一种化学修饰的高稳定性RNA及试剂盒和方法与流程
本发明涉及一种高稳定性rna，具体涉及一种化学修饰的高稳定性rna及试剂盒和方法。
背景技术：
核酸检测是诊断传染病、遗传病和肿瘤等疾病的重要手段，如新冠病毒的检测和诊断。covid-19的早期诊断对于预防和控制这种全球性流行病至关重要。
实时逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)通常被认为是诊断covid-19的最有效策略。但是，最近的研究发现，由于大量的假阴性结果(大约40％)，当前的rt-pcr试剂盒提供的结果并不令人满意。假阴性结果极为危险，可能会在covid-19预防和流行控制中引起许多问题。由于这种病原体具有极强的传染性和致命性，因此具有假阴性结果的人很容易感染周围的其他人，从而导致病毒的广泛传播，并对人口造成严重影响。假阴性结果通常是由样品收集、运输、存储和/或处理不当引起的，而不是检测试剂盒本身。但是，有问题的rt-pcr试剂盒，例如对照不适当且逆转录失败的试剂盒，也可能会导致假阴性。
rt-pcr是基础研究和疾病诊断中使用最广泛的rna检测方法之一，它分为两个步骤：(1)逆转录；和(2)定量实时聚合酶链反应。尽管它实际上可以像检测dna一样快速和灵敏地检测rna，但rna容易受到rnase降解的影响，从而导致其固有的不稳定性(j.houseley,d.tollervey,themanypathwaysofrnadegradation,cell136(4)(2009)763-76)。更糟糕的是，rnase在周围环境中几乎无处不在，很难消除，它们可以迅速降解rna，包括rna样品和rna对照。尽管从理论上讲rna应当是阳性对照，但在商业rt-pcr试剂盒中，dna通常在实践中通常用作阳性对照，以避免rna生物降解并面对短时间内制备大量灭活或重组病毒的挑战。然而，阳性对照dna无法检查和报告逆转录步骤失败的rt-pcr试剂盒，从而在基于rna检测的疾病诊断中造成假阴性结果的高风险，例如，rna的假阴性。因此，对于使用rt-pcr试剂盒检测病毒rna而言，适当的对照至关重要，有任何问题的试剂盒应由阳性对照进行识别和报告。同样，用rt-lamp核酸恒温扩增法(reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification)检测rna也面临着同样的假阴性风险。
rt-pcr检测中若未经严格控制、设计和维护会很容易引起气溶胶和/或表面交叉污染以及信号误检测，增大假阳性的风险。阴性对照旨在监控污染和错误检测，虽然阴性对照经常选择高纯度水，但非特异性rna在理论上是更好的选择，尤其是监测错误检测。但是，当非特异性的rna被选择，除了稳定性要求，排他性(或排他的特异性)是阴性对照的关键。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种化学修饰的高稳定性rna及试剂盒和方法，解决了现有rt-pcr检测采用dna作为对照易造成假阴性结果的问题，以高稳定性rna作为阳性或阴性对照，避免rt-pcr检测中出现假阴性的结果。
为了达到上述目的，本发明提供了一种化学修饰的高稳定性rna，该高稳定性rna的磷酸酯中的氧原子被s或/和se替代，其结构式如式(1)所示：
式中，x表示s原子或se原子；
优选地，该高稳定性rna是以dna为模板，经转录而获得的。
优选地，该高稳定性rna是以pcovid-19质粒dna为模板，经核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示的引物进行pcr反应，再经转录获得的。
优选地，该高稳定性rna是经化学合成得到的。
本发明的另一目的是提供一种用于检测covid-19的rt-pcr试剂盒，该rt-pcr试剂盒中的阴性和阳性对照至少一个为权利要求1-4中任意一项所述的高稳定性rna。
本发明的另一目的是提供一种所述的高稳定性rna的制备方法，该方法包含：以pcovid-19质粒dna为模板，经过用seqid.no1和seqid.no2所示核苷酸序列为引物，采用的核糖核苷酸的磷酸酯中的氧原子被s或se替代，通过pcr反应和转录获得高稳定性rna。
优选地，所述模板为带有t7启动子的pcovid-19质粒的dna片段。
本发明的另一目的是提供种rt-pcr或rt-lamp检测covid-19的新方法，该方法中的阴性或阳性对照中至少一个为所述的高稳定性rna。
优选地，rt-pcr扩增反应体系包含：10x缓冲液buffer、dntps、正向和反向引物、分子探针、taqdna聚合酶、反转录酶、待测rna核酸和ddh2o；其中，所述正向和反向引物的核苷酸序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示；所述分子探针的核苷酸序列如seqidno.4所示。
优选地，rt-lamp恒温扩增反应体系包含：10x缓冲液buffer、dntps、正向和反向引物、内引物和外引物、bstdna聚合酶、反转录酶、分子探针、待测rna核酸和ddh2o；所述正向和反向引物的核苷酸序列分别如seqidno.20和seqidno.21所示；所述内引物和外引物的核苷酸序列分别如seqidno.22和seqidno.23所示。
本发明的化学修饰的高稳定性rna及试剂盒和方法，解决了现有rt-pcr检测采用dna作为对照易造成假阴性结果的问题，具有以下优点：
现有的商业rt-pcr试剂盒通常采用dna作为阳性对照，增加了假阴性的风险。而且，在rt-pcr检测中以水作为阴性对照，难以监测污染和错误检测。本发明采用高稳定性rna作为阳性或阴性对照，该高稳定性rna为磷酸硒脂和硫代磷酸酯rna(se-rna和s-rna)，se-rna和s-rna均可作为逆转录的良好模板，不仅具有很好的热稳定性、生物稳定性、抗核酸酶水解稳定性、化学稳定性，还具有分子选择、排他性和特异性，表明它们作为rt-pcr试剂盒的阳性和阴性对照均具有潜力和应用前景。
本发明的高稳定rna也可以在rt-lamp核酸检测上用作为阳性对照，本发明的se-rna、s-rna和se-s-rna是rt-pcr和rt-lamp试剂盒的有效阳性对照，能减少rt-pcr和rt-lamp检测中的假阴性结果。
附图说明
图1为本发明采用商业试剂盒中dna作为阳性对照检测covid-19的结果。
图2为本发明采用商业试剂盒kita不同批次及商业试剂盒kitb的检测covid-19的结果。
图3为本发明图se-rna和s-rna的转录、逆转录及rt-pcr检测结果。
图4为本发明的se-rna、s-rna和se-s-rna和o-rna的热稳定性、生物稳定性和化学稳定性对比结果(图中标注与曲线是自上而下分别对应一一对应的)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1covid-19rna待测模板和引物的制备
1、covid-19rna待测模板
以含有covid-19靶序列的质粒dna(pcovid-19质粒；买自sangon，shanghai，china)通过pcr制备带有t7启动子且含有covid-19靶序列的dna片段。通过t7转录最终获得covid-19rna(序列如seqidno.1所示)。
上述covid-19rna用作rt-pcr的待测模板或待测rna核酸。临床covid-19rna样品也可用作rt-pcr的待测模板。
2、rt-pcr引物和探针
设计正向引物f、反向内部引物b和taqman探针，它们最终通过化学合成得到，具体序列如下：
正向引物f：ggggaacttcctgctagaat(seqidno.2)；
反向内部引物b：gagacattttgctctcaagctg(seqidno.3)；
taqman探针：5’fam-ttgctgctgcttgacagatt(seqidno.4)。
实验例2采用商业试剂盒检测covid-19
1、商业rt-pcr试剂盒的阳性对照
对于covid-19rna的检测，6种商业rt-pcr试剂盒被使用，用于实时rt-pcr检测，根据样品(待测covid-19rna核酸)、阳性对照和阴性对照的数量准备适当量的反应混合物(包括缓冲液、酶、引物和探针，试剂盒中自带)。然后，将移液器模板(5μl)和反应混合物(20μl)移至每个反应管中，再将反应液混合并低速离心，最后进行rt-pcr扩增。
具体地，rt-pcr扩增反应体系为：10x缓冲液buffer、0.2mmdntp(包括datp、dttp、dctp和dgtp)、正向和反向引物各0.2μm、taqdna聚合酶2.5u、反转录酶1u、适量的待测rna核酸，然后补加ddh2o至25μl。样本检测时，同时设置阳性对照和阴性对照(试剂盒中自带)。
具体地，rt-pcr扩增反应过程，为：(1)反转录反应：42℃，5min；95℃，10sec；(2)pcr反应：95℃，5sec；60℃，20sec；重复45个循环。采用荧光pcr仪实时监测反应体系的荧光变化(每个循环采集一次荧光信号)。
2、rnasea消化的阳性对照
将上述6种商业rt-pcr试剂盒的阳性对照dna分别用rnasea消化后作为阳性对照，然后使用相应的rt-pcr试剂盒进行rt-pcr分析。
上述消化过程具体为：在含有20μl阳性对照、17μlrnasea和2μl反应缓冲液(reactionbuffer:100mmtris-hcl、25mmmgcl2、5mmcacl2ph7.6)的反应混合物中进行消化，并在37℃下孵育30分钟。然后在80℃灭活5分钟。
3、dnasei消化的阳性对照
将上述6种商业rt-pcr试剂盒的阳性对照分别用dnasei消化后作为阳性对照，然后使用相应的rt-pcr试剂盒进行rt-pcr分析。
上述消化过程具体为：在含有20μl阳性对照、1μldnasei和2μl反应缓冲液的反应混合物中进行消化，并在37℃下孵育30分钟。然后在80℃灭活5分钟。
4、rt-pcr检测结果对比
如图1所示，为6种商业rt-pcr试剂盒的阳性对照在未作处理以及酶消化处理后rt-pcr结果对比，图中a-f为六种商用rt-pcr试剂盒，每个图中，阳性和阴性对照分别来自相应的试剂盒，其中，曲线1：未消化阳性对照的rt-pcr；曲线2：用rnasea消化的阳性对照的rt-pcr；曲线3：用dnasei消化的阳性对照的rt-pcr；曲线4：阴性对照。由图1可知，这6种商业rt-pcr试剂盒的阳性对照均可以被dnasei消化，同时抵抗rnasea的消化，表明这6种商业rt-pcr试剂盒均采用的阳性对照均为dna。
实验例3商业试剂盒kita检测covid-19rna
采用商业试剂盒kita的批次1(kita，batch-1)对covid-19病毒rna样品(covid-19rna)进行了检测，而其阳性对照dna被用作参考。如图2所示，为商业试剂盒kita不同批次及商业试剂盒kitb的检测结果，每个图中，曲线1：covid-19阳性rna样品1；曲线2：covid-19阳性rna样品2；曲线3：相应试剂盒的阳性对照；曲线4：相应试剂盒的阴性对照。从图中可以看出，尽管dna对照照常报告阳性结果，但商业试剂盒kita的批次1未能报告这些阳性病毒rna样品的阳性结果，表明rt-pcr中的逆转录步骤无效，但dna聚合和pcr反应均正常运行。通过商业试剂盒b证实了这些rna样品的完整性(表1和图2)，实验结果表明，带有dna阳性对照的试剂盒会导致假阴性，存在逆转录失败的问题，表明dna作为阳性对照不是rt-pcr试剂盒的理想策略，使用rna阳性对照可能是更好的选择。
表1为使用商业试剂盒对covid-19rna的假阴性检测结果
注：均经重复了五次，结果是一致的；ct值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；covid-19rna样品1和covid-19rna样品2均为采用实验例1中的方法制备的。
实验例4制备本发明的s-rna和se-rna
为了转录se-rna和s-rna，以pcovid-19质粒为模板进行pcr扩增反应，引物f为：5'-taatacgactcactatagctcttctcgtgtctctcatc-3'(seqidno.5)，引物b为：5'-gcagcagatttcttagtg-3'(seqidno.6)，并把t7启动子引入到产物dna(covid-19的n基因中210bp)。然后，分别使用四个ntpαse(se修饰ntp)，或四个ntpαs(s修饰ntp)，或这两类修饰ntp的混合物(购自纽奥维特sentinall，中国成都)，并用t7rna转录酶来制备se-rna和s-rna。所有四个硒和硫修饰的ntp(ntpαse和ntpαs)都可通过t7rna聚合酶来产生稳定性更高的rna，如下式：
转录后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％page)分析每种产物(1μl)，并用gelred染色由凝胶成像仪显示。
实验例5本发明的s-rna和se-rna逆转录
使用本发明制备的高稳定性rna(实验例4制备的se-rna或s-rna)和mlv逆转录酶进行了逆转录实验，具体如下：
将se-rna或s-rna(终浓度：1μm)、5'-fam标记的引物(1μm)(5’fam-gcagcagatttcttagtg，seqidno.6)、dntp(100μm)、10umlv逆转录酶、2urnase抑制剂和1×rtbuffer，在55℃下孵育60分钟。然后，将反应用尿素饱和的上样缓冲液淬灭，并通过变性page(12％)分析产物。
如图3中a所示(泳道1：dna模板；泳道2：dnasei消化前转录的se-rna；泳道3：dnasei消化后转录的se-rna；泳道4：dnasei消化前转录的s-rna；泳道5：dnasei消化后转录的s-rna)，为se-rna和s-rna转录，表明本发明的se-rna和s-rna稳定性高。
如图3中b所示(泳道1：fam标记的引物；泳道2：以s-rna用作cdna反转录的模板；泳道3：以se-rna用作cdna反转录的模板)，本发明的se-rna和s-rna可以被mlv逆转录酶有效识别，从而产生cdna。而且，如图3中c所示，表明本发明的se-rna和s-rna均可通过rt-pcr扩增和检测。如表2所示，可以看出本发明的se-rna和s-rna的检测限与o-rna(即无修饰的covid-19rna)的检测限相似，这进一步表明本发明的se-rna、s-rna和se-s-rna可作为阳性对照。
表2为标准rna和修饰rna的检测灵敏度
实验例6本发明的s-rna和se-rna的稳定性
稳定性(生物稳定性和热稳定性)是阳性rna对照的最重要属性，将本发明的se-rna、s-rna和se-s-rna与标准rna(o-rna)相比，验证发明的s-rna和se-rna的稳定性，采用的引物组和探针如实验例1所示。
1、热稳定性
在各种温度(55-95℃)下孵育1小时后，o-rna在较高温度下会明显分解，而se-rna几乎没有受到影响，s-rna也保持稳定，本发明的rna在rt-pcr检测和ct值上没有显示出显著的变化，表明本发明的se-rna、s-rna具有出色的热稳定性(参见图4的a-c，a-c分别是se-rna、s-rna和o-rna在室温、55、72和95℃下1小时的热稳定性)，热稳定性顺序为：se-rna>s-rna>>o-rna。
2、生物稳定性
参见图4的d-f(d-f分别是se-rna、s-rna和o-rna经rnase-t1、血清和唾液处理后的生物稳定性)，当用rnaset1(核糖核酸酶t1)、血清和唾液分别处理时，rnaset1、血清和唾液几乎不会影响se-rna和s-rna，生物稳定性顺序为：se-rna>s-rna>>o-rna。
3、化学稳定性
参见图4的g-i图(它们分别描述的是se-rna、s-rna和o-rna在4℃下储存0-30天的化学稳定性)，将本发明的se-rna和s-rna与o-rna在4℃下保存0-30天，表明化学稳定性顺序为：se-rna>s-rna>>o-rna。
实验例7本发明的s-rna和se-rna作为阴性对照
设计8组非特异性引物验证本发明的se-rna、s-rna与o-rna作为阴性对照的排他性，如表3所示，本发明的se-rna、s-rna比标准rna(o-rna)更具排斥性，它们的ct值高于o-rna，表明本发明的se-rna、s-rna作为阴性对照比标准rna更好。因此，本发明的se-rna、s-rna和se-s-rna是rt-pcr试剂盒的有效阴性对照，能减少rt-pcr检测中的假阳性结果。
表3为se-rna和s-rna作为rt-pcr的阴性对照结果
注：ct值≥36表示阴性检测；引物对1为，f:acttgtgctaatgaccctg(seqidno.7)，b:cgcagacggtacagact(seqidno.8)；引物对2为，f:gcggtatgtggaaaggtt(seqidno.9)，b:ctgactgaagcatgggtt(seqidno.10)；引物对3为，f:caacttgtgctaatgaccct(seqidno.11)，b:cgcagacggtacagact(seqidno.8)；引物对4为，f:aaggttatggctgtagttgt(seqidno.12)，b:ctgactgaagcatgggtt(seqidno.10)；引物对5为，f:cgtggtattcttgctagtta(seqidno.13)，b:agtacgcacacaatcgaa(seqidno.14)；引物对6为，f:tagttacactagccatcctt(seqidno.15)，b:aatattgcagcagtacgc(seqidno.16)；引物对7为，f:gttacactagccatccttac(seqidno.17)，b:aatattgcagcagtacgc(seqidno.16)；引物对8为，f:ttcgtggtattcttgctagt(seqidno.18)，b:gcagtacgcacacaatcg(seqidno.19)。
实验例8本发明的rt-lamp检测covid-19
1、引物组
f3(正向内部引物):
gccaaaaggcttctacgca(seqidno.20)；
b3(反向内部引物):
ttgctctcaagctggttcaa(seqidno.21)；
fip(正向外部引物):
tcccctactgctgcctggagcggcagtcaagcctcttc(seqidno.22)；
bip(反向外部引物):
ttctcctgctagaatggctggctctgtcaagcagcagcaaag(seqidno.23)。
2、rt-lamp检测
(1)合成并配置引物混合物：先按照lamp扩增原理并针对待测靶分子进行引物的设计(上述引物组)，再根据引物的设计合成出引物并配置成固定浓度的引物混合物，该引物混合物包括16microm的正向内部引物、16microm的反向内部引物、2microm的正向外部引物和2microm的反向外部引物；
(2)配置混合物：将datp、dctp、dgtp和dttp按规定比例混合；
(3)配置rt-lamp反应体系：将rt-lamp扩增缓冲液、引物混合物、bst2.0dna聚合酶和样本rna配置成rt-lamp反应体系，再补充ddh2o至20μl，并同时设置阳性对照和阴性对照；rt-lamp扩增缓冲液由40mm的tris-hcl、20mm的(nh4)2so4、100mm的kcl、16mm的mgso4、1％的tween20、2.5mm的dntp混合物、1.6m的甜菜碱和2×sybrgreeni或分子探针组成；
(4)反应扩增分析：先将配置好的rt-lamp反应体系放置于荧光恒温仪中，接着在65℃恒温环境下孵育60-120分钟，并实时监测反应体系的荧光变化，然后rt-lamp对待测靶分子进行扩增，最后通过分析得出检测结果，参见表4。
表4为rt-lam检测covid-19的灵敏度
综上所述，本发明的se-rna、s-rna和se-s-rna能够作为rt-pcr和rt-lam检测中的阳性对照或阴性对照，避免了rt-pcr和rt-lam检测中的假阴性和假阳性结果。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110>四川大学
纽奥维特（成都）生物科技有限公司
<120>一种化学修饰的高稳定性rna及试剂盒和方法
<160>23
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