一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用与流程

一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa引物、试剂盒及其检测方法与应用
技术领域
[0001]
本发明涉及一种我国植物检疫性病害的检测技术，特别涉及一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa引物、试剂盒及其检测方法与应用。


背景技术：

[0002]
柑橘黄龙病(huanglongbing)是一种世界性的毁灭性病害，具有暴发性强，发展迅猛，危害大等特点，被列为我国对内对外的检疫性病害。柑橘黄龙病正在全球柑橘种植区不断扩散蔓延，如亚洲、非洲、美洲等地区。柑橘黄龙病发生流行持续时间长、发病范围广、发病率高，造成我国部分地区柑橘寿命短、产量低、生产成本高，经济损失惨重，严重制约了我国柑橘产业的健康发展。2017年我国南方柑橘生产10省(区)柑橘黄龙病发生面积16万公顷，广东省柑橘面积因黄龙病从25万公顷缩减到22万公顷，江西赣南地区的脐橙从近10万公顷剧减至5万公顷。
[0003]
目前，柑橘黄龙病普遍认为是由局限于韧皮部的候选韧皮部杆菌(candidatus liberibacter spp)侵染引起，但至今未获得一致认可的纯培养。根据病原的热敏性、传播媒介、保守序列特征等可以将其分为3个种，包括：亚洲种(candidatusliberibacter asiaticus)、非洲种(candidatus liberibacter africanus)和美洲种(candidatus liberibacter americanus)。国内学者对柑橘黄龙病原的16s rdna同源性分析表明，侵染我国柑橘的黄龙病菌均为亚洲种，序列测定与多重比对结果也表明在不同的地域病原菌没有发现较大的分子变异。
[0004]
柑橘带病苗木、带菌接穗和田间病株是黄龙病的初侵染源。农业生产中，防控柑橘黄龙病等毁灭性病害最根本的措施之一是培育、种植无病苗木，供新区和无病区的新果园种植。自20世纪70年代柑橘茎尖嫁接脱毒研究成功后，美国、西班牙、巴西、中国等国已相继建立了各自的柑橘无病毒繁育体系。目前国内外已建立和发展了常规pcr、巢式pcr、半巢式pcr、荧光定量pcr等技术来检测柑橘黄龙病菌，不断地提高了检测的灵敏度和准确率。目前的pcr检测主要针对扩增柑橘黄龙病菌16s rdna、23s rdna、16s-23s rrna its、omp基因、β-operon基因、rnr基因等。
[0005]
目前已建立的常规pcr、巢式pcr、荧光定量pcr等柑橘黄龙病病原检测技术，虽然不断地提高了检测的灵敏度和准确率，但是检测时间依然比较费时，荧光定量pcr由于昂贵的试验设备和试剂耗材，检测费用依然居高不下。目前测算常规pcr、巢式pcr、荧光定量pcr检测黄龙病菌单个样品的价格在100～200元之间，检测时间在3～5小时之间。常规pcr虽然检测费用较低，但检测灵敏度较低，适合田间已发病植株的检测确认。巢式pcr检测灵敏度是普通pcr的100倍，由于需要两次pcr，操作比较繁琐费时。荧光定量pcr检测灵敏度是巢式pcr的10倍，由于其高灵敏度，推动了柑橘黄龙病的早期诊断及预防控制，尤其是种苗的检测，但是荧光定量pcr的假阳性问题比较突出，操作精度要求比较高，市县级基层科研单位难以推广应用。目前开发一种高效、精准、低成本、操作简便的黄龙病病原检测技术，依然是
我国基层科研单位、广大柑橘种植企业、柑橘育苗企业的迫切需求。
[0006]
重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)是2006年首次报道的一种新的核酸等温扩增技术。rpa技术在25℃～42℃范围内的等温条件下，重组酶与引物dna紧密结合形成酶和引物的聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全互补的序列时，在单链dna结合蛋白ssb的作用下，使模板dna解链，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链。目前rpa技术在医学病原物的快速诊断中得到了一些应用，在植物病原物的检测方面有一些报道，但目前尚未有rpa技术在柑橘黄龙病病原检测方面的报道。


技术实现要素：

[0007]
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa引物。
[0008]
本发明的另一目的在于提供一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa检测试剂盒。
[0009]
本发明的另一目的在于提供上述快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa引物或rpa检测试剂盒的应用。
[0010]
本发明的再一目的在于提供一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa检测方法。
[0011]
本发明研发一种用于检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa引物及其检测方法，可为我国柑橘无病种苗的黄龙病早期检测、田间疑似黄龙病树的检测确诊、普及基层科研单位的检测能力提供有力的技术支持，从而推动我国柑橘无病种苗繁育的健康发展、提早预警广大柑橘产区柑橘黄龙病的传播扩散，进而促进我国柑橘产业的可持续发展。
[0012]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0013]
本发明提供一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa引物，该rpa引物是基于柑橘黄龙病亚洲种(genbank序列登录号：ay192576.1)16s rdna保守序列设计的特异性引物，其核苷酸序列为：
[0014]
hlbas-f：5'-ctttaatactggttgtctagagtttaggagag-3'，
[0015]
hlbas-r：5'-gaaaagaaaataccatctctgatatcgtcctata-3'。
[0016]
一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa检测试剂盒，含有上述rpa引物。
[0017]
所述rpa检测试剂盒还含有植物总rna提取试剂盒、rpa扩增反应试剂、阴性对照、阳性对照。
[0018]
所述阳性对照为从黄龙病阳性柑橘植株上叶片组织提取的基因组dna，所述阴性对照为从健康柑橘植株叶片组织提取的基因组dna。
[0019]
所述的快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa引物在柑橘黄龙病亚洲种检测中的应用。
[0020]
所述的快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa检测试剂盒在柑橘黄龙病亚洲种检测中的应用。
[0021]
一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa检测方法，包括如下步骤：
[0022]
(1)提取待测样品基因组dna；
[0023]
(2)利用待测样品基因组dna进行rpa反应，所用的引物为上述rpa引物；
[0024]
(3)rpa反应完成后对反应产物进行检测；若扩增得到得到目标条带，则为阳性，即感病；若未扩增到任何条带，则为阴性，即健康。
[0025]
步骤(2)中，rpa反应的反应体系包括：在反应体系中的终浓度为0.3～0.5μmol
·
l-1
的hlbas-f/hlbas-r，样品基因组dna、rpa扩增反应试剂；
[0026]
优选的，所述的hlbas-f/hlbas-r在反应体系中的终浓度为0.4μmol
·
l-1
。
[0027]
步骤(2)中，rpa反应的反应条件为37～43℃反应30～60min；
[0028]
优选的，所述的rpa反应的反应条件为40℃反应40min；
[0029]
步骤(3)中，rpa反应完成后对反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
[0030]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0031]
(1)本发明基于柑橘黄龙病亚洲种保守序列16s rdna开发的rpa扩增引物hlbas-f/hlbas-r，首次建立了一种用于检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa检测方法。
[0032]
(2)本发明能够特异性检测柑橘黄龙病亚洲种(candidatus liberibacter asiaticus)，有效排除假阳性的干扰。用于rpa扩增的引物由30～35个核苷酸组成，而用于普通pcr、巢式pcr、荧光定量pcr引物长度通常为20个左右的核苷酸，rpa较长的引物与模板序列严格互补，大大提高了rpa扩增的特异性，极大减少假阳性的概率。
[0033]
(3)本发明检测耗时较短，经济适用，无需pcr仪、荧光定量pcr仪等昂贵仪器设备，适合基层科研单位、柑橘种植企业、柑橘种苗繁育基地的迫切需求，rpa检测方法最短30min就可以扩增出目的片段，而常规pcr检测鉴定方法最短需要3～5小时。克服了常规pcr专业性强及需要昂贵的专用仪器设备等局限性，从而达到实际生产中对植物病害鉴定快速、准确的要求。
[0034]
(4)本发明简单易学，具有分子生物学基础知识的科研人员，基于本说明书即可进行柑橘黄龙病检测。本发明的方法只需要恒温水浴锅、金属浴或者稳定热源的设备就能进行实验，不需要专业的仪器，非专业人员均可操作，鉴定方法适应性强。
附图说明
[0035]
图1是引物hlbas-f/hlbas-r的rpa最佳反应时间试验结果；其中，m：2000bp marker；1：20min；2：30min；3：40min；4：50min；5：60min。
[0036]
图2是引物omp-f1/r1、omp-f2/r2的rpa最佳反应时间试验结果；其中，m：2000bp marker；1：20min；2：30min；3：40min；4：50min；5：60min。
[0037]
图3是引物hlbas-f/hlbas-r的rpa灵敏度分析结果；其中，m：2000bp marker；a为rpa扩增结果；b为普通pcr扩增结果。
[0038]
图4是引物omp-f1/r1、omp-f2/r2的rpa灵敏度分析结果；其中，m：2000bp marker；a为omp-f1/r1；b为omp-f2/r2。
[0039]
图5是疑似病样的rpa和普通pcr检测结果；其中，m：2000bp marker；2-5：疑似病样；1：阴性对照；a为rpa扩增结果；b为普通pcr扩增结果。
具体实施方式
[0040]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0041]
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制
造厂商建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
[0042]
实施例1
[0043]
(一)实验过程
[0044]
(1)样品模板的制备：取供试植物新鲜叶片约0.2g，参照植物基因组dna提取试剂盒(easypure plant genomic dna kit，北京全式金生物技术有限公司)的操作步骤，提取植物总dna，保存于-20℃冰箱，备用。
[0045]
(2)rpa引物设计和筛选：基于柑橘黄龙病亚洲种(candidatus liberibacter asiaticus)(genbank序列登录号：ay192576.1)16s rdna保守序列，参照rpa对引物要求设计引物hlbas-f/hlbas-r；产物长度为397bp。
[0046]
hlbas-f：5'-ctttaatactggttgtctagagtttaggagag-3'，
[0047]
hlbas-r：5'-gaaaagaaaataccatctctgatatcgtcctata-3'。
[0048]
基于柑橘黄龙病亚洲种omp保守序列(genbank序列登录号：ay842429.1)，参照rpa对引物要求设计引物两对：omp-f1/r1、omp-f2/r2；产物长度分别为287bp和200bp。
[0049]
omp-f1：5'-ttcccaaagtatcatctataatacactagataacc-3'，
[0050]
omp-r1：5'-ctatacccttatatgcaaatcccctcagataataa-3'。
[0051]
omp-f2：5'-ggtaaaacagatgtttatagtaaagaacgaatgag-3'，
[0052]
omp-r2：5'-gtagattgaatagaaatattccccactgtataa-3'。
[0053]
(3)rpa扩增反应体系及最佳反应时间：以柑橘黄龙病阳性植株总dna为模板，分别利用本发明设计的柑橘黄龙病亚洲种特异引物hlbas-f/hlbas-r、omp-f1/r1、omp-f2/r2进行rpa扩增。50μl rpa扩增体系：向已装有冻干酶粉的pcr试管中加入rehy-dration buffer 29.5μl、10μmol/l引物hlbas-f/hlbas-r(或omp-f1/r1、omp-f2/r2)各2μl、模板dna 2μl、280mmol/l醋酸镁2.5μl、无rnaase水12μl。反应温度40℃分别温浴20、30、40、50、60min；反应结束后，用dna片段纯化试剂盒(takara minibest dna fragment purifucation kit，宝生物工程(大连)有限公司)对rpa产物进行纯化回收，进一步取纯化后的rpa产物10μl于1.0％琼脂糖凝胶电泳20min，在凝胶成像系统上观察结果，最后根据琼脂糖凝胶电泳结果，确定最佳反应时间。
[0054]
常规pcr扩增：以柑橘黄龙病阳性植株总dna为模板，分别利用本发明设计柑橘黄龙病亚洲种特异引物hlbas-f/hlbas-r、omp-f1/r1、omp-f2/r2进行pcr扩增。50μl pcr扩增体系：模板dna 2μl、rtaq
tm premix 25μl、10μmol/l引物hlbas-f/hlbas-r(或omp-f1/r1、omp-f2/r2)各2μl、灭菌水19μl。反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45sec，54℃退火45sec，72℃延伸45sec，35个循环完成后，72℃延伸10min。取pcr产物在10μl于1.0％琼脂糖凝胶电泳20min，在凝胶成像系统上观察结果。
[0055]
(4)rpa灵敏度分析：经测定提取的柑橘黄龙病阳性植株的总dna浓度为61.8μg/ml，以柑橘黄龙病阳性植株总dna为模板进行稀释，浓度梯度为100、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
六个稀释度，分别进行rpa和普通pcr检测，比较二者的检测灵敏度。rpa反应体系同上述反应体系，然后在温度40℃条件下温浴40min，完成rpa的灵敏度测定实验；常规pcr扩增反应体系和反应程序同上述步骤(3)。
[0056]
(5)rpa技术的应用：从广东省各地采集疑似感染柑橘黄龙病的植物病样4份，提取
总dna，分别以本发明建立的柑橘黄龙病rpa扩增进行检测，并用常规pcr扩增加以验证。
[0057]
(二)实验结果与分析
[0058]
1)rpa扩增反应体系及最佳反应时间：
[0059]
①
以柑橘黄龙病阳性植株总dna为模板，利用本发明设计的引物hlbas-f/hlbas-r进行rpa扩增。根据电泳结果可见(图1)：反应温度40℃，分别水浴20～60min，水浴30min时就可以获得目的条带，而40min中获得目的条带最亮，随着时间延长条带亮度无明显变化。综合琼脂糖凝胶电泳结果，确定40min为最佳反应时间。
[0060]
②
以柑橘黄龙病阳性植株总dna为模板，利用两对omp引物omp-f1/r1、omp-f2/r2分别进行rpa扩增。根据电泳结果可见(图2)：反应温度40℃，分别水浴20～60min，水浴20min时都可以获得目的条带，而30min中获得目的条带较亮，但随着时间延长条带亮度明显模糊。图中左侧引物omp-f1/r1出现了非特异性扩增，图中右侧引物omp-f2/r2在40、50、60min的扩增条带完全不明显。
[0061]
2)rpa灵敏度分析结果：
[0062]
①
以柑橘黄龙病阳性植株总dna为模板进行稀释，浓度梯度为100、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
六个稀释度，采用引物hlbas-f/hlbas-r分别进行rpa和普通pcr扩增，电泳结果显示(图3)，rpa在模板稀释倍数为10-3
时能扩增的目的条带，普通pcr在模板稀释倍数为10-2
时能扩增的目的条带，因此，本发明的rpa检测方法比普通pcr检测方法灵敏度提高10倍。
[0063]
②
以柑橘黄龙病阳性植株总dna为模板进行稀释，浓度梯度为100、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
六个稀释度，分别用两对omp引物omp-f1/r1、omp-f2/r2进行rpa扩增。rpa反应体系同上述反应体系，然后在温度40℃条件下温浴30min，完成rpa的灵敏度测定实验。试验结果(图4)发现两对omp引物出现不稳定扩增的情况，出现大量的dna拖尾，没有扩增出目的条带。
[0064]
综上，基于柑橘黄龙病亚洲种omp设计的两对rpa引物无法用于本发明的检测；基于柑橘黄龙病亚洲种16s rdna设计的rpa引物可用于黄龙病菌的快速检测。
[0065]
3)本发明rpa技术的应用：从广东省各地采集疑似感染柑橘黄龙病的植物病样4份，用所本发明建立的柑橘黄龙病rpa技术进行检测，电泳结果显示(图5)，4份疑似病样品中3份检测为阳性，进一步应用pcr加以验证，其检测结果与rpa结果一致，二者的符合率为100％。这表明，所建立的柑橘黄龙病rpa检测方法能够实现田间疑似病样的快速、准确检测与诊断。
[0066]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。