一种具有启动子功能的落叶松DNA分子、获取及鉴定方法与流程

本发明涉及生物技术，特别涉及一种具有启动子功能的落叶松dna分子、获取及鉴定方法。

背景技术：

落叶松具有众多优良特征，如适应性广，易于栽培，成林快，材质优良等。落叶松已经成为北方地区退耕还林和荒山绿化的主要造林树种之一。因此落叶松的育苗造林具有很大发展前景。启动子是能够促使转录开始的一段dna序列，启动子本身不被转录，通常位于基因5‘端转录起始位点上游。启动子就像“开关”，调控基因的表达。因此，对启动子的研究尤为重要。落叶松中启动子的分析与鉴定，对于深入了解其基因组信息提供重要的支撑。

技术实现要素：

发明目的：本发明目的是提供具有启动子功能的落叶松dna分子。

本发明另一目的是提供所述具有启动子功能的落叶松dna分子的获取方法及鉴定方法。

技术方案：本发明提供一种具有启动子功能的落叶松dna分子，dna序列如seqidno.1。

所述的具有启动子功能的落叶松dna分子的获取方法，包括如下步骤：用特异引物以日本落叶松(larixkaempferi)的基因组dna为模板，扩增得到1179bp的扩增产物，即得。

进一步地，所述特异引物序列如下：

正向：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcaatgagacttcaaaccggc-3’；

反向：5’-ctcttcttcttaggagccatgtaccaaaatttgaagggcgg-3’。

进一步地，落叶松rna-seq：将落叶松针叶和落叶松愈伤组织分别进行转录组测序，对转录本进行注释；atac-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行atac-seq测序，确定开放染色质信息；组蛋白chip-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行h3k27acchip-seq测序，明确h3k27ac的分布特征，整合组学分析结果，预测潜在调控元件，综合测序数据，通过拼装获得落叶松序列seqidno.2，该序列中包括一个转录本，启动子位于基因的转录起始位点(tss)上游，并且位于开放染色质区，能调控下游基因的表达，将其转录本tss上游1.5kb具有开放染色质的序列扩增(引物同上)，最终获得seqidno.1。

所述的具有启动子功能的落叶松dna分子的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)将启动子dna序列seqidno.1插入p1300lv载体中替换原有的camv35s启动子，构建lkpro2启动报告基因的载体；

(2)正对照载体采用p1300lv：

(3)落叶松原生质体的制备与转化；

(4)转化后对启动子活性进行荧光验证。

进一步地，所述lkpro2启动报告基因的载体的构建方法：使用限制性内切酶ncoi和bamhi将p1300lv载体线性化，后用无缝连接试剂盒将其与启动子序列片段连接，转化至大肠杆菌dh5α中，筛选阳性转化子，即得。

鉴定原理：将一段有启动子活性的dna分子驱动gfp荧光蛋白基因表达，在荧光显微镜下可观察到荧光，证实该序列有功能。反之，则不能。

有益效果：本发明提供了落叶松启动子序列，本质是dna分子，1179bp，能够启动转录，同时提供了快捷的鉴定方法。

附图说明

图1是正对照载体p1300lv结构示意图，是camv35s启动gfp表达；落叶松启动子lkpro2载体示意图和瞬时表达的检测结果。

具体实施方式

本实施例的启动子获取及鉴定方法如下：

1.lkpro2介绍

落叶松rna-seq：将落叶松针叶和落叶松愈伤组织分别进行转录组测序，对转录本进行注释；atac-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行atac-seq测序，确定开放染色质信息；组蛋白chip-seq：将诱导培养的落叶松愈伤组织进行h3k27acchip-seq测序，明确h3k27ac的分布特征，整合组学分析结果，预测落叶松中启动子。本研究综合测序数据，通过拼装获得一段长片段(4895bp，seqidno.2)的落叶松序列。在这段序列中包括一个转录本，其表达量较高，fpkm值为20.7499。因为启动子位于基因的转录起始位点(tss)上游，并且位于开放染色质区，能调控下游基因的表达。因此将其转录本tss上游1.5kb具有开放染色质的序列扩增(引物同下)，最终获得lkpro2(seqidno.1)。

设计序列特异性引物，制备如下引物：

正向：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcaatgagacttcaaaccggc-3’；

反向：5’-ctcttcttcttaggagccatgtaccaaaatttgaagggcgg-3’。

用以上引物以日本落叶松的基因组dna为模板，扩增得到1179bp的扩增产物。经测序，扩增产物的核苷酸序列如seqidno.1的自5’端第一位-1179位所示。

2.检测

将seqidno.1所示的片段插入p1300lv载体中的ncoi和bamhi酶切位点中，构建lkpro2驱动gfp蛋白的载体(如图1所示)。

3.落叶松原生质体制备

(1)愈伤准备。取无菌培养14天左右生长良好的落叶松愈伤组织。

(2)酶解。将愈伤组织用锋利刀片切成细小的块状，并转入盛有10ml酶解液的培养皿中，置于60rpm转速的摇床上25℃黑暗条件下酶解。

(3)过滤。将粗酶液通过预先用2mlw5washingbuffer润洗过的孔径40μm的细胞筛进行过滤，去除酶解不充分的杂质。

(4)提纯。将过滤过的细胞酶解液转移到两个15ml离心管中，每管6ml细胞酶解液，用装有长针头的注射器吸取16ml0.55m蔗糖，每管细胞酶解液底部加入8ml0.55m蔗糖，注意：加蔗糖时，针头伸入底部，推动注射器，随着液面升高，缓慢上移注射器，动作要轻柔，防止对原生质体细胞造成破坏。1000g离心5min。

(5)清洗。取50ml离心管一个，加入10mlwashingbuffer，置于试管架上。用装有长针头的注射器吸取8mlwashingbuffer，再将针头伸到上步离心后的中间细胞层，慢慢吸取该层的所有原生质体，然后小心转移至盛有10mlwashingbuffer的50ml离心管中。轻弹混匀，100g室温离心5min。

(6)重复清洗一次。移除上清，沿壁慢慢加入10mlwashingbuffer，轻弹混匀，100g离心2min。

(7)重悬。去掉上清，加入5mlwashingbuffer，注意沿壁缓慢加入，轻弹混匀，使细胞保持悬浮。

(8)计数。吸取100μl细胞用于计数，取10μl细胞置于细胞计数板进行计数，如果细胞数目太多可采用mgg稀释后再进行计数。

(9)细胞稀释。根据计数结果取适量细胞悬浮液进行离心，然后用mggbuffer重悬细胞，最终将细胞稀释至1×10⁶个/ml，用于原生质体转化。

4.落叶松原生质体的转化：

(1)质粒的准备。采用质粒小提试剂盒(tiangen，cat#dp-106)提取以下质粒：camv35s-gfp和lkpro2-gfp质粒。确保其浓度尽量在500ng/μl以上，整个过程最好为无菌操作。质粒置于-20℃冰箱冻存。使用前以离心机最高转速进行离心10min处理，使杂质沉淀于离心管底部，避免因杂质影响原生质体转化的效率。处理好的质粒用mggbuffer稀释到实验所需质粒浓度，稀释后充分混匀备用。

(2)peg介导的转化。将上述准备好的质粒(camv35s-gfp和lkpro2-gfp)中加入200μl制备好的原生质体细胞，轻弹混匀。然后，每管加入210-230μl40％peg(peg加入量与质粒体积相关，确保等体积加入)，轻弹混匀，直至细胞均匀悬浮于peg当中，从第一管加入peg开始计时，计时20min。从第一管加入到最后一管加入的时间尽量控制在5min以内。

(3)清洗。加入peg反应20min后，每管加入1mlw5washingbuffer，终止反应，轻轻颠倒混匀，250g离心5min。

(4)重复清洗一次。用枪轻轻吸掉上清，重新加入800μlwashingbuffer，轻轻颠倒混匀，150g离心5min，轻轻吸掉上清。

(5)细胞重悬与培养。取40mm培养皿加入2mlw5buffer，再取培养皿中的w5buffer重悬离心管中的细胞，并全部转移至培养皿中，25℃黑暗培养，两天后在显微镜下观察荧光。

5.荧光显微镜观察

使用荧光显微镜进行观察。所有的荧光实验至少重复三次。

序列表

<110>扬州大学

<120>一种具有启动子功能的落叶松dna分子、获取及鉴定方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1179

<212>dna

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<213>人工序列(artificialsequence)

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