种子的发育有着重要的作用[6]。研究者也发现，根瘤菌的接种可以使得大豆的产量大幅度的增加[7]。此外，提高根瘤中氮素的输出也能够显著的提高大豆的产量[8]。综上所述，合理的利用大豆结瘤固氮有利于提高大豆的产量，并且合理的利用生物固氮可有效的减少肥料的施用。因此，深入的了解大豆根瘤的生长发育是非常有必要的。生长素作为调控植物生长发育的重要激素，在豆科植物例如百脉根、苜蓿的根瘤发育过程中已被报道发挥着至关重要的作用[9-12]。然而有关pin基因在根瘤发育中的研究仍比较少，且在大豆中未见相关报道[13]。因此，在大豆中开展pin基因相关的研究对深入的了解根瘤形成机理是必要的。同时，这也为获得高效结瘤的大豆植株提供了必要的理论基础。此外，株型是决定大豆高产的一个重要性状，几十年来，通过优化大豆株型来培育理想株型的高产大豆一直是育种家及科研工作者的目标，然而调控大豆理想株型的主效基因报道较少[14]。理想株型的一个重要指标是侧枝与主茎之间的夹角，夹角大小影响植物地上部分的冠层结构、整体受光面积，最终影响光合作用和产量。夹角越小，其叶面必能向上伸展，整株占用空间面积就小，这样不但有利合理利用光源、通风良好，还能够通过密植促使平均亩产量提高。众所周知，生长素在控制植物的顶端优势和侧枝生长过程中发挥关键的作用，顶芽产生的大量生长素向下运输到侧芽，导致侧芽的生长受抑制[15,16]。因而，利用生长素运输控制侧枝夹角在植物密植中有重要的应用意义[17]。技术实现要素：本发明的目的在于创制了不含有能够正常运输生长素的gmpin1a，gmpin1b和gmpin1c蛋白的基因编辑大豆gmpin1abc三突变体，并为大豆理想株型的建立和应用提供了良好的种质资源储备。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：gmpin1基因突变调控大豆结瘤和密植的方法，其特征在于，使大豆植株gmpin1中的三个同源基因gmpin1a，gmpin1b，gmpin1c发生突变，获得大豆三突变体gmpin1abc；其中gmpin1a基因核酸序列如seqidno.1所示；gmpin1b基因核酸序列如seqidno.2所示；gmpin1c基因核酸序列如seqidno.3所示。进一步的，采用基因敲除方式使gmpin1中的三个同源基因gmpin1a，gmpin1b，gmpin1c同时出现碱基缺失，使蛋白提前终止。进一步的，大豆三突变体gmpin1abc通过下列方法获得：s1：利用crispr-ge(http://skl.scau.edu.cn/home/)在线工具设计构建同时靶向gmpin1a，gmpin1b，gmpin1c三个基因的sgrna；s2，利用退火反应获得双链寡核苷酸；s3：利用bsai核酸内切酶线性化pef1a2载体；s4：利用t4连接酶将s2和s3所获得的产物连接在一起；s5：将s4所获得的质粒载体导入到gv3101农杆菌中；s6：利用s5所获得的农杆菌用于侵染大豆；s7：将步骤s6所获得的产物进行植物组织培养；s8：对s7所获得的组培苗进行植物抗性(basta)筛选，从而获得不含crispr/cas9载体片段的稳定的转基因大豆。上述gmpin1基因突变调控大豆结瘤和密植的方法能够应用于大豆及其相关株型中结瘤数目侧枝夹角的调节。有益效果：本发明为首次创制了不含有能够正常运输生长素的gmpin1abc的基因编辑大豆三突变体，大豆蛋白gmpin1a，gmpin1b，gmpin1c及其编码基因与大豆共生结瘤的发生密切相关，基因敲除后减少大豆的结瘤数目并显著减弱地上部分的侧枝夹角。并且，转基因大豆gmpin1abc-l1的纯合三突变体后代中筛选到不含crispr/cas9载体片段的植株，为调节大豆共生固氮和密植、高产育种提供优良的种质资源储备。附图说明图1为gmpin1abc的基1因编辑大豆纯合三突变体发生编辑的核苷酸序列。图2为实施例1中野生型大豆与gmpin1abc的基因编辑大豆三突变体的结瘤表型；图3为实施例2中野生型大豆与gmpin1abc的基因编辑大豆三突变体的株型表型；图4为实施例2中野生型大豆与gmpin1abc-l1的基因编辑大豆纯合三突变体的侧枝表型。具体实施方法以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法及装置，如无特殊说明，均为常规方法及装置。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购得。以下实施例中对突变体突变位点的确定，均由常规测序公司测序确定。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。实施例中大豆栽培品种选用华春6号。华春6号是由华南农业大学农学院选育的，用品种桂早1号×巴西8号选育而成的大豆品种。2009年7月28日经第二届国家农作物品种审定委员会第三次会议审定通过，审定编号为国审豆2009012。大豆crispr/cas9载体pges201：记载于：baim,yuanj,kuangh,etal.generationofamultiplexmutagenesispopulationviapooledcrispr-cas9insoybean[j].plantbiotechnologyjournal,2019,18(3).：公众可以从福建农林大学海峡联合研究院园艺中心获得。gmpin1基因突变调控大豆结瘤和密植的方法，其特征在于，使大豆植株gmpin1中的三个同源基因gmpin1a，gmpin1b，gmpin1c发生突变，获得大豆三突变体gmpin1abc；其中gmpin1a基因核酸序列如seqidno.1所示；gmpin1b基因核酸序列如seqidno.2所示；gmpin1c基因核酸序列如seqidno.3所示。进一步的，采用基因敲除方式使gmpin1中的三个同源基因gmpin1a，gmpin1b，gmpin1c同时出现碱基缺失，使蛋白提前终止。进一步的，大豆三突变体gmpin1abc通过下列方法获得：s1：利用crispr-ge(http://skl.scau.edu.cn/home/)在线工具设计构建同时靶向gmpin1a，gmpin1b，gmpin1c三个基因的sgrna；参照附图2，crispr-cas9的基因编辑位点sgrna序列靶向gmpin1a、gmpin1b和gmpin1c的第一个外显子位置，方框出区域为靶向位点，省略号标注的核苷酸为gmpin1abc的基因编辑大豆三突变体编辑后缺失的情况。s2，利用退火反应获得双链寡核苷酸；s3：利用bsai核酸内切酶线性化pef1a2载体；s4：利用t4连接酶将s2和s3所获得的产物连接在一起；s5：将s4所获得的质粒载体导入到gv3101农杆菌中；s6：利用s5所获得的农杆菌用于侵染大豆；s7：将步骤s6所获得的产物进行植物组织培养；s8：对s7所获得的组培苗进行植物抗性筛选，从而获得不含crispr/cas9载体片段的稳定的转基因大豆。实施例1野生型大豆(wt)及大豆三突变体gmpin1abc采用下述方式进行培育。大豆生长间的光照时长为14小时，温度为25℃。大豆种子在蛭石上进行萌发。在种子萌发后的第7天，将od值为0.15的根瘤菌bxyd3均匀地从蛭石表面浇灌到大豆根部，随后浇注1/10氮水培液保湿并继续培养14天。1/10氮水培液配方如下表所示：成分kno3nh4no3ca(no3)2·4h2omgso4·7h2o浓度(mmol/l)0.150.040.120.5成分k2so4znso4·7h2omnso4·h2ocuso4·5h2o浓度(mmol/l)1.051.5*10-30.5*10-30.5*10-3成分(nh4)6m9o24nab4o7·10h2okh2po4fe-edta浓度(mmol/l)0.15*10-32.5*10-30.250.04成分(nh4)2so4mgcl2·6h2ococl2·6h2ocacl2浓度(mmol/l)0.030.0250.00011.2野生型大豆(wt)与gmpin1abc的基因编辑大豆三突变体的结瘤表型如附图2所示；gmpin1abc表现为结瘤数量nodulenumber整体下降，并且结瘤密度noduledensity(根瘤数量除以根面积)下降，但根瘤的平均直径nodulesizeprofile没有发生显著变化。7天的幼苗的根经过根瘤菌侵染后14天的根瘤数量、密度和直径统计。p-values经过two-tailedstudent’st-test检验(***p<0.001)。实施例2野生型大豆(wt)及大豆三突变体gmpin1abc采用下述方式进行培育。大豆生长间的光照时长为14小时，温度为25℃。大豆种子在蛭石上进行萌发。在种子萌发后的第10天，移入营养土与黄土混合的土质中于室外种植45天。野生型大豆(wt)与gmpin1abc的基因编辑大豆三突变体的株型表型如附图3所示；10天的幼苗移入土质后室外生长45天后的整体株型矮小，侧枝夹角减小。野生型大豆与gmpin1abc-l1的基因编辑大豆纯合三突变体的侧枝表型如附图4所示；比对野生型wt，不含crispr/cas9载体片段的纯合三突变体大豆gmpin1abc-l1的侧枝夹角(branchangle)显著减小且侧枝数目(branchnumber)显著增加。p-values经过two-tailedstudent’st-test检验(**p<0.01，****p<0.0001)。参考文献：[1]肖卫东,杜志雄.中国大豆产业发展:主要问题、原因及对策建议[j].全球化,2019,05):105-18+36.[2]王宏庭,金继运.农业养分资源精准管理研究进展[j].山西农业科学,2005,01):68-72.[3]郑良永,杜丽清.我国农业化肥污染及环境保护对策[j].中国热带农业,2013,02):76-8.[4]李欣欣,许锐能,廖红.大豆共生固氮在农业减肥增效中的贡献及应用潜力[j].大豆科学,2016,35(04):531-5.[5]herridgedf,peoplesmb,boddeyrm.globalinputsofbiologicalnitrogenfixationinagriculturalsystems[j].plant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