重组腺相关病毒AAV-gas6及应用的制作方法

本发明涉及重组腺相关病毒技术领域，具体涉及重组腺相关病毒aav-gas6及其制备方法和应用。

背景技术：

病毒性脑炎具有较高的致死率和致残率，是人类生命健康的重大威胁之一。在亚洲地区，日本脑炎病毒(japaneseencephalitisvirus，jev)即流行性乙型脑炎病毒，是引起病毒性脑炎的主要病原体之一。1935年该病毒由日本学者首次从死亡患者脑组织中分离得到，故命名为日本脑炎病毒。jev属于黄病毒科黄病毒属单股正链rna病毒，主要由携带病毒的三带喙库蚊通过叮咬人类而传播jev引起的脑炎在我国称为流行性乙型脑炎或者日本脑炎(japaneseencephalitis，je)，为自然疫源性疾病。

经过各国学者的多年努力，目前对jev的认识逐渐深入，而且在jev防控方面也取得了很多进展，尤其是jev疫苗的成功开发和使用极大地降低了je的发病率。然而，由于自然社会环境的变迁和疫苗接种顺从性差异等原因，在一些地区仍会出现jev局部爆发流行和散在感染。世界范围内每年仍有6～7万个jev感染患者。我国也是je的主要流行区域。目前，针对je患者的治疗尚无特异有效的手段，临床病例的死亡率可达10～15％。je幸存者中约有30～50％伴有神经精神后遗症，给患者及家庭带来了沉重的负担。jev具有较高的致死率和致残率，是我国重要的公共卫生问题之一。

技术实现要素：

为了在临床治疗中有效利用gas6分子干预jev引起的脑炎进展，本发明提供了一种重组腺相关病毒aav-gas6。

本发明采用的技术方案如下：

重组腺相关病毒aav-gas6，含有seqidno：1所示的核酸序列。

进一步的，所述重组腺相关病毒aav-gas6的制备方法包括如下步骤：

s1、使用bglⅱ和xhoⅰ内切酶处理paav-mcs载体，然后将所回收片段与同样用bglⅱ和xhoⅰ双酶切的seqidno：1所示的核酸序列连接，得到重组aav-gas6质粒；

s2、用s1制备的重组aav-gas6质粒和辅助载体质粒paav-rc、phelper共同转染腺相关病毒包装细胞，得到重组腺相关病毒aav-gas6。

进一步的，seqidno：1所示的核酸序列的获得方法如下：

对小鼠的组织提取总rna，逆转录为cdna后，设计合成gas6基因编码区上、下游引物，并引入限制性内切酶酶切位点bglⅱ和xhoⅰ，pcr扩增得到小鼠gas6表达基因，即seqidno：1所示的核酸序列；

所述上游引物如seqidno：2所示，所述下游引物如seqidno：3所示。

更进一步的，所述腺相关病毒包装细胞为aav-293细胞。

本发明还提供了所述重组腺相关病毒aav-gas6在制备治疗或缓解jev引起的病毒性脑炎的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明发现jev感染小鼠模型并入侵中枢神经系统后，脑组织生长停滞特异性蛋白6(growtharrestspecificgene6，gas6)的表达水平明显下降，且在症状严重的小鼠中，gas6下降程度更明显。在中枢神经系统中，gas6主要是由神经元及脑微血管内皮细胞等产生，gas6可通过与其受体(axl及mertk等)结合，增强血脑屏障的完整性，抑制脑组织炎症损伤。gas6被证实在抑制炎症损伤、维持中枢神经系统稳态中具有重要作用。补充脑组织gas6水平，有利于明确脑组织gas6在jev感染致脑炎发生发展中的作用。以aav-gas6侧脑室注射实验脑组织gas6过表达具有简易，且高效等巨大优势。

2、本发明的aav-gas6仅需要一次侧脑室注射，可实现脑组织gas6较长时间的稳定表达，对于研究gas6在各种脑组织疾病中的作用具有重要的意义。

附图说明

图1为aav-gas6包装系统，细胞培养上清，稀释至10^-2、10^-3、10^-4的浓缩病毒液及离心上清分别感染293细胞48h后，细胞中gas6表达水平。

图2为aav-gas6侧脑室注射后第1，2，3周脑组织gas6水平变化。

图3为aav-gas6或aav-gfp侧脑室注射后第4周，各组小鼠进行不同剂量足底注射jev攻毒实验后且存活情况，图中，a为10⁷pfu剂量，b为2×10⁷pfu剂量，c为3×10⁷pfu剂量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

重组腺相关病毒aav-gas6的构建

1.确定小鼠gas6基因序列的cds区；

2.对小鼠的脑组织提取总rna，逆转录为cdna作为模板dna，设计合成gas6基因编码区上、下游引物(如seqidno：2-3所示)，并引入限制性内切酶酶切位点bglⅱ和xhoⅰ，pcr扩增得到小鼠gas6表达基因，即seqidno：1所示的核酸序列；

pcr扩增体系为：模板dna1μl，上游引物：1μl，下游引物r：1μl，dntp：2μl，q5超保真dna聚合酶：0.5μl，buffer：2μl，ddh2o：12.5μl；

扩增程序为：98℃30s；98℃10s，63℃15s，72℃60s，共30个循环；72℃2min；4℃hold。pcr产物行1％核酸电泳，胶回收目的条带。

将含有bglⅱ和xhoⅰ粘性末端的gas6基因片段连接进入bglⅱ和xhoⅰ内切酶处理的线性化的paav-mcs载体(购自优宝生物)，通过质粒转化，单克隆测序及比对，得到重组的aav-gas6质粒。

3.将paav-gas6和辅助载体质粒paav-rc、phelper共同转染aav-293细胞。细胞采用10％-fbsdmem进行培养。当细胞密度达80％左右进行质粒转染。转染前，弃去旧培养基，加入双无dmem8ml/瓶预处理。转染体系(每个t75培养瓶)：paav-gas6orpaav-gfp，10μg；paav-rc10μg,；phelper20μg。将上述质粒加入1mldmem中，混匀；将120μl转染试剂max加入1mldmem内，混匀。静置5min后，将上述两种试剂充分混合，室温静置25min后加入预处理的aav-293细胞。将细胞置于孵箱孵育6h后，弃去培养基，加入10ml完全培养基继续培养。转染后66h左右，将细胞吹散脱落，收集细胞悬液。细胞悬液离心(1000g；10min)分别收集离心上清和细胞沉淀。

4.重组aav纯化浓缩将上述收集的上清进行超高速离心(160000g，4h，4℃)，收集细胞沉淀，并以200μlpbs重悬。采用15ml细胞裂解液(150mmnacl，20mmtris，ph8.0)重悬细胞沉淀并充分冻(液氮)融(37℃水浴)3次，以充分裂解细胞。将重悬液和裂解液混合并加入15μl1mmgcl2和15μl全能核酸酶(25ku/ml)，充分混匀。37℃水浴15min以解离冻融过程中形成的dna和蛋白质凝集团块。将上述裂解液置于预冷的匀浆器中充分匀浆，裂解细胞悬液。将匀浆后悬液离心(5500g，20min，4℃)，收集上清进行密度梯度离心。配置并从底部依次加入不同浓度的离心试剂(病毒悬液，17％，25％，40％，和60％碘克沙醇溶液)。以40000g，16℃进行超高速离心90min。取出离心管，灯光从底部照射离心管，于40％溶液梯度处见到白色团雾状聚集物。收集此处的液体并等体积加入1×pbs进行重悬。将重悬液加入100k浓缩柱，离心(3500g，30min，4℃)浓缩并再次加入10mlpbs进行离心洗涤，重复两遍，最终浓缩得到200μl病毒液，0.22μm过滤除菌后于-80℃冻存备用。

实施例2

重组腺相关病毒aav-gas6侧脑室注射及病毒攻毒验证

1、制备的aav-gas6病毒，体外细胞感染实验验证后，用于侧脑室注射。

2、小鼠3-4周龄，采用立体定位仪和微量注射仪，注射位点：bregma位点后0.6mm，中线旁1.2mm，硬脑膜下2.3mm，采用微量注射剂注射体积4μl(实验组aav-gas6，对照组aav-gfp)，缓慢注射，约5min/次。在注射后第1，2，3周，分别收集各组脑组织gas6进行检测脑组织gas6表达变化。在侧脑室注射后第4周，分别以不同病毒剂量进行足底注射jev攻毒实验，并记录各组小鼠的存活率情况。

结果如图1-3所示，aav-gas6侧脑室注射后能明显增加小鼠对jev感染的抵抗，与对照组相比，实验组的小鼠存活率显著提高，证明aav-gas6能够治疗或缓解jev引起的病毒性脑炎。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>中国人民解放军空军军医大学

<120>重组腺相关病毒aav-gas6及其制备方法和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2022

<212>dna

<213>小鼠

<400>1

atgccgccaccgcccgggcccgccgccgccctgggcactgcgcttctgctgctcctgctg60

gcttccgagtcttctcacactgtgctgttgcgggcgcgtgaggcggcgcagtttctgcgg120

cccaggcagcgccgcgcctaccaagtcttcgaggaggccaagcagggccacctggaacgg180

gagtgcgtggaggaggtgtgcagcaaagaggaggccagagaggtgttcgagaacgacccc240

gagacggagtatttctatccacgatatcaagagtgcatgagaaaatatggcaggcctgaa300

gaaaaaaacccagatttcgccaaatgtgttcagaacttgcctgaccagtgcaccccaaac360

ccttgtgataagaagggtactcatatctgccaagacctcatgggcaacttcttctgcgtg420

tgcacagatggctggggaggccggctctgtgacaaagatgtcaatgagtgtgtccagaag480

aatgggggctgcagccaggtctgccacaacaaaccaggaagcttccaatgtgcctgccat540

agtggcttctcgcttgcatcagacggccagacctgccaagatatcgatgaatgcacagac600

tcagacacctgtggggacgcgcgatgcaagaacttgccaggctcctactcttgcctctgc660

gatgagggatatacatacagctccaaggagaagacctgccaagatgtggacgagtgccag720

caggatcgctgtgagcagacctgtgtcaactccccaggcagctatacctgccactgtgat780

gggcgagggggcctaaaactatccccagacatggatacttgtgaggacatcttaccatgt840

gtgcccttcagcatggccaagagcgtgaagtccttgtacctgggccgcatgttcagcggg900

acccccgtgattagactacgcttcaagaggcttcagcctaccaggctgctggctgaattt960

gacttccgcacttttgaccctgaaggagtcctcttcttcgctggaggccgttcagacagc1020

acctggattgtcctgggcctaagagctgggcggcttgagctgcagcttcggtacaatggc1080

gttgggcgcatcaccagcagcgggccaaccatcaaccacggcatgtggcaaactatctcc1140

gtggaagagctggaacgtaaccttgtcatcaaggtcaacaaagatgctgtaatgaagatc1200

gcggtagctggggagctgtttcagctggagaggggcctctatcacctgaatctcaccgtg1260

ggcggcattcccttcaaggagagtgagctcgtccagccgattaaccctcgcctggatggg1320

tgcatgaggagttggaactggctgaacggggaagacagcgccatccaggagacagtcaag1380

gcaaacacaaaaatgcagtgcttctctgtgacagaaaggggctccttcttcccggggaat1440

ggatttgctacctacaggctcaactacacccgaacatcgctggatgtcggcacggaaacc1500

acctgggaagttaaagttgtggctcggatccgccctgccacggacacgggggtgctgctg1560

gcgctggtgggggacgacgatgtcgtcatctctgtggccctagtcgactaccactctaca1620

aagaagctcaagaagcagttggtggtcctggcagttgaggatgttgccctggcactgatg1680

gaaatcaaggtgtgcgacagccaggaacacacggtcactgtctccctgcgggagggtgag1740

gccaccctagaagtggatggcacaaagggccagagtgaagtgagcactgcccagctgcag1800

gagcgactggacacacttaagacacatctgcaaggctctgtgcacacctatgttggaggc1860

ctgccagaagtatcggtgatttctgcacccgtcactgcgttctaccgcggatgcatgact1920

ctggaggtaaacgggaaaatcctggacctggatacggcctcgtacaagcacagtgacatc1980

acctcccactcctgcccgcctgtggagcatgccaccccctag2022

<210>2

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gacgcagatctctcgccatgccgccaccgcccgggccc38

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gacgcctcgaggggggtggcatgctccacaggcgggcag39。