一株多形拟杆菌GL-02及其与胆汁酸复配的复合菌剂与应用的制作方法

一株多形拟杆菌gl-02及其与胆汁酸复配的复合菌剂与应用
技术领域
[0001]
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株多形拟杆菌gl-02及其与胆汁酸复配的复合菌剂与应用。
技术背景
[0002]
因牛奶富含丰富的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养物质，是适合长期饮用的饮品，所以我国对奶牛的规模化养殖逐年增加。
[0003]
奶牛的泌乳期，奶牛会因为受到孕激素、雌激素等生殖激素或瘦素、神经肽y等调控作用，使机体能量处于负平衡状态，该阶段的奶牛需要通过动员体脂来满足自身所需的能量需要：脂肪组织中会释放出大量的非酯化脂肪酸(nefa)进入到肝脏进行代谢，其中一部分在肝脏中被氧化以供能，还有一部分以甘油三酯形式(tg)重新沉积在肝细胞中，但奶牛肝脏缺乏脂蛋白脂酶和肝脂酶，会限制tg的分解代谢，容易引发脂肪代谢紊乱，同时造成肝脏疾病，而肝脏疾病对奶牛的其他代谢功能、健康程度以及产奶量均会产生不同程度的不利影响。
[0004]
此外，奶牛所产的犊牛为了降低饲养成本，多采用早期断奶法，且前期的奶水均为人工喂养，这也就造成了犊牛早期发育不良的情况发生。因此，为了保障泌乳期奶牛以及奶牛犊牛的健康，开发一种天然、高效、无害的制剂十分必要。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供了一株多形拟杆菌gl-02及其与胆汁酸复配的复合菌剂与应用。所述多形拟杆菌gl-02具有促进营养吸收、提高奶牛健康的作用，其与胆汁酸复配的复合菌剂能够显著提高奶牛产奶量，并促进奶牛犊牛的生长。
[0006]
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0007]
本发明提供了一株多形拟杆菌gl-02，其分类名为多形拟杆菌bacteroides thetaiotaomicron，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.20818。
[0008]
进一步的，所述多形拟杆菌gl-02的菌落呈圆形或类圆形，黄色，直径0.5-2.5mm，表面光滑无光泽，中间微凸，不透明，边缘较整齐。
[0009]
本发明还提供了含有所述的多形拟杆菌gl-02的复合菌剂。
[0010]
进一步的，所述复合菌剂包括：菌含量不少于5
×
108cfu/g的多形拟杆菌gl-02菌粉和胆汁酸。
[0011]
进一步的，所述多形拟杆菌gl-02菌粉和胆汁酸质量比为1∶1-2∶3。
[0012]
本发明还提供了所述的含有多形拟杆菌gl-02的复合菌剂在用于制备泌乳期奶牛养殖的饲料添加剂中的应用。
[0013]
进一步的，所述复合菌剂的使用方法为：将所述复合菌剂以60-80g/天/头奶牛的添加量混合到奶牛的全混合日粮中，一日3次，连续饲喂25-30天。
[0014]
进一步的，所述复合菌剂分别于早、中、晚3次混合到奶牛的全混合日粮中，所述复合菌剂在早上和晚上的添加量是中午的2-3倍。
[0015]
进一步的，所述复合菌剂能够提高奶牛的产奶量和存活率。
[0016]
进一步的，所述复合菌剂能够恢复和提高奶牛的物质代谢和肝脏代谢。
[0017]
本发明还提供了所述的含有多形拟杆菌gl-02的复合菌剂在用于制备奶牛犊牛养殖的饲料添加剂中的应用。
[0018]
进一步的，所述复合菌剂的使用方法为：将所述复合菌剂以6-10g/天/头奶牛的添加量混合到饲喂奶水中，一日3次，连续饲喂28-30天。
[0019]
进一步的，所述复合菌剂能够促进奶牛犊牛的生长。
[0020]
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
[0021]
本发明从猪的粪便中分离出一株多形拟杆菌gl-02，其具有促进奶牛营养吸收、减少奶牛脂肪堆积的作用，该菌不会对动物人体造成伤害，也不会影响环境。本发明还利用多形拟杆菌gl-02制备出菌粉，并与胆汁酸制备成一种新的复合菌剂，该复合菌剂中的胆汁酸具有很好的活性作用，能够清除奶牛体内的有害物质，保护奶牛的肝脏，而多形拟杆菌gl-02能够促进肠道对微量元素和维生素的吸收，并促进胆汁的分泌，两种组分相互配合，因此本发明的复合菌剂不仅能够加快脂肪的分解，显著的增加泌乳期奶牛的产奶量，增加其存活率，恢复并提高奶牛的代谢功能以及物质代谢及肝脏功能，保护奶牛的肝脏，还可以促进奶牛犊牛的生长，提高泌乳期奶牛和犊牛的健康状况，有利于奶牛的养殖和发展。
附图说明
[0022]
图1为多形拟杆菌gl-02在gam琼脂培养基上的菌落图片。
具体实施方式
[0023]
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0024]
实施例1：多形拟杆菌gl-02的筛选和鉴定
[0025]
取10g健康猪粪便和100ml无菌水混匀，过滤去除杂质后制成粪便稀释液，然后继续向稀释液中添加无菌水，制备成10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
稀释液；再分别取10-2
、10-3
、10-4
、10-5
稀释液涂布至gam琼脂培养基中，在含有80％n2、10％co2和10％h2的厌氧环境下，35℃培养48h，选取明显的菌落进行多次纯化后得到单菌落，将得到的单菌落命名为gl-02，冷冻保藏。其中，gam琼脂培养基配方为：10.0g蛋白胨，3.0g大豆胨，10.0g月示胨，13.5g血清消化粉，2.2g牛肉浸粉，5.0g酵母浸粉，1.2g牛肝浸粉，3.0g葡萄糖，3.0g氯化钠，2.5g磷酸二氢钾，5.0g可溶性淀粉，0.3g l-半胱氨酸，0.15g硫乙醇酸钠，15.0g琼脂，1ml 0.1％维生素k1溶液，3ml氯化血红素溶液，100mg卡那霉素，1000ml蒸馏水，ph 7.1。如图1所示，所述菌株gl-02在gam琼脂培养基上的菌落呈圆形或类圆形，黄色，直径0.5-2.5mm，表面光滑无光泽，中间微凸，不透明，边缘较整齐。
[0026]
提取所述菌株gl-02的基因组dna，并以此为模板，使用16s rrna通用引物进行pcr扩增，获得16s rrna扩增序列后测序，然后将该序列进行blast比对，结果显示菌株gl-02与genbank基因库中的多形拟杆菌bacteroides thetaiotaomicron同源性最高，因此判定菌
株gl-02为多形拟杆菌。
[0027]
将筛选到的多形拟杆菌gl-02进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年09月25日；多形拟杆菌bacteroidesthetaiotaomicron的保藏编号为cgmcc no.20818。
[0028]
实施例2：复合菌剂的制备
[0029]
1、胆汁酸的制备
[0030]
所述胆汁酸的制备工艺步骤如下：
[0031]
(1)皂化：将粉碎过40目筛的1kg猪胆粉加入反应釜中，再加入质量浓度为10％的氢氧化钠溶液10l，加热搅拌至沸腾，并保持沸腾状态搅拌14h，然后将反应生成的皂化液冷却至固液分层，去除上清液，剩余固体即为胆汁酸皂化品；
[0032]
(2)脱色：向胆汁酸皂化品中加6l水，加热至80℃使胆汁酸皂化品完全溶解，然后将其打入脱色罐中，加入300ml双氧水搅拌均匀后，常温反应24h，然后将反应溶液过滤至酸化槽中，得到滤液；
[0033]
(3)酸化：将滤液冷却至室温，缓慢加入10％盐酸溶液，边加入边搅拌，待溶液ph值在3时停止加酸，离心过滤得到白色固形物；
[0034]
(4)纯化：将白色固形物不断加水冲洗，将附着在白色固形物表面的水溶性杂质去除，待滤出的水检测呈中性后结束水洗；将离心过滤后的白色固形物放入烘箱中，100℃干燥至水分少于10％，得胆汁酸粗品；
[0035]
(5)重结晶：将胆汁酸粗品投入萃取罐中，加入胆汁酸粗品重量10倍体积的乙酸乙酯搅拌至完全溶解，再加入0.08g无水硫酸钠脱水，过滤收集过滤液，将过滤液进行减压浓缩并回收乙酸乙酯，得到液体胆汁酸；
[0036]
(6)干燥：将液体胆汁酸放入烘箱，在100℃下干燥至水分不超过1％时，得到成品胆汁酸。
[0037]
成品胆汁酸中包含了78.6％的猪胆酸和猪去氧胆酸以及20.0％的鹅去氧胆酸。
[0038]
2、多形拟杆菌gl-02菌粉的制备
[0039]
将保存的多形拟杆菌gl-02挑取至gam液体培养基(在gam琼脂培养基配方上减少琼脂即可)，35℃厌氧环境下活化48h，将得到的活化菌液取1ml再次接种到50ml gam液体培养基中培养24-76h，将培养液10000rpm/min离心5min后，将菌株沉淀物用其质量10-12倍体积的无菌生理盐水重悬，再次10000rpm/min离心5min，使用其质量5倍体积的无菌生理盐水二次重悬，此时要确保重悬液中多形拟杆菌gl-02的菌含量不小于1
×
109cfu/ml；然后选择脱脂牛奶作为保护剂，并利用真空冷冻干燥法制备成多形拟杆菌gl-02菌粉。
[0040]
3、复合菌剂的制备
[0041]
将制得的胆汁酸与多形拟杆菌gl-02菌粉以1∶1的质量比均匀混合，即可得到多形拟杆菌复合菌剂；在使用时，复合菌剂中的菌含量不少于5
×
108cfu/g。
[0042]
实施例3
[0043]
山东某奶牛场养殖奶牛800头，随机选取20头奶牛，其中实验组与对照组各10头奶牛。所选取的奶牛生理状态相似并同处于泌乳期的分娩后30日。实验组：以60克/天/头的添加量将实施例2制备的复合菌剂添加到奶牛的全混合日粮中，并连续饲喂30天，且早上和晚
上的复合菌剂使用量加倍；对照组：连续30天给奶牛饲喂基础全混合日粮；两组奶牛的饲喂管理条件相同，均按照日常养殖管理进行。
[0044]
实验期间记录两组奶牛的临床状况、淘汰情况和挤奶量，结果如表1和表2所示，肉眼可观察到实验组奶牛的临床状况优于对照组，实验组奶牛更有活力，采食更好。此外，在添加过复合菌剂后，奶牛在提高挤奶量期间淘汰率降低10％，因此存活率得到提高，平均每头奶牛的日产奶量提高19.9％，说明本发明的复合菌剂能够显著的提高奶牛的存活率并且促进奶牛产奶。
[0045]
表1奶牛淘汰率和日挤奶量结果
[0046] 实验组对照组实验开始奶牛数量1010实验结束奶牛数量109淘汰率010％实验期间平均日挤奶量(l)18.715.6
[0047]
此外，在实验开始及结束时对每一头牛进行抽血做生化检测，以测定奶牛对蛋白质、碳水化合物、脂肪代谢紊乱以及肝脏病变的比率。结果如表2所示，实验开始前两组奶牛中均有30％-70％的奶牛检测出物质代谢紊乱及肝脏功能障碍的症状，而且在饲喂30天后，对照组中存在物质代谢紊乱的奶牛数量出现增长，可能是因为在产奶量提高期间，由于日粮中能量和蛋白质含量提高，增加了奶牛体内能量负平衡的风险。但使用了本发明复合菌剂的实验组的奶牛存在代谢紊乱和肝脏功能紊乱的状况得到明显的好转，在实验组的奶牛中，只有10-20％的奶牛出现代谢紊乱，且所有的奶牛肝脏功能恢复正常，说明本发明的复合菌剂有利于恢复奶牛产奶期间机体的正常代谢以及改善其肝脏功能。
[0048]
表2奶牛生化检测结果
[0049][0050][0051]
综上所述，本发明的复合菌剂能够显著的增加泌乳期奶牛的产奶量，增加其存活率，恢复并提高奶牛的代谢功能以及物质代谢及肝脏功能，并可以保护奶牛的肝脏，提高奶牛的健康状况。
[0052]
实施例4
[0053]
在山东某奶牛场中选取20头一个月大且体重低于平均值、并处于肠胃及呼吸道病变后健康恢复期的奶牛犊牛。分为实验组和对照组，每组10头，两组中饲喂和管理标准相同，实验组在犊牛的饮用奶水中以6-10g/日/头的添加量加入实施例2制备的复合菌剂，对照组则饲喂普通奶水，持续饲喂30日。
[0054]
对每组中的奶牛犊牛进行每日观察，在实验结束后对犊牛称重并记录增重量。结果如表3所示，在实验期间，实验组犊牛的生长情况肉眼可见的优于对照组，其更具活力，采食更佳。实验组犊牛的实验后体重较对照组更高，且平均日增重较对照组增长了23.4％，说明本发明的复合菌剂能够显著的促进奶牛犊牛的生长，其能够通过改善和提高犊牛肠道、肝脏及代谢功能，并且促进犊牛对蛋白质、微量元素、矿物质、胆固醇等营养物质的吸收，进而促进犊牛的生长以及健康状况。
[0055]
表3奶牛犊体重增长情况
[0056] 实验组对照组实验前单头犊牛平均重量(kg)54.2
±
2.6354.4
±
2.54实验后单头犊牛平均重量(kg)79.2
±
1.4574.6
±
1.78单头犊牛平均增重量(kg)25.0
±
0.5720.2
±
0.63平均日增重(g)833
±
0.18673
±
0.21
[0057]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。