流感病毒NP蛋白的单克隆抗体及其应用

本发明属于医学生物技术领域，尤其涉及针对流感病毒np蛋白的广谱性单克隆抗体。另外地，本发明还涉及使用所述针对流感病毒np蛋白的单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条。

背景技术：

流感病毒是一种能在禽类和多种动物中引起病毒性疾病的病原，并可能对动物和人类健康产生严重影响，其已成为公众日益关注的问题。由于流感病毒的快速变异和能够对动物和人类具有较高的致病性，因此一直以来均迫切需要高效的诊断方法，以便在无症状阶段检测出所有流感病毒亚型，从而实现终止流感病毒循环及其在鸟类、哺乳动物种群中的进化。

目前常用的流感病毒实验室诊断方法包括病毒的分离鉴定、血清学检测和分子生物学检测等方法，但是大多数方法都具有不足之处。例如，病毒的分离鉴定方法耗时长，一般需要3-4天；血凝与血凝抑制试验具有易于操作、结果快速准确等特点，但是每次仅能鉴定单一亚型；逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)方法具有特异性高、敏感性强特点，但其具有影响因素多，需要专业人员操作以及成本较高等缺陷。单克隆抗体的出现和应用为流感病毒的诊断和防控带来了新的技术方法，单克隆抗体具有高度均一、单一生物活性、仅结合某一特定抗原表位、可以长期传代及无限繁殖等特性。现在大多数检测方法中均涉及单克隆抗体的应用，如elisa法和胶体金免疫层析方法等。

胶体金试纸条检测技术成熟且操作简单，但由于流感病毒亚型众多、毒株复杂，而市场流行的检测方法仅是针对个别亚型的检测方式，难以对其他亚型的流感病毒进行检测而造成潜在的流感病毒存在，形成流感病毒周期性的流行。

因而，本研究旨在获得针对流感病毒np蛋白的高效、广谱性单克隆抗体，并使用上述单克隆抗体建立广谱性胶体金免疫层析试纸条，为流感病毒相关蛋白的生物学功能研究和流感的防治和诊断方法提供参考。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供了针对流感病毒np蛋白的广谱性单克隆抗体。另外地，本发明还提供了使用所述针对流感病毒np蛋白的单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条。

为达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：

在第一个方面中，本发明提供了针对流感病毒np蛋白的广谱性单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤3f3产生的单克隆抗体3f3，所述杂交瘤以保藏号cgmccno.21004保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，或者所述单克隆抗体是由杂交瘤10e9产生的单克隆抗体10e9，所述杂交瘤以保藏号cgmccno.21005保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

在一个优选的实施方式中，所述广谱性单克隆抗体对h1-h11亚型的一种或多种具有反应性。

在另一个优选的实施方式中，单克隆抗体3f3和10e9均为igg2a亚型。

在一个更优选的实施方式中，所述单克隆抗体3f3的vh的cdr分别如seqidno：1-6所示，和/或所述单克隆抗体3f3的vl的cdr分别如seqidno：7-12所示。

在另一个更优选的实施方式中，所述单克隆抗体10e9的vh的cdr分别如seqidno：13-18所示，和/或所述单克隆抗体10e9的vl的cdr分别如seqidno：19-24所示。

在一个进一步优选的实施方式中，所述单克隆抗体3f3包含如seqidno：25所示的vh，和/或所述单克隆抗体3f3包含如seqidno：26所示的vl。

在另一个进一步优选的实施方式中，所述单克隆抗体10e9包含如seqidno：27所示的vh，和/或所述单克隆抗体10e9包含如seqidno：28所示的vl。

在第二个方面中，本发明提供了一种用于检测流感病毒的胶体金免疫层析试纸条，所述试纸条对h1-h11亚型的一种或多种具有反应性，所述试纸条包括支持板和放置在其上的样品垫、灌注有金标抗体的偶联垫、含有检测线t和质控线c的硝酸纤维素膜和吸水垫。

在一个优选的实施方式中，所述金标抗体为胶体金标记的单克隆抗体3f3，所述胶体金颗粒直径为18-25nm。

更优选地，所述胶体金颗粒直径为20nm。

在一个进一步优选的实施方式中，所述检测线t由单克隆抗体10e9形成，和/或所述质控线c为羊抗鼠igg。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明制备的针对流感病毒np蛋白的单克隆抗体具有广谱性和高敏感性，其与h1-h11等亚型的流感病毒均具有良好的反应性。

(2)本发明使用针对流感病毒np蛋白的单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条利用免疫层析技术原理实现了对广谱流感病毒的快速检测。与实验室常用的pcr、elisa检测技术相比，该方法更简便、更快捷，不需要专门的人员和检测设备，可以广泛应用于基层。

附图说明

图1：np-1单克隆抗体的westernblot检测。其中，m：marker，1：1g10，2：2f1，3：4a6，4：5c7，5：6b8，6：10d11，7：10e9，8：10h1，9：阳性对照，10：阴性对照。

图2：np-2单克隆抗体的westernblot检测。其中，m：marker，1：3f3，2：4a1，3：6h4，4：9h3，5：阳性对照，6：阴性对照。

图3：10e9、3f3单克隆抗体的广谱性检测。其中，1：hek293t细胞对照，2-6：hek293t细胞中转染分别来自a/wsn/33、a/sichuan/01/2009、a/anhui/2/2005、a/anhui/1/2013、a/chicken/shanghai/1/97的np质粒，7：a549细胞对照，8-9：wsn感染a549细胞4h、8h的样品。

图4：胶体金试纸条的广谱性结果。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

实施例1：针对流感病毒np蛋白的单克隆抗体的制备和鉴定

1.主要实验材料

1.1载体、菌种、病毒、细胞和实验动物

pet-30a表达载体，a/wsn/33(h1n1)、a/sichuan/01/2009、a/anhui/2/2005、a/anhui/1/2013、a/chicken/shanghai/1/97等流感病毒，人肺泡腺癌a549细胞系、人胚胎肾细胞hek293t和骨髓瘤细胞sp2/0细胞系均由发明人实验室保存，bl21大肠杆菌感受态细胞购自天根生化科技有限公司，babl/c小鼠购于北京维通利华实验动物有限公司。

1.2主要试剂

primerstarmaxdna聚合酶购自宝生物公司，反转录酶m-mlv购自(美国)普洛麦格公司，t4dna连接酶和限制性内切酶购于neb公司，lipofectamine^tmltx&plus转染试剂、质粒小量和中量抽提试剂盒购自赛默飞公司，dna凝胶回收试剂盒购自(上海)凯杰公司，病毒总基因组(rna)提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，ha培养基、hat培养基、peg(mw1500)、dmso、弗氏佐剂、新生牛血清、胎牛血清、牛血清白蛋白(bsa)、羊抗鼠igg-hrp抗体均购于西格玛奥德里奇公司，imdm培养基购自hyclone公司，0.25％edta-胰酶和双抗购自gibco公司，免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒购自sba公司，dab显色试剂盒、tmb单组份显色液和4×蛋白上样缓冲液购自solabio公司，proteing亲和层析柱购自ge公司。

1.3主要仪器

pcr基因扩增仪、微量可调移液枪和高速离心机购自艾本德公司，凝胶电泳仪和湿电转膜仪购于bio-rad公司，恒温水浴锅、超净台购于购自赛默飞公司，酶标板购自(美国)康宁公司，电子天平购自赛多利斯公司，摇床购自江苏海门麒麟贝尔仪器制造公司，显微镜购自蔡司公司，二氧化碳细胞培养箱购于纽艾公司，4℃冷柜、-20℃和-80℃冰箱购自海尔公司。

2.主要实验方法

2.1引物设计

根据genbank中流感病毒的np(genbank:lc333186.1)基因序列，用软件oligo7设计四对引物(含酶切位点)，由哈尔滨擎科生物技术公司合成，如表1所示。

表1：构建重组质粒的引物

2.2重组质粒的构建和鉴定

采用常规分子生物学方法提取病毒总rna和合成cdna，并且对np-1和np-2基因进行扩增和鉴定。

2.3重组蛋白np-1和np-2的表达与纯化

2.4抗流感病毒np蛋白单克隆抗体的制备

具体制备步骤包括免疫babl/c小鼠，将骨髓瘤细胞sp2/0与小鼠皮细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞株，冻存阳性杂交瘤细胞株，制备腹水，单克隆抗体的纯化，单克隆抗体的亚类鉴定步骤等。

2.5单克隆抗体的westernblot检测

将重组蛋白经处理后进行sds-spge电泳，通过湿转方法将重组蛋白转移至0.45μm的nc膜，300ma恒流转印60min。使用5％脱脂乳室温封闭1h，单克隆抗体(1:1000)为一抗，dylight800羊抗鼠igg(1:10000)为二抗，进行westernblot检测，同时阳性血清和sp2/0细胞上清分别作为阳性和阴性对照。

2.6单克隆抗体的广谱性检测

将hek293t细胞铺于12孔板，待其生长至汇合度80％-90％，转染分别来自h1(a/wsn/33)、h1(a/sichuan/01/2009)、h5(a/anhui/2/2005)、h7(a/anhui/1/2013)、h9(a/chicken/shanghai/1/97)等流感病毒的np质粒，转染量为1μg，转染时间为24h。将a549细胞铺于12孔板，待其生长至汇合度80％-90％左右，h1(a/wsn/33)病毒以moi＝5感染a549细胞，分别在感染4h、8h后裂解细胞。将转染和感染细胞的样品处理后进行westernblot试验，检测单克隆抗体的广谱性，一抗为制备的单克隆抗体，二抗为dylight800羊抗鼠igg。

3.实验结果

3.1针对流感病毒np蛋白的单克隆抗体的筛选结果

通过建立的间接elisa方法筛选阳性杂交瘤细胞，sp2/0细胞上清为一抗，hrp标记的igg山羊抗鼠为二抗，同时设立阳性和阴性对照(小鼠的阳性血清和阴性血清)。筛选到np的阳性杂交瘤细胞共有12株，命名为1g10、2f1、4a6、5c7、6b8、10d11、10e9、10h1、3f3、4a1、6h4、9h3。

3.2单克隆抗体的westernblot检测

将重组蛋白用loadingbuffer处理后进行westernblot试验，一抗为制备的单克隆抗体，二抗为dylight800羊抗鼠igg。

结果表明，制备的针对流感病毒np蛋白的单克隆抗体1g10、2f1、4a6、5c7、6b8、10d11、10e9、10h1、3f3、4a1、6h4、9h3均能和重组蛋白之间产生特异性反应，如图1和图2所示。其中，1g10、2f1、4a6、5c7、6b8、10d11、10e9、10h1为针对np-1的单克隆抗体，3f3、4a1、6h4、9h3为针对np-2的单克隆抗体。

3.3单克隆抗体的广谱性检测

将转染和感染细胞的样品用loadingbuffer处理后进行westernblot试验，检测单克隆抗体的广谱性，一抗为制备的单克隆抗体，二抗为dylight800羊抗鼠igg。

实验结果表明，如图3所示，在上述针对流感病毒np蛋白的单克隆抗体中，10e9和3f3单克隆抗体具有更好的广谱性。这两种单克隆抗体均为igg2a亚型。因此，选择将这两种单克隆抗体用于进一步的研究。

实施例3：针对流感病毒np蛋白单克隆抗体3f3和10e9的可变区序列测序

1.3f3单克隆抗体

1.1引物设计

表2：扩增抗体可变区用引物

1.2测序结果

vh：

vl：

其中：粗体表示cdr区。

2.10e9单克隆抗体

2.1引物设计

表3：扩增抗体可变区用引物

2.2测序结果

vh：

vl：

其中：粗体表示cdr区。

实施例3：用于检测流感病毒的胶体金免疫层析试纸条

1.主要实验材料

1.1病毒

实验中使用的流感病毒毒株均由发明人实验室保存，如表4所示。

表4：流感病毒毒株

1.2主要试剂和仪器

碳酸钾、聚乙烯吡咯烷酮k30、蔗糖、氯化钠均购于国药集团化学试剂有限公司，牛血清白蛋白(bsa)、tritonx-100、羊抗鼠hrp-igg购自sigma公司，胶体金溶液(20nm)购于湖州英创生物科技有限公司，硝酸纤维素膜购于赛多利斯公司，tween20购天津市光复精细化工研究所，pvc胶板、吸水纸、聚酯纤维膜购于上海金标生物科技有限公司，xyz3050型三维喷点平台和cm4000型切条机购自美国bio-dot公司。

2.胶体金试纸条组装的主要步骤

2.1胶体金标记抗体的方法

(1)取的胶体金溶液20ml，用0.1mol/l的k2co3调节胶体金溶液至最佳ph。

(2)在胶体金溶液中缓慢逐滴加入85μl的3f3单克隆抗体，在避光的条件下，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌1h。

(3)在胶体金溶液中缓慢逐滴加入2ml10％的bsa溶液，缓慢搅拌1h。

(4)将标记好抗体的胶体金溶液转移至新的离心管中，3000rpm、4℃离心15min，轻轻弃掉上清。

(5)用胶体金复溶液恢复离心管中原来的体积，混匀，10000rpm、4℃离心1h。轻轻弃上清，加入1/10的胶体金复溶液，混匀。

2.2胶体金试纸条的组装过程

(1)首先在硝酸纤维素膜上包被浓度为1mg/ml的10e9单克隆抗体，这条线称为检测线t；在距离检测线约0.5cm的位置包被浓度为1mg/ml的羊抗鼠hrp-igg抗体，此为质控线c。将包被好检测线和质控线的硝酸纤维素膜放入37℃温箱，烘干时间为8h。

(2)将pvc胶板表面的纸揭开，暴露出其粘性的一面，按硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫的顺序固定于粘面，即胶体金试纸条组装完毕。

2.3胶体金试纸条结果的判读

阴性：质控c线显色，检测t线不显色；

阳性：质控c线和检测t线均显色；

无效：质控c线不显色，无论检测t线是否显色，则表示检测条失效或操作错误。

2.4胶体金试纸条的广谱性检测

组装胶体金试纸条，滴加h1-h11禽流感病毒的尿囊液，pbs作为阴性对照，用此检测胶体金试纸条的广谱性。

此外，发明人在实验过程中还采用常规方法筛选和确定了胶体金标记抗体的最佳ph、最佳标记量、胶体金试纸条检测线t和质控线t包被抗体的浓度，此外还考察了最佳膜烘干时间、最佳观察时间等，在此不再赘述。

3.胶体金试纸条的广谱性检测结果

按最佳条件组装胶体金试纸条后通过滴加h1-h11禽流感病毒的尿囊液和pbs检测胶体金试纸条的广谱性。结果如图4所示，胶体金试纸条能够检测h1-h11禽流感病毒的尿囊液，且pbs检测结果呈阴性，因此结果表明胶体金试纸条具有良好的广谱性。

综上所述，实验结果表明本发明制备的针对流感病毒np蛋白的单克隆抗体具有广谱性和高敏感性，其与h1-h11等亚型的流感病毒均具有良好的反应性。此外，本发明使用针对流感病毒np蛋白的单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条利用免疫层析技术原理实现了对广谱流感病毒的快速检测。与实验室常用的pcr、elisa检测技术相比，该方法更简便、更快捷，不需要专门的人员和检测设备，可以广泛应用于基层。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120>流感病毒np蛋白的单克隆抗体及其应用

<160>28

<170>patentinversion2.1

<210>1

<211>24

<212>核苷酸序列

<213>人工序列

<400>ggattcactttcagtgactattac

<210>2

<211>24

<212>核苷酸序列

<213>人工序列

<400>attagtaatggtggtggttacacc

<210>3

<211>45

<212>核苷酸序列

<213>人工序列

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<210>4

<211>8

<212>氨基酸

<213>人工序列

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<210>5

<211>8

<212>氨基酸

<213>人工序列

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<210>6

<211>15

<212>氨基酸

<213>人工序列

<400>arypkydydvdamey

<210>7

<211>33

<212>核苷酸序列

<213>人工序列

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<210>8

<211>9

<212>核苷酸序列

<213>人工序列

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<211>27

<212>核苷酸序列

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<210>10

<211>11

<212>氨基酸

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<211>3

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<211>24

<212>核苷酸序列

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<210>14

<211>24

<212>核苷酸序列

<213>人工序列

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<210>15

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<212>核苷酸序列

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<210>16

<211>8

<212>氨基酸

<213>人工序列

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<211>8

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<211>8

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<212>核苷酸序列

<213>人工序列

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<210>26

<211>498

<212>核苷酸序列

<213>人工序列

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<212>核苷酸序列

<213>人工序列

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