SgTPS5基因启动子及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程
技术领域：
，更具体的说是涉及sgtps5基因启动子及其应用。
背景技术：
：植物次生代谢产物是由次生代谢产生的一类植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常具有种属、器官、组织及生长发育时期的特异性。启动子是位于结构基因上游的一段dna序列，它含有rna聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。启动子序列中的顺势作用元件通过与转录因子特异性结合进而控制下游基因的表达。目前基因工程中常用的启动子为组成型camv35s启动子，该启动子驱动目的基因在植物的所有组织和发育阶段表达，导致产生大量异源代谢产物，极大的影响了植物的正常生长。而目前分类鉴定的其他植物启动子存在表达活性较低和表达部位有限等问题。综上，如何提供一种在营养组织部位特异表达的启动子是本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：有鉴于现有技术中的启动子会驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害，本发明所要解决的技术问题是提供一种在营养组织部位特异表达的启动子，该启动子为sgtps5基因的启动子。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种启动子，其特征在于，能驱动目的基因在植物营养组织部位的表达，其核苷酸序列如seqidno.1所示，是sgtps5基因的启动子。萜类合成酶是植物次生代谢物萜类化合物合成途径中的关键酶，对于萜类合成酶tps基因启动子的研究，可为阐述萜类代谢物的表达特异性奠定良好基础，同时为准确大量表达植物次生代谢物提供有效的基因资源，对于重要次生代谢物的高效生产具有重要意义。一种含有上述启动子的表达载体。一种含有上述表达载体的宿主细胞。上述启动子在利用植物营养组织部位表达和生产次生代谢产物的基因工程中的应用。优选的，所述植物营养组织部位为叶、腺毛和根。优选的，所述次生代谢产物为萜类化合物。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：该启动子可用于在植物营养组织部位如叶片和腺毛中大量表达目的基因，而不会驱动基因在种子中表达，避免因在生殖器官大量生产异源代谢产物而影响植物繁殖，从而为准确大量的表达植物次生代谢产物提供有效的基因资源，可用于重要次生代谢产物的高效生产。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本发明实施例1的rt-pcr电泳图；图2附图为本发明实施例1的菌落pcr电泳图；图3附图为本发明实施例2的原核表达载体pet30a-sgtps5酶切电泳图；图4附图为本发明实施例3中sds-page分析sgtps5蛋白的表达结果；图5附图为本发明实施例3中sds-page分析扩大培养的sgtps5蛋白上清纯化结果；图6附图为本发明实施例3中sds-page和westernblot分析sgtps5蛋白纯化结果；图7附图为本发明实施例4中sgtps5酶反应产物gc-ms总离子流图；图8附图为本发明实施例4中sgtps5酶反应产物gc-ms质谱图；图9附图为本发明实施例5中第三轮pcr反应产物；图10附图为本发明实施例6中sgtps5启动子片段克隆和菌落pcr；图11附图为本发明实施例6中pcambia1301表达载体图谱；图12附图为本发明实施例7中protps5启动子组织表达特异性图；图13附图为本发明实施例7中35s启动子在拟南芥花和种子中的表达(图片来自于文献holtorfs,apelk,bohlmannh.comparisonofdifferentconstitutiveandinduciblepromotersfortheoverexpressionoftransgenesinarabidopsisthaliana.plantmolbiol.1995nov；29(4):637-46)。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase高保真酶购自vazyme公司；pmd19(simple)亚克隆载体购自takara公司；t4连接酶购自thermofisher公司；启动子步移试剂盒genomewalkingkit(codeno.6108)购自takara公司；植物基因组dna提取试剂盒购自天跟公司。未提及的药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。实施例1sgtps5基因克隆提取油楠茎部组织的rna，采用逆转录酶m-mlv逆转录反应合成cdna。以该cdna为模板，采用phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase高保真酶进行pcr扩增。所用引物序列如下：正向引物1为：5'-ggggtaccatgtcagttgcagcgttag-3'；seqidno.2；反向引物1为：5'-gctctagatcatgcgacaggatttatgagc-3'；seqidno.3。pcr反应体系(总体积50μl)如表1所示。表1pcr反应体系ddh2o17μl2×phantamaxbuffer25μldntpmix(10mmeach)1μl模板dna2μl正向引物1(10μm)2μl反向引物1(10μm)2μlphantamaxsuper-fidelitydnapolymease(1u/μl)1μlpcr反应程序为：95℃30s；(95℃15s，退火温度45～55℃15s，延伸72℃1min)×39循环；最后延伸72℃，5min。pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，图1的m为dnamarkerdl2000，电泳结果显示扩增的基因条带单一大小正确，符合预期。将sgtps5基因的经phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase高保真酶扩增的pcr产物进行加a反应，在pcr产物两侧各加上1个atp接头，再连入pmd19(simple)亚克隆载体。采用t4连接酶连接pcr产物与pmd19(simple)亚克隆载体，连接反应体系如表2所示。表2连接反应体系ddh2o定容至20μl10×t4dnaligasebuffer2μlt载体20～100ng插入片段与t载体的摩尔比为1:1～5:1t4dna连接酶1μl将以上体系放入22℃恒温水浴锅中反应60min以上或在4℃过夜，得到连接产物。再将连接产物转化大肠杆菌并做阳性克隆鉴定。转化条件为：在200μl感受态细胞中加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰浴30min；迅速放入42℃水浴中热激90s，立即置于冰上2min；加入800μllb培养基，37℃慢摇培养1h；将菌液6000rpm离心2min，弃上清，悬浮菌体，涂布于含有抗生素(amp)的lb平板上，37℃倒置暗培养12～16h。采用菌落pcr进行阳性克隆筛选。筛选方法为：从转化平板上随机挑取单菌落，置于1.5ml离心管中的液体培养基中培养。将每管进行编号，各管取1μl用作模板进行pcr检测，剩余培养物保存于4℃，检测为阳性的菌落于平板或甘油管保存备用。所用引物序列如下：正向引物2：5'-cgccagggttttcccagtcacgac-3'；seqidno.4；反向引物2：5'-agcggataacaatttcacacagga-3'；seqidno.5。pcr反应体系为：1μl菌液，正向引物2，反向引物2，1xbuffer，0.25mmdntpmixture，0.5μlextaqdna聚合酶，混合后进行pcr扩增。pcr程序为：94℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃1min30s，35个循环；72℃延伸10min。菌落pcr结果如图2所示，图2的m为dnamarkerdl2000，1～8号为阳性菌。挑选阳性单克隆菌落，提取质粒后送交测序。经测序分析，克隆得到的倍半萜合成酶基因sgtps5，其含有1674个碱基，编码的蛋白命名为倍半萜合成酶sgtps5，共557个氨基酸。并由此得到将倍半萜合成酶基因sgstps5插入到pmd19克隆载体的重组质粒成功转化至原核细胞大肠杆菌top10的阳性菌，命名为top10-sgtps5。sgtps5核苷酸序列如下：atgtcagttgcagcgttagcaattgctacttccacaccttcatcttttgttcctcgtcgttctgcaaattatcatcctagcgtttggggagaccatttcattaaatatgcttctcagcctttggaagcagatgaggaaatggaggaccatattgaaacattgaaagaaattgtgaggaaaatgcttgtccccgcaactgataggcctttaacaaaagttaagttgattgattcaatccaacgtttgggtgtgtactatcattttgaaagtgagatagatgaagtgttgtgtcaaattcagaagaattatgtaaaggatggtctaataactctcaatgaggatctccatgctttggctcttctctttaggttactaaggcagcaaggatatcacgtttcacctgatgtgttcaacaagttcaaagatgagcaaggaaaaatcagtgaaacaattaccaatgatgttgaaggaatgctaagcttatatgaagctgcacatctcaggatacatggagaagacatattagatgaagcccttgattttacttccactcatcttaagtttttaaccacccaattgagtgattcttatgccggaaaagtcattcaaagcttaaagtggcctctgcggaggaggcttcctaggctggagtcttggcactacttttctacttaccgggaagatccttcgcacaatgaaactttactggactttgcaaagtcggatttcaatagggtgcaaaagctacaccagagggaaattggaaacctctcaaagtggtggaaggatttagatttcgctacgaaactacctttcgcgcgcaataggttggtggaggcttacttttggataatgggagtctatttcgagccttcctactcacttgctagaaggataatgaccaaagtgatatcattgacatcaattcttgatgatacatacgatgtgtacggtacacttgatgaactagaacttctcactgaagcgatcgacaagtgggacatctcttgcatggattttcttccagagtacatgaagcttatttatcaacagctcttggatgtttatgatgaaattgagcgagagacagcaaaagaaggaagagctttctgtgtaaattacggaaaagaagaaatgagaaaagtgactcgagcttacttggctgaagccaaatggttccacaacaactatacaccaacattggaggagtatatgaaggtcgcacaagtatcttcgggttatcgtatgcttacaacagtatccttcattggcatgggatccatagctactgaggaggccttcaaatgggtagccaaagatccgaaaattgttaaaggttccttagttatttgcagactcatggacgacattgtttccaataagcttgagcaagagagagggcatgttgtttcagctctggaatgctacatgaagcaacatggtacaaccgaggaagaaaccattgttgaatttcgcagacgagttgaaaatgcatggaaggatataaacgaggattgccttcaacctttcgaagtggcaaagcctctgctgatgcgaagtctgaacatgtcgcgcgtaattcatcttctttatacggattatgattgctacactcactctgctggaaatacaaagaagaacattgaagccttgctcataaatcctgtcgcatga；seqidno.6。sgtps5编码的氨基酸序列如下：msvaalaiatstpssfvprrsanyhpsvwgdhfikyasqpleadeemedhietlkeivrkmlvpatdrpltkvklidsiqrlgvyyhfeseidevlcqiqknyvkdglitlnedlhalallfrllrqqgyhvspdvfnkfkdeqgkisetitndvegmlslyeaahlrihgedildealdftsthlkflttqlsdsyagkviqslkwplrrrlprleswhyfstyredpshnetlldfaksdfnrvqklhqreignlskwwkdldfatklpfarnrlveayfwimgvyfepsyslarrimtkvisltsilddtydvygtldelellteaidkwdiscmdflpeymkliyqqlldvydeieretakegrafcvnygkeemrkvtraylaeakwfhnnytptleeymkvaqvssgyrmlttvsfigmgsiateeafkwvakdpkivkgslvicrlmddivsnkleqerghvvsalecymkqhgtteeetivefrrrvenawkdinedclqpfevakpllmrslnmsrvihllytdydcythsagntkknieallinpva*；seqidno.7。实施例2倍半萜合成酶基因sgtps5密码子优化和全基因合成、构建表达载体及转化原核细胞采用密码子优化软件对sgtps5蛋白氨基酸序列进行优化，优化后其编码基因的碱基序列如sgtps5-optimized所示。采用全基因合成方法合成密码子优化后的倍半萜合成酶基因sgtps5全长序列。sgtps5-optimized的核苷酸序列如下：atgagcgttgcggcactggcaattgcaaccagtaccccgagtagtttcgttccgcgtcgtagcgcgaattatcatccgtctgtctggggcgatcatttcatcaaatatgcgagtcaaccgctggaagctgacgaagaaatggaagaccacatcgagaccctgaaagagatcgtccgtaaaatgctggttccggcaaccgatcgtccgctgaccaaagtcaaactgatcgatagcatccagcgtctgggcgtttattaccacttcgagagcgaaatcgacgaagtcctgtgccagatccagaaaaactacgtcaaagacggcctgattaccctgaacgaagatctgcacgcactggcactgctgtttcgtctgctgcgtcaacaaggttatcacgtttccccggatgtcttcaacaaattcaaagacgagcagggcaaaatcagcgaaaccatcaccaacgacgtcgaaggtatgctgagtctgtacgaagcagcacatctgcgtattcacggcgaagatatcctggacgaagcactggattttaccagcacccatctgaaattcctgaccacccaactgagcgatagctacgcaggcaaagttattcagagcctgaaatggccgctgcgtcgtcgtctgccgcgtctggaaagctggcattacttcagcacctaccgcgaagatccgagtcataacgaaaccctgctggatttcgcgaaaagcgactttaaccgcgtccagaaactgcatcagcgcgaaattggtaacctgtccaaatggtggaaagacctggactttgcgaccaaactgccgtttgcacgtaaccgtctggtcgaagcgtatttctggatcatgggcgtctattttgaaccgagctatagcctggcccgccgtattatgaccaaagttatcagcctgaccagtattctggacgatacctacgacgtttacggtaccctggacgaactggaactgctgaccgaagctatcgacaaatgggacatcagctgcatggattttctgccggagtacatgaaactgatctaccagcagctgctggacgtttacgacgaaatcgaacgcgaaaccgcgaaagaaggtcgcgcgttttgcgttaattacggcaaagaagaaatgcgcaaagttacccgcgcatatctggccgaagcgaaatggttccacaacaactataccccgaccctggaagaatatatgaaagttgcgcaggttagctctggctatcgtatgctgaccaccgtttccttcattggcatgggtagcattgcgaccgaagaagccttcaaatgggtcgcgaaagacccgaaaatcgtcaaaggtagtctggttatttgccgtctgatggacgacatcgtctccaacaaactggagcaggaacgcggtcacgttgtttctgcactggaatgttacatgaaacagcacggcaccaccgaagaagaaaccattgtcgaatttcgccgtcgcgttgaaaacgcctggaaagacatcaacgaggactgtctgcagccgtttgaagttgctaaaccgctgctgatgcgttctctgaacatgagtcgcgttatccacctgctgtacaccgattacgactgttatacccatagcgcgggcaacaccaaaaagaacatcgaggcgctgctgatcaatccggttgcataa；seqidno.8。通过限制性酶切位点ndei和hindiii对优化的sgtps5基因和质粒pet30a分别进行双酶切，酶切体系为：ndei和hindiii各1μl，优化的sgtps5基因浓度为0.3μg，质粒pet30a浓度为1μg，加入灭菌的双蒸水至30μl，酶切时间为1h。酶切后利用核酸纯化回收试剂盒纯化回收得到经过双酶切的优化的sgtps5基因片段和质粒pet30a。将酶切后的优化的sgtps5基因片段连接至酶切后的表达载体质粒pet30a中，连接反应条件为：优化的sgtps5基因和pet30a质粒(摩尔比为3:1)、1x连接buffer，t4dna连接酶，混合后，15℃放置16h完成连接反应，获得重组质粒pet30a-sgtps5(优化的sgtps5基因插入到表达载体pet30a后的重组质粒)。然后将重组质粒转化到大肠杆菌top10和大肠杆菌bl21(de3)克隆菌株中。挑取抗生素(kan)筛选得到的阳性菌落，提取质粒，通过酶切法，如图3，和测序确认最终表达载体的准确性，由此得到将优化的sgtps5基因插入到pet30a表达载体的重组质粒成功转化至原核细胞的阳性菌，命名为top10-sgtps5(2)和bl21-sgtps5。将构建好的bl21-sgtps5菌进行大量培养，首先挑取单克隆bl21-sgtps5，接种到4ml的lb培养基中(含50μg/ml的硫酸卡那霉素)，37℃，200rpm，待培养至od600为0.5～0.8，向试管培养液中加入终浓度0.1mmiptg，之后分别置于15℃和37℃诱导表达，得到大量表达倍半萜合成酶sgtps5的菌液。实施例3油楠倍半萜合成酶sgtps5的原核表达、蛋白纯化和蛋白质检取实施例2中诱导后大量表达倍半萜合成酶sgtps5的菌液，12000rpm离心5min，去除上清液，加入pbs液重悬沉淀，最后加入sds-page蛋白上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清做电泳。电泳前10min时，100v稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200v稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。结果见图4，图4的m为蛋白marker，lane0为对照，lane1为15℃诱导16h，lane2为37℃诱导16h，箭头所指为目的蛋白sgtps5。按实施例2所述方法，放大培养4l的表达菌，生长至od600＝0.8时，加终浓度0.1mmiptg，15℃诱导16h后收集菌体。全菌采用50mmtris(ph8.0)，300mmnacl，50mmimidazole含1％tritonx-100，1mmdtt，1mmpmsf超声裂解，同时以50mmtris(ph8.0)，300mmnacl，50mmimidazole缓冲液平衡ni-ida亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行sds-page分析检测。分析结果见图5，图5的m为蛋白marker，lane1为全菌破菌离心后上清，lane2为上清同ni-ida孵育后流出液，lane3～4为50mmimidazole的洗脱组分，lane5～6为100mmimidazole的洗脱组分，lane7～10为300mmimidazole的洗脱组分，箭头所指为目的蛋白。经ni-ida亲和层析纯化，收集纯度浓度较好的lane9～10，并将其透析到1×pbs，10％glycerol，ph7.4透析结束后用0.22μm膜过滤，并分装冻于-80℃。目的蛋白溶度用bsa做标准品，采用bradford法测定蛋白浓度为0.956mg/ml。油楠倍半萜合成酶sgtps5的蛋白western-blot检测操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著，结果请见图6，左图中lanem1为sds-page蛋白marker，lane1为bsa蛋白，lane2为sgtps5蛋白；右图中lanem2为western-blotmarker，抗体为anti-his。实施例4sgtps5的生化功能以法呢基焦磷酸(fpp)或牻牛儿基焦磷酸(gpp)为底物，酶促反应体系为：25mmtris-hci(ph7.4)，5mm二硫苏糖醇(dtt)，100mm氯化钾，5mm氯化镁，10％甘油，底物浓度为50μm，加入50μg实施例3中纯化后的油楠倍半萜合成酶sgtps5蛋白，置于37℃反应1h。反应结束后，用固相微萃取spme纤维pdms100μm顶空萃取挥发物质30min，250℃解吸3min进样。采用gc-ms联用仪(agilentgc-ms7890b-5977a)对催化产物进行检测。气相色谱柱为hp-5ms(30m×0.25mm)，载气高纯he流速为1.0ml/min，升温程序为：50℃保持1min，以5℃/min速度升温至80℃，保持1min，再以10℃/min速度升温至220℃，保持10min，进样口温度为250℃，离子源ei70ev温度为230℃，接口温度为250℃，采集质量范围为30～200amu，数据经nist14质谱谱库检索，并与标准谱图对照，鉴定各组分峰。样品总离子流图见图7。以fpp为底物时，在保留时间为15.37、15.82、15.98、16.43、16.88、16.98、17.14、17.44、17.73、17.51、17.54和17.79处分别出现峰，经nist14数据检索谱库检索比对，结果显示分别对应的化合物为α-荜澄茄油烯(α-cubebene)、α-可巴烯(α-copaene)、β-可巴烯(β-copaene)、β-石竹烯(β-caryophyllene)、蛇麻烯(humulene)、epi-β-石竹烯(epi-β-caryophyllene)、γ-依兰油烯(γ-muurolene)、α-衣兰油烯(α-muurolene)、δ-卡迪烯(δ-cadinadiene)。以gpp为底物时，在保留时间为14.00处出现峰，经nist14数据检索谱库检索比对，结果显示对应的化合物为香叶醇(geraniol)。gc-ms质谱图如图8所示。由此表明油楠倍半萜合成酶sgtps5为多功能酶，可催化fpp合成9种倍半萜类化合物，并可催化gpp合成1种单萜类化合物。实施例5sgtps5启动子克隆启动子步移试剂盒为genomewalkingkit(codeno.6108)，详细方法参考试剂盒说明书。具体如下：根据sgtps5基因组dna序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物与试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物，即ap1、ap2、ap3、ap4进行热不对称pcr反应。特异性引物的序列如下：sp1:5'-aaaagatgaaggtgtggaagtagc-3'；seqidno.9；sp2:5'-gagagataacttgggcttcttggc-3'；seqidno.10；sp3:5'-gaaatattataatgagcagggatg-3'；seqidno.11。通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称pcr反应，通过三次巢式pcr反应即可获取已知序列的侧翼序列。如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。利用植物基因组dna提取试剂盒提取油楠叶片基因组dna，经od测定准确定量后，取适量作为模板，以ap1primer作为上游引物，sp1primer为下游引物，进行第一轮1stpcr反应。然后将1stpcr反应液稀释100倍后，取1μl作为2ndpcr反应的模板，以ap1primer为上游引物，sp2primer为下游引物，进行2ndpcr反应。将2ndpcr反应液稀释1～1000倍后，取1l作为3rdpcr反应的模板，以ap1primer为上游引物，sp3primer为下游引物，进行3rdpcr反应。取1st，2nd，3rdpcr反应液各5l，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳图如图9所示，图9的m为dnamarkerdl2000，箭头所示为第三轮pcr反应产物。切胶回收清晰的电泳条带，以sp3primer为引物对pcr产物进行dna测序。最终获得长度为2033bp的sgtps5上游启动子序列protps5。sgtps5启动子序列如下：ctgaatattaaattagtacaattttaatctctacttatttaaattttctcaaaattgcatttaagtttacgttttatatttggcgtgtttcccatggaaagataagaacttttagcgttacttttatactaaaattcaattctactcccatataaatatggttaattatattattttttaacataataatctaatttgataaaaaaatatttattttatagaaaataaattatttttgaaaaaactcaaagtactaaattaaaaaaatacactttacaacatttattatttatataaaaataacacaaaattttcaatgcataaggccggaattcttttctcgctaaaaatttctatattactaataaaatgggagtatgaaagctgcaaaattttggcctattagtggttcacctggaatgtcaaatttttacactgcttctgtagtcttcgctttcttttctggataagaaaatttcaccgacgggcgcggagggtaggactcccttttcggggggaccaaaaaatttattaaaactttttttagtatggtaggaaattagaatcattataaaataagttgaaccaaatttttatttgtccttattaaattcacaaatttaggtttaagtttgactattaaacaaatctaattgtgcttaaacaaagtttaacatatttaatgggttattttcaataaaataacaatttaaaaaaatggaaaataaatttttttttaaacacacttctctctctctttttctctcttttattttttagtttgatttctttctatttttcttgtttttccaaaaataagaaaacacaatgatacttaggaaatgtttgatagtattaaaatgtttagcactagattttaattgttgaaaccatttaagtactaaggtttcatttgtttttagaaaacaatttccataaaaaaactcattttttaatatatgagttaaggagtatcatctatttttacatattgtgattaaaataaggacaaaaattaggtatagcttcttttgtattttttataaggttttctattcaaattataatatgtgtattaattattgtattataattaaaatattaataattattacaatcatcaaattaaaatttttaatagttaataaaataattaatatacatattatattctaaatggagaattttacggcaaatacttaaggaatattacttaagttttatccttaaaattgtaattaatagaactatagtagtgggggaaaacaattccttctttgaaaaaaagaattatctttcataaaattcattatatttaatattgaatacattaactattttccacatcttgatctatagaaaatattttttttaccaaaataaatgaagtctaaatttatagtgtttgaatagttttgtattgaattacgttaatagtttgaaatttttattaacgaatattgaaaatttataaaatttcaaaattatctttgattatgattttataaattatacacatcaaatctttaaatgttatgatatatattatatatttaatattcaattattattctaacaataaagataatatttaacatatttgtccaataaaatctctctaaaataagagaagttgctaaatgttattaaacaaatttaataaaatttcatttaatttaatatttatttttaataaattatataaataggatctaattctaaatttgaacctatccatttaactattaacatccctgctcattataatatctcatatatttattttattttctagatggggctaaattaataaaagaaatcacaaaaataaaattacatatatattttatttttttttgaaaatttatggggcccatggctccctaataatgaggaggctgcgtccctgttcaccgagttaaactataaatgccaagtaagcccaagttatctctcagctcaaaacccgtccattcatccaatttcatagcactctttctcataagcagaagtaacggaaaaaggcgaagaat；seqidno.1。实施例6sgtps5启动子表达载体构建及遗传转化根据sgtps5启动子序列protps5设计引物，引物序列如下：protps5-f2:5’-tcctctagagtcgacctgcaggtttacgttttatatttggc-3’；seqidno.12；protps5-r1:5’-ttaccctcagatctaccatggattcttcgcctttttccgttac-3’；seqidno.13。以油楠基因组dna为模板，采用phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase高保真酶进行pcr扩增，结果如图10a所示，图10a的m为dnamarkerdl2000，lane1～2为pcr扩增产物。将pcr产物进行凝胶电泳，结果显示均扩增到单一条带，大小相近。将条带切胶回收，即为sgtps5启动子序列protps5。将protps5基因的经phantamaxsuper-fidelity高保真酶扩增的pcr纯化产物先进行加a反应，在产物两侧各加上1个atp接头，再连入pmd19(simple)亚克隆载体，得到protps5的t克隆载体质粒。用psti和ncoi双酶切protps5的t克隆载体质粒及pcambia1301载体质粒(采用thermo公司或takara公司相应限制性内切酶产品)。酶切反应体系如表3所示。表3酶切反应体系组分体积(μl)10×buffer2质粒5kpnii2bamhi/xbai2ddh2o定容至40酶切产物分别纯化回收后，采用与连接t载体相同的t4dna连接酶进行连接，过程同上。连接产物转化的大肠杆菌各挑8个抗性克隆，用载体插入位置两侧的引物进行扩增，所用引物序列如下：正向引物2：5'-cgccagggttttcccagtcacgac-3'；seqidno.4；反向引物2：5'-agcggataacaatttcacacagga-3'；seqidno.5。结果如图10b所示，图10b的m为dnamarkerdl2000，lane1～8为菌落pcr扩增产物。随机选取1个阳性克隆送测序，测序结果与序列一致。由此得到将sgtps5启动子序列protps5插入到pcambia1301表达载体(图11)的重组质粒成功转化至原核细胞的阳性菌，命名为top10-prosgtps5，利用冻融法将sgtps5启动子序列protps5插入到pcambia1301表达载体的重组质粒成功转化至农杆菌细胞的阳性菌，命名为lba4404-prosgtps5。通过农杆菌介导法转化拟南芥植株。转化方法如下：挑取包含有lba4404-prosgtps5表达载体的农杆菌单菌落接种于管中，28℃200rmp摇菌。当天晚间转接于含lb液体培养基50ml的三角瓶中，28℃摇菌过夜。第二天转入250mllb液体培养基中摇菌至中午，转入离心管中，添加h2o调节平衡，25℃5000rmp离心5min。弃上清，沉淀中添加50ml转化液，摇床悬浮摇菌5min。浮散开后，添加250ml转化液，od600在0.8左右，即得转化菌液。待大部分植株都抽薹之后，在花序基部剪掉整个主苔，去其顶端优势，约1周后在腋芽部位长出4～6个新生侧苔，待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成1～2个角果时，便可用于转化。将野生型植株花序浸泡于转化菌液中20秒，保鲜膜包裹，避光保存。过夜后接膜，正常养护。实施例7sgtps5启动子在植物中的表达特异性实施例6中收种后的转基因t0代种子在4℃冰箱保存1周左右。制作筛选培养基。根据所构建载体中植物抗性，制作添加筛选压的ms培养基，卡那霉素筛选压为50mg/l。取适量转基因t0代种子，放入1.5ml离心管中，75％酒精消毒5min，无菌水洗5遍。超净工作台中，将消毒后的种子，铺在上述制作的添加筛选压的ms培养基上，用0.05％琼脂糖水分散均匀。晾干，用石蜡膜封口。将铺满种子的平板，放在光照16l/8d，22～24℃的条件下，使种子萌发。待幼苗第一对真叶展开，且生根，即可移栽。将有真叶并生根的幼苗移栽到混合草炭、蛭石和珍珠岩的育苗土中。收种后的转基因t2代种子按上述同样方法进行筛选，筛选后的阳性植株进行gus染色观察。将准备好的拟南芥植株放入细胞培养皿中，加入染色液浸没试材，封好盖子，抽真空，在37℃培养箱中温育12h，直至有蓝色出现，水中洗涤一次。将侵染过的试材转入70％乙醇中脱色2～3次，除去叶绿素，每隔1小时更换一次脱色液，至阴性对照材料呈白色为止，用显微镜观察拍照。结果如图12所示。结果表明prosgtps5启动子可以驱动gus基因在幼苗叶片、叶表面腺毛、根部维管组织、花瓣和果荚底部表达，而在生殖器官包括花粉，雄蕊和雌蕊中均不表达。与35s启动子相比(holtorfs,apelk,bohlmannh.comparisonofdifferentconstitutiveandinduciblepromotersfortheoverexpressionoftransgenesinarabidopsisthaliana.plantmolbiol.1995nov；29(4):637-46.)，该启动子可用于在植物营养组织部位如叶片和腺毛中大量表达目的基因，而不会驱动基因在种子中表达，避免因在生殖器官大量生产异源代谢产物而影响植物繁殖，从而用于植物重要次生代谢产物的体内精准生产。本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。序列表<110>中国林业科学研究院热带林业研究所<120>sgtps5基因启动子及其应用<160>13<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2033<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctgaatattaaattagtacaattttaatctctacttatttaaattttctcaaaattgcat60ttaagtttacgttttatatttggcgtgtttcccatggaaagataagaacttttagcgtta120cttttatactaaaattcaattctactcccatataaatatggttaattatattatttttta180acataataatctaatttgataaaaaaatatttattttatagaaaataaattatttttgaa240aaaactcaaagtactaaattaaaaaaatacactttacaacatttattatttatataaaaa300taacacaaaattttcaatgcataaggccggaattcttttctcgctaaaaatttctatatt360actaataaaatgggagtatgaaagctgcaaaattttggcctattagtggttcacctggaa420tgtcaaatttttacactgcttctgtagtcttcgctttcttttctggataagaaaatttca480ccgacgggcgcggagggtaggactcccttttcggggggaccaaaaaatttattaaaactt540tttttagtatggtaggaaattagaatcattataaaataagttgaaccaaatttttatttg600tccttattaaattcacaaatttaggtttaagtttgactattaaacaaatctaattgtgct660taaacaaagtttaacatatttaatgggttattttcaataaaataacaatttaaaaaaatg720gaaaataaatttttttttaaacacacttctctctctctttttctctcttttattttttag780tttgatttctttctatttttcttgtttttccaaaaataagaaaacacaatgatacttagg840aaatgtttgatagtattaaaatgtttagcactagattttaattgttgaaaccatttaagt900actaaggtttcatttgtttttagaaaacaatttccataaaaaaactcattttttaatata960tgagttaaggagtatcatctatttttacatattgtgattaaaataaggacaaaaattagg1020tatagcttcttttgtattttttataaggttttctattcaaattataatatgtgtattaat1080tattgtattataattaaaatattaataattattacaatcatcaaattaaaatttttaata1140gttaataaaataattaatatacatattatattctaaatggagaattttacggcaaatact1200taaggaatattacttaagttttatccttaaaattgtaattaatagaactatagtagtggg1260ggaaaacaattccttctttgaaaaaaagaattatctttcataaaattcattatatttaat1320attgaatacattaactattttccacatcttgatctatagaaaatattttttttaccaaaa1380taaatgaagtctaaatttatagtgtttgaatagttttgtattgaattacgttaatagttt1440gaaatttttattaacgaatattgaaaatttataaaatttcaaaattatctttgattatga1500ttttataaattatacacatcaaatctttaaatgttatgatatatattatatatttaatat1560tcaattattattctaacaataaagataatatttaacatatttgtccaataaaatctctct1620aaaataagagaagttgctaaatgttattaaacaaatttaataaaatttcatttaatttaa1680tatttatttttaataaattatataaataggatctaattctaaatttgaacctatccattt1740aactattaacatccctgctcattataatatctcatatatttattttattttctagatggg1800gctaaattaataaaagaaatcacaaaaataaaattacatatatattttatttttttttga1860aaatttatggggcccatggctccctaataatgaggaggctgcgtccctgttcaccgagtt1920aaactataaatgccaagtaagcccaagttatctctcagctcaaaacccgtccattcatcc1980aatttcatagcactctttctcataagcagaagtaacggaaaaaggcgaagaat2033<210>2<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggggtaccatgtcagttgcagcgttag27<210>3<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gctctagatcatgcgacaggatttatgagc30<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgccagggttttcccagtcacgac24<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agcggataacaatttcacacagga24<210>6<211>1674<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6atgtcagttgcagcgttagcaattgctacttccacaccttcatcttttgttcctcgtcgt60tctgcaaattatcatcctagcgtttggggagaccatttcattaaatatgcttctcagcct120ttggaagcagatgaggaaatggaggaccatattgaaacattgaaagaaattgtgaggaaa180atgcttgtccccgcaactgataggcctttaacaaaagttaagttgattgattcaatccaa240cgtttgggtgtgtactatcattttgaaagtgagatagatgaagtgttgtgtcaaattcag300aagaattatgtaaaggatggtctaataactctcaatgaggatctccatgctttggctctt360ctctttaggttactaaggcagcaaggatatcacgtttcacctgatgtgttcaacaagttc420aaagatgagcaaggaaaaatcagtgaaacaattaccaatgatgttgaaggaatgctaagc480ttatatgaagctgcacatctcaggatacatggagaagacatattagatgaagcccttgat540tttacttccactcatcttaagtttttaaccacccaattgagtgattcttatgccggaaaa600gtcattcaaagcttaaagtggcctctgcggaggaggcttcctaggctggagtcttggcac660tacttttctacttaccgggaagatccttcgcacaatgaaactttactggactttgcaaag720tcggatttcaatagggtgcaaaagctacaccagagggaaattggaaacctctcaaagtgg780tggaaggatttagatttcgctacgaaactacctttcgcgcgcaataggttggtggaggct840tacttttggataatgggagtctatttcgagccttcctactcacttgctagaaggataatg900accaaagtgatatcattgacatcaattcttgatgatacatacgatgtgtacggtacactt960gatgaactagaacttctcactgaagcgatcgacaagtgggacatctcttgcatggatttt1020cttccagagtacatgaagcttatttatcaacagctcttggatgtttatgatgaaattgag1080cgagagacagcaaaagaaggaagagctttctgtgtaaattacggaaaagaagaaatgaga1140aaagtgactcgagcttacttggctgaagccaaatggttccacaacaactatacaccaaca1200ttggaggagtatatgaaggtcgcacaagtatcttcgggttatcgtatgcttacaacagta1260tccttcattggcatgggatccatagctactgaggaggccttcaaatgggtagccaaagat1320ccgaaaattgttaaaggttccttagttatttgcagactcatggacgacattgtttccaat1380aagcttgagcaagagagagggcatgttgtttcagctctggaatgctacatgaagcaacat1440ggtacaaccgaggaagaaaccattgttgaatttcgcagacgagttgaaaatgcatggaag1500gatataaacgaggattgccttcaacctttcgaagtggcaaagcctctgctgatgcgaagt1560ctgaacatgtcgcgcgtaattcatcttctttatacggattatgattgctacactcactct1620gctggaaatacaaagaagaacattgaagccttgctcataaatcctgtcgcatga1674<210>7<211>557<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7metservalalaalaleualailealathrserthrproserserphe151015valproargargseralaasntyrhisproservaltrpglyasphis202530pheilelystyralaserglnproleuglualaaspgluglumetglu354045asphisilegluthrleulysgluilevalarglysmetleuvalpro505560alathraspargproleuthrlysvallysleuileaspserilegln65707580argleuglyvaltyrtyrhispheglusergluileaspgluvalleu859095cysglnileglnlysasntyrvallysaspglyleuilethrleuasn100105110gluaspleuhisalaleualaleuleupheargleuleuargglngln115120125glytyrhisvalserproaspvalpheasnlysphelysaspglugln130135140glylysilesergluthrilethrasnaspvalgluglymetleuser145150155160leutyrglualaalahisleuargilehisglygluaspileleuasp165170175glualaleuaspphethrserthrhisleulyspheleuthrthrgln180185190leuseraspsertyralaglylysvalileglnserleulystrppro195200205leuargargargleuproargleuglusertrphistyrpheserthr210215220tyrarggluaspproserhisasngluthrleuleuaspphealalys225230235240serasppheasnargvalglnlysleuhisglnarggluileglyasn245250255leuserlystrptrplysaspleuaspphealathrlysleuprophe260265270alaargasnargleuvalglualatyrphetrpilemetglyvaltyr275280285phegluprosertyrserleualaargargilemetthrlysvalile290295300serleuthrserileleuaspaspthrtyraspvaltyrglythrleu305310315320aspgluleugluleuleuthrglualaileasplystrpaspileser325330335cysmetasppheleuproglutyrmetlysleuiletyrglnglnleu340345350leuaspvaltyraspgluilegluarggluthralalysgluglyarg355360365alaphecysvalasntyrglylysgluglumetarglysvalthrarg370375380alatyrleualaglualalystrpphehisasnasntyrthrprothr385390395400leugluglutyrmetlysvalalaglnvalserserglytyrargmet405410415leuthrthrvalserpheileglymetglyserilealathrgluglu420425430alaphelystrpvalalalysaspprolysilevallysglyserleu435440445valilecysargleumetaspaspilevalserasnlysleuglugln450455460gluargglyhisvalvalseralaleuglucystyrmetlysglnhis465470475480glythrthrgluglugluthrilevalglupheargargargvalglu485490495asnalatrplysaspileasngluaspcysleuglnprophegluval500505510alalysproleuleumetargserleuasnmetserargvalilehis515520525leuleutyrthrasptyraspcystyrthrhisseralaglyasnthr530535540lyslysasnileglualaleuleuileasnprovalala545550555<210>8<211>1674<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8atgagcgttgcggcactggcaattgcaaccagtaccccgagtagtttcgttccgcgtcgt60agcgcgaattatcatccgtctgtctggggcgatcatttcatcaaatatgcgagtcaaccg120ctggaagctgacgaagaaatggaagaccacatcgagaccctgaaagagatcgtccgtaaa180atgctggttccggcaaccgatcgtccgctgaccaaagtcaaactgatcgatagcatccag240cgtctgggcgtttattaccacttcgagagcgaaatcgacgaagtcctgtgccagatccag300aaaaactacgtcaaagacggcctgattaccctgaacgaagatctgcacgcactggcactg360ctgtttcgtctgctgcgtcaacaaggttatcacgtttccccggatgtcttcaacaaattc420aaagacgagcagggcaaaatcagcgaaaccatcaccaacgacgtcgaaggtatgctgagt480ctgtacgaagcagcacatctgcgtattcacggcgaagatatcctggacgaagcactggat540tttaccagcacccatctgaaattcctgaccacccaactgagcgatagctacgcaggcaaa600gttattcagagcctgaaatggccgctgcgtcgtcgtctgccgcgtctggaaagctggcat660tacttcagcacctaccgcgaagatccgagtcataacgaaaccctgctggatttcgcgaaa720agcgactttaaccgcgtccagaaactgcatcagcgcgaaattggtaacctgtccaaatgg780tggaaagacctggactttgcgaccaaactgccgtttgcacgtaaccgtctggtcgaagcg840tatttctggatcatgggcgtctattttgaaccgagctatagcctggcccgccgtattatg900accaaagttatcagcctgaccagtattctggacgatacctacgacgtttacggtaccctg960gacgaactggaactgctgaccgaagctatcgacaaatgggacatcagctgcatggatttt1020ctgccggagtacatgaaactgatctaccagcagctgctggacgtttacgacgaaatcgaa1080cgcgaaaccgcgaaagaaggtcgcgcgttttgcgttaattacggcaaagaagaaatgcgc1140aaagttacccgcgcatatctggccgaagcgaaatggttccacaacaactataccccgacc1200ctggaagaatatatgaaagttgcgcaggttagctctggctatcgtatgctgaccaccgtt1260tccttcattggcatgggtagcattgcgaccgaagaagccttcaaatgggtcgcgaaagac1320ccgaaaatcgtcaaaggtagtctggttatttgccgtctgatggacgacatcgtctccaac1380aaactggagcaggaacgcggtcacgttgtttctgcactggaatgttacatgaaacagcac1440ggcaccaccgaagaagaaaccattgtcgaatttcgccgtcgcgttgaaaacgcctggaaa1500gacatcaacgaggactgtctgcagccgtttgaagttgctaaaccgctgctgatgcgttct1560ctgaacatgagtcgcgttatccacctgctgtacaccgattacgactgttatacccatagc1620gcgggcaacaccaaaaagaacatcgaggcgctgctgatcaatccggttgcataa1674<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aaaagatgaaggtgtggaagtagc24<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gagagataacttgggcttcttggc24<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gaaatattataatgagcagggatg24<210>12<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tcctctagagtcgacctgcaggtttacgttttatatttggc41<210>13<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ttaccctcagatctaccatggattcttcgcctttttccgttac43当前第1页12