一种基于片段化萤光素酶-DNA嵌合体互补的发光体系、构建方法及其应用与流程

一种基于片段化萤光素酶-dna嵌合体互补的发光体系、构建方法及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物医学分析领域，尤其涉及一种基于片段化萤光素酶-dna嵌合体互补的发光体系、构建方法及其应用。


背景技术：

[0002]
存在于人体外周血中的micrornas(mirnas)是肿瘤等重大疾病早期诊断的关键标志物。目前，在mirnas检测中应用的主要技术包括：northern blot、dna微列阵、实时荧光定量聚合酶链式反应等。然而，上述技术的实现需要配备昂贵的大型仪器设备和专业化的检测人员，同时检测过程往往涉及较为复杂的操作流程。以上问题制约了mirnas检测技术的临床转化。
[0003]
片段萤光素酶互补发光是近年来建立的生物医学分析技术。该技术无需外部光源激发即可产生检测信号，具有信噪比高、对检测设备要求较低的优点。虽然萤光素酶互补发光已在蛋白质检测领域得到了一定的应用，但是尚未涉及核酸尤其是mirnas的检测。造成上述问题的主要原因在于，片段化的萤光素酶蛋白无法直接与核酸靶标进行结合并产生检测信号。


技术实现要素：

[0004]
针对以上问题，本发明的目的在于提供一种基于片段化萤光素酶-dna嵌合体的互补发光技术，以及该技术在mirnas标志物检测中的应用；所述技术可实现片段化萤光素酶对核酸的高信噪比传感，进而实现多种mirnas的高灵敏度、高特异性的通用化检测；此外，检测信号的读取仅需一部廉价的智能手机即可实现，具有操作简便、成本低廉的优势。
[0005]
本发明的技术方案为一种基于片段化萤光素酶-dna嵌合体互补的发光体系，包括以下三个部分：萤光素酶大亚基-dna嵌合体、萤光素酶小亚基-dna嵌合体和实现上述两种嵌合体互补发光的单链dna模板。
[0006]
其中，所述萤光素酶大亚基-dna嵌合体由融合有snap-tag的萤光素酶大亚基和单链dna探针probe1组成；所述融合有snap-tag的萤光素酶大亚基的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述单链dna探针probe1的序列如seq id no.2所示。
[0007]
而且，所述融合有snap-tag的萤光素酶大亚基的基因编码序列如seq id no.6所示。
[0008]
其中，所述萤光素酶小亚基-dna嵌合体由融合有snap-tag的萤光素酶小亚基和单链dna探针probe2组成；所述融合有snap-tag的萤光素酶小亚基的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述单链dna探针probe2的序列如seq id no.4所示。
[0009]
而且，所述融合有snap-tag的萤光素酶小亚基的基因编码序列如seq id no.7所示。
[0010]
其中，所述实现上述两种嵌合体互补发光的单链dna模板的序列如seq id no.5所
示。
[0011]
一种片段化萤光素酶-dna嵌合体的构建方法，包括以下步骤：
[0012]
步骤1.大肠杆菌蛋白质表达体系的制备：通过基因合成技术分别合成融合有snap-tag的萤光素酶大亚基或融合有snap-tag的萤光素酶小亚基编码序列，并将其插入质粒载体pet-26(b+)中，所得重组质粒转化进入大肠杆菌bl21(de3)菌株；
[0013]
步骤2.蛋白质的表达与纯化：将步骤1中含有表达载体的大肠杆菌接种到含有卡那霉素的液体培养基中，经震荡培养后，再加入诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导培养10-12h；离心收集液体培养基中的菌体，充分重悬菌体沉淀，通过超声波破碎后进行离心直至得到的溶液变澄清，提取溶液的上清液通过镍亲和层析进行纯化，并通过脱盐柱脱盐，得到融合有snap-tag的片段化萤光素酶大亚基或融合有snap-tag的萤光素酶小亚基；
[0014]
步骤3.dna与蛋白质的偶联：将步骤2中得到的融合有snap-tag的片段化萤光素酶大亚基与活化后的probe1混合孵育、或将步骤2中得到的融合有snap-tag的片段化萤光素酶小亚基与活化后的probe2混合孵育，再通过镍亲和磁珠溶液和阴离子交换层析进行纯化，即得到萤光素酶大亚基-dna嵌合体或萤光素酶小亚基-dna嵌合体。
[0015]
以及基于片段化萤光素酶-dna嵌合体互补的发光体系在mirnas检测中的应用。
[0016]
一种基于片段化萤光素酶-dna嵌合体互补的发光体系检测mirnas的方法，包括以下步骤：
[0017]
步骤1.探针设计：设计融合有靶标mirnas识别序列和片段化萤光素酶-dna嵌合体识别序列的单链dna探针；
[0018]
步骤2.mirnas靶标的扩增：将待检测的mirnas与单链dna探针、t4 dna 连接酶缓冲液、二硫苏糖醇、rnase inhibitor、t4 dna连接酶混合反应2小时，再加入dntps、dtt、phi-29dna聚合酶和rnase inhibitor反应1～2小时，完成扩增反应；
[0019]
步骤3.片段化萤光素酶-dna嵌合体的重组：步骤3所得反应产物与片段化萤光素酶大亚基-dna嵌合体、片段化萤光素酶小亚基-dna嵌合体混合于反应缓冲液中，并在室温下孵育10分钟得到检测体系；
[0020]
步骤4.检测：向步骤3所得检测体系加入萤光素酶底物溶液后置于暗盒，最终通过智能设备终端对发光检测信号进行读取和分析。
[0021]
而且，步骤1中根据mir-21序列设计合成的单链dna探针的核苷酸序列如seq id no.9所示；步骤1中根据mir-148b序列设计合成单链dna探针的核苷酸序列如seq id no.11所示。
[0022]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)基于本发明所述的片段化萤光素酶-dna嵌合体系统，可实现核酸靶标的高信噪比互补发光传感，从而将萤光素酶互补发光传感原理拓展到了核酸检测领域；(2)所述mirnas标志物的检测可通过未经任何硬件改造的智能手机完成，具有成本低廉、操作简单，不依赖专业人员的特点。
附图说明
[0023]
图1为本发明提供的片段化萤光素酶-dna嵌合体的结构及其传感原理示意图；
[0024]
图2为本发明实施例1中片段化萤光素酶-dna嵌合体互补发光所产生的光谱图；
[0025]
图3为本发明实施例2中基于智能手机检测不同浓度mir-21的结果示意图；
[0026]
图4为本发明实施例3中基于智能手机检测不同浓度mir-148b的结果示意图。
具体实施方式
[0027]
下面结合附图和实施例对本发明进行详细具体说明，本发明的内容不局限于以下实施例。
[0028]
实施例1：片段化萤光素酶-dna嵌合体的制备及核酸传感
[0029]
本发明中两种嵌合体的结构如图1所示，两者制备方法如下：
[0030]
(1)重组质粒的构建：通过基因合成技术分别合成融合有snap-tag的片段化萤光素酶大、小亚基编码序列，并将合成的片段分别克隆进pet-26(b+)的ndei和hindiii酶切位点之间；所得重组载体通过cacl2法导入大肠杆菌bl21(de3)菌株中。
[0031]
(2)蛋白质的表达与纯化：挑取平板上的单菌落至含10μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、150rmp过夜培养，随后将过夜培养的菌液按1/100(v/v)的比例转接至新鲜的200ml含10μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、150rpm培养2～3h至菌液od＝0.4～0.6；在上述菌液中分别加入终浓度为0.5mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，30℃、150rpm培养12h。4,000rpm离心10min收集上述菌体，加入24ml细胞裂解液(20mm tris-cl，500mm nacl，ph＝7.0)充分重悬菌体沉淀，再加入终浓度为300μg/ml的溶菌酶，37℃，100rpm孵育30min；向上述溶液中加入240μl 10
×
蛋白酶抑制剂，于-80℃反复冻融3次；进一步加入24ml平衡缓冲液(20mm tris-cl，500mm nacl，10mm咪唑，ph＝7.0)，240μl 10
×
蛋白酶抑制剂和80μl 1m tcep，混匀后，使用功率为120w的超声波破碎仪破碎细胞，每次以超声1s，停1s的频率破碎4min，重复3次，总计12min，直至溶液变澄清；上述溶液20,000g，4℃离心15min，吸取上清通过0.22μm的针头式过滤器过滤后加至镍亲和层析柱，待溶液全部流出后，使用100ml的40mm咪唑缓冲液(20mm tris-cl，500mm nacl，40mm咪唑，ph＝7.0)对镍柱进行洗涤，最后使用15ml的500mm咪唑缓冲液(20mm tris-cl，500mm nacl，500mm咪唑，ph＝8.5)洗脱目的蛋白，并通过离心式脱盐柱脱盐，所得融合有snap-tag的片段化萤光素酶大、小亚基分别保存于-80℃冰箱中待用。
[0032]
(3)单链dna与蛋白质的偶联：
[0033]
(3-1)dna探针的活化：0.7mm氨基修饰的probe1和probe2 dna探针分别与6mm bg-gla-nhs混合后，室温下避光颠倒孵育过夜；将3m naac(ph＝5.3)按体积比为1/10加入上述过夜反应的溶液中，同时加入2倍体积预冷的异丙醇，轻柔地混匀后放置于-20℃孵育1h；16,500rpm离心15min收集上述溶液的dna沉淀，弃上清，加入1ml预冷的75％(v/v)乙醇，16,500rpm离心15min洗涤dna沉淀3次；所得dna沉淀置于37℃烘干1h，最后用300μl pbs重悬dna沉淀，所得活化dna探针保存于-80℃冰箱中备用。
[0034]
(3-2)将融合有snap-tag的片段化萤光素酶大亚基与活化后的probe1混合(两者均为7.5μm)，并将融合有snap-tag的片段化萤光素酶小亚基与活化后的probe2混合(两者均为7.5μm)，上述溶液于室温反应1.5小时后，加入到镍亲和磁珠溶液中，室温颠倒孵育1h，然后通过磁力架进行磁分离并弃上清；所得磁球沉淀用800μl 10mm咪唑缓冲液(20mm tris-cl，500mm nacl，10mm咪唑，ph＝7.0)洗涤磁珠4次，并，加入1.2ml 500mm咪唑缓冲液洗脱产物；上述产物经离心式脱盐柱脱盐后，加到离心式阴离子交换柱上，并于4℃，2000g离心5min；使用400μl洗涤缓冲液(20mm tris-hcl，200mm nacl，ph＝6.8)反复洗涤脱盐柱
膜3次后，使用300μl洗脱缓冲液(20mm tris-hcl，1m nacl，ph＝8.0)洗脱交联产物；最后，所得产物通过离心式脱盐柱脱盐，并保存于-80℃冰箱中待用。
[0035]
(4)核酸传感体系的构建：将50nm片段化萤光素酶大亚基-dna嵌合体、200nm片段化萤光素酶小亚基-dna嵌合体、30nm单链dna模板加入到50μl反应缓冲液(20mm tris-hcl，200mm nacl，1mm tcep，0.1mg/ml bsa，ph＝7.0)中，于室温孵育10分钟；向上述溶液中加入萤光素酶底物后，使用光谱仪(日立f-7100)进行检测，检测时关闭光谱仪光源，检测波长范围：400～600nm，结果如图1所示，样品可产生明显的发光信号。图2为本发明实施例1中片段化萤光素酶-dna嵌合体互补发光所产生的光谱图。
[0036]
实施例2：基于智能手机的mir-21检测；本实施例中，以mir-21标志物作为检测对象，其核苷酸序列如seq id no.8所示，检测方法如下：
[0037]
(1)mir-21检测探针的设计：根据mir-21序列设计、合成单链dna探针，其核苷酸序列如seq id no.9所示。
[0038]
(2)mir-21的扩增：将待检测的mir-21与10nm单链dna探针、1
×
t4 dna连接酶缓冲液、1mm二硫苏糖醇、2u/μl rnase inhibitor、0.25u/μl t4 dna连接酶混合，并于22℃反应2小时；向上述连接产物中加入0.2mm dntps、1mm dtt、0.3u/μl phi-29dna聚合酶、1.2u/μl rnase inhibitor，于30℃反应2小时，完成扩增反应。
[0039]
(3)片段化萤光素酶-dna嵌合体的重组：将10μl上述反应产物与50nm片段化萤光素酶大亚基-dna嵌合体、200nm片段化萤光素酶小亚基-dna嵌合体混合于50μl反应缓冲液(20mm tris-hcl，200mm nacl，1mm tcep，0.1mg/ml bsa，ph＝7.0)中，并在室温下孵育10分钟。
[0040]
(4)智能手机检测：将上述溶液转移至白色96孔板中，在加入50μl萤光素酶底物溶液后置于暗盒，并通过智能手机(oppo k1)进行拍摄；拍摄条件为：白平衡：2000k；曝光补偿：-2.00；感光度：3200；曝光时间：16s；对焦：0.7。
[0041]
(5)结果分析：拍摄所得照片通过image j软件进行分析；首先，通过矩形工具框截取图片中所有检测孔(发光区)；再通过圆形选择工具截取每个样品孔对应的检测区，点击“plugins”，选择子菜单“analyze”中的“rgb measure”，并读取每个样品孔中blue信号的强度值，从而获得mir-21的浓度与萤光素酶互补发光信号的变化关系；如图3所示，mir-21检测限为：11.2am。
[0042]
实施例3：基于智能手机的mir-148b检测；本实施例中，以mir-148b标志物作为检测对象，其核苷酸序列如seq id no.10所示。检测方法如下：
[0043]
(1)mir-148b检测探针的设计：根据mir-148b序列设计、合成单链dna探针，其核苷酸序列如seq id no.11所示。
[0044]
(2)mir-148b的检测：将待检测的mir-148b与10nm上述单链dna探针混合，后续检测方法与实施例2相同；检测结果如图4所示，mir-148b的检测灵敏度为：15.9am。
[0045]
一种基于片段化萤光素酶-dna嵌合体互补的发光体系检测mirnas的方法，还可以简洁概括为通过将片段化萤光素酶-dna嵌合体系统整合进针对mirnas靶标的滚环扩增体系，可通过智能手机实现不同mirnas标志物的高灵敏度、高特异性的检测，其步骤至少包括：
[0046]
(1)、mirnas靶标的滚环扩增：设计融合有靶标mirnas识别序列和片段化萤光素
酶-dna嵌合体识别序列的单链dna探针，并以mirnas为指导，实现探针的连接及滚环扩增；
[0047]
(2)、基于智能手机的检测：向上述扩增产物中加入萤光素酶大亚基-dna嵌合体和萤光素酶小亚基-dna嵌合体，经过室温孵育后，进一步加入萤光素酶底物，最终通过智能手机对发光检测信号进行读取和分析。