一种人胎盘间充质干细胞的培养方法与流程

[0001]
本发明涉及生物科学技术领域，更具体地说，它涉及一种人胎盘间充质干细胞的培养方法。


背景技术：

[0002]
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，msc)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，间充质干细胞具有低免疫原性及向缺血或损伤组织归巢的特征，输入宿主体内后，可归巢于特定部位，在微环境影响下定向分化为内胚层、中胚层以及外胚层3个胚层来源组织的细胞，如骨、软骨、肌腱、脂肪、肝、肾、皮肤、肌肉、神经甚至胰腺等10余种成熟细胞，因而成为再生医学中器官修复的理想种子细胞。
[0003]
间充质干细胞具有广阔的临床应用前景，可用于治疗神经系统疾病、肝肾损伤、自身免疫疾病、心脏疾病、骨疾病、软骨疾病、缺血性血管疾病、糖尿病并发症和肿瘤等疾病。它们也可用于组织工程和面部整形中。另外，它们也可与造血干细胞共同移植治疗血液疾病。
[0004]
间充质干细胞有三个主要来源：骨髓、脂肪组织、婴儿出生时娩出的胎盘组织，其中，以胎盘中存量最多。婴儿出生后，留存在胎盘中的间充质干细胞可以提取出来，给孩子长期保存，以备他日不时之需，只是因为对干细胞缺乏了解，这种宝贵的健康资源很多就被丢弃了。胎盘间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)是一种多能干细胞，在胚胎发育中来源于中胚层。在机体正常的组织损伤修复过程中，msc是一种重要的参与组织再生的细胞库。在组织损伤引起的特殊信号作用下，msc迁移到受损部位，在局部聚集增殖，依据不同的损伤信号沿着不同途径分化。msc易于分离扩增，体外倍增能力旺盛，即使扩增1亿倍仍能保持其多向分化能力。因此，msc是一种实用的组织修复种子细胞。
[0005]
近年来，以胎盘作为间充质干细胞组织来源的研究越来越多。目前胎盘间充质干细胞已被用于治疗造血干细胞移植引发的移植物抗宿主病，并且已被证实十分具有临床应用前景。瑞典科学家对数十名接受异体造血干细胞移植的患者注射了胎盘间充质干细胞，证实了胎盘间充质干细胞移植的安全性；同时，在治疗上，注射胎盘间充质干细胞可以明显提高移植物抗宿主病患者的存活率。总体来说，胎盘间充质干细胞主要有以下几个方面的优势：1)取材方便，原料来源充足，是生命资源的再生。2)分化能力强可以定向诱导分化为间充质干细胞、血管干细胞、上皮干细胞、神经干细胞和肝干细胞等多种干细胞。3)数量充足，使用方便，增殖能力强，培养后数目可达10亿，可以供多人多次使用。4)在人群中使用不需要配型，不会产生免疫排斥反应，同时，血缘关系越亲近，生物利用度会越高，使用的效果越好。5)治疗疾病范围广，抗衰老，恢复健康体态，心脑血管系统疾病，糖尿病，肝肾损伤，脑及脊髓神经损伤，自身免疫性疾病，移植物抗宿主病等多种疾病。
[0006]
综上所述，间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望,对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。因此，本发明旨在设计提供一种人胎盘间充质干细胞的培养方法。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供一种人胎盘间充质干细胞的培养方法，利用该人胎盘间充质干细胞的培养方法，能够培养人胎盘间充质干细胞，并在培养过程中观察其生长状态，并对培养的细胞进行传代冻存，从而便于熟练掌握细胞培养的整体流程、复苏、换液、传代及冻存操作；通过该培养方法，便于在培养过程中鉴定胎盘间充质干细胞是否具有间充质干细胞特性的操作；此外，本发明对人胎盘间充质干细胞的培养方法进行优化，采用该方方法来培养人胎盘间充质干细胞的培养成本低，培养操作流程简单可靠。
[0008]
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种人胎盘间充质干细胞的培养方法，具体包括以下步骤：
[0009]
s1、获取人胎盘间充质干细胞，采用酶直接消化法从胎盘组织中提取间充质干细胞后进行传代培养，获得p4代人胎盘间充质干细胞，并干细胞专用无血清培养基对获得的p4代人胎盘间充质干细胞进行传代培养；
[0010]
s2、细胞换液，在对p4代人胎盘间充质干细胞进行传代培养过程中，定时观察细胞，并每隔2天进行细胞换液；
[0011]
s3、细胞传代冻存，在进行传代培养的人胎盘间充质干细胞的融合度达到80-90％时，对人胎盘间充质干细胞进行传代冻存；进行细胞冻存的具体方法为：
[0012]
1)采用紫外光对超净台提前照射30min，并将无血清培养基、带血清培养基和胰蛋白酶放置于37℃恒温水浴锅15min；
[0013]
2)吸出培养瓶中的培养基，采用2mlpbs将其清洗两次；
[0014]
3)吸出pbs，并向培养瓶中加入1ml胰蛋白酶；
[0015]
4)旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待胰蛋白酶反应1～2min后，在倒置显微镜下观察细胞的形态；
[0016]
5)向培养瓶中加入1ml带血清培养基终止反应，并进行第一次吹打混合后(10次左右)吸取15ml细胞悬液转移至离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心操作；
[0017]
6)弃去离心管中的上清，加入1ml无血清培养基，在吹打混合(15次左右)后，采用移液枪取900ul细胞悬液于冻存管，并加100uldmso，再次进行吹打混合，然后进行封口膜封口，并立即放入程序降温盒中，保存温度为-80摄氏度，在程序降温盒中保存一夜后，将其放入液氮罐中保存；
[0018]
其中，在对人胎盘间充质干细胞进行冻存时，对细胞进行计数。
[0019]
进一步地，步骤s3中所述的细胞计数的具体方法为：
[0020]
a、采用紫外光对超净台提前照射30min，并将无血清培养基、带血清培养基和胰蛋白酶放置于37℃恒温水浴锅15min；
[0021]
b、吸出培养瓶中的培养基，采用2mlpbs将其清洗两次；
[0022]
c、吸出pbs，并向培养瓶中加入1ml胰蛋白酶；
[0023]
d、旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待胰蛋白酶反应1～2min后，在倒置显微镜下观察细胞的形态；
[0024]
e、向培养瓶中加入1ml带血清培养基终止反应，并在进行吹打混合后(10次左右)吸取15ml细胞悬液转移至离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心，其中，离心的转速为1000rpm，温度为24℃，时间为8min；
[0025]
f、弃去离心管中的上清液，加入1ml培养基，并对其进行吹打混合(15次左右)；
[0026]
g、在进行吹到混合后，采用移液枪取10ul细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板置于倒置显微镜下，对细胞进行计数，其中，分别计数4个16小方格的细胞数量，并取其平均数，细胞密度为该平均数乘以104。
[0027]
进一步地，步骤s3中的步骤5)中所述的离心操作的离心的转速为1000rpm，温度为24℃，时间为8min。
[0028]
进一步地，步骤s3中所述的细胞计数的具体方法还包括：在进行细胞计数后，采样适量培养基稀释细胞悬液，并将其重新接种于25t的培养瓶中。
[0029]
进一步地，细胞计数后，对其进行接种的密度为50％左右。
[0030]
进一步地，步骤s3中所述的带血清培养基为含血清的dmem培养基。
[0031]
综上所述，本发明具有以下有益效果：利用该人胎盘间充质干细胞的培养方法，能够培养人胎盘间充质干细胞，并在培养过程中观察其生长状态，并对培养的细胞进行传代冻存，从而便于熟练掌握细胞培养的整体流程、复苏、换液、传代及冻存操作；通过该培养方法，便于在培养过程中鉴定胎盘间充质干细胞是否具有间充质干细胞特性的操作；此外，本发明对人胎盘间充质干细胞的培养方法进行优化，采用该方方法来培养人胎盘间充质干细胞的培养成本低，培养操作流程简单可靠。
附图说明
[0032]
图1是本发明实施例中的流程图；
[0033]
图2是本发明实施例中胎盘间充质干细胞明场图；
[0034]
图3是本发明实施例中胎盘间充质干细胞的免疫荧光鉴定图；
[0035]
图4是本发明实施例中胎盘间充质干细胞的生长曲线图。
具体实施方式
[0036]
以下结合附图1-4对本发明作进一步详细说明。
[0037]
实施例：一种人胎盘间充质干细胞的培养方法，如图1所示，具体包括以下步骤：
[0038]
s1、获取人胎盘间充质干细胞，采用酶直接消化法从胎盘组织中提取间充质干细胞后进行传代培养，获得p4代人胎盘间充质干细胞，并干细胞专用无血清培养基对获得的p4代人胎盘间充质干细胞进行传代培养。
[0039]
s2、细胞换液，在对p4代人胎盘间充质干细胞进行传代培养过程中，定时观察细胞，并每隔2天进行细胞换液(由于无血清培养基不会变色，故每隔两天需要进行细胞换液，需要经常观察细胞，避免细胞密度过大，开始凋亡)。
[0040]
s3、细胞传代冻存，在进行传代培养的人胎盘间充质干细胞的融合度达到80-90％时，对人胎盘间充质干细胞进行传代冻存。进行细胞冻存的具体方法为：
[0041]
1)采用紫外光对超净台提前照射30min，并将无血清培养基、带血清培养基和胰蛋白酶放置于37℃恒温水浴锅15min。
[0042]
2)吸出培养瓶中的培养基，采用2mlpbs(磷酸盐缓冲液)将其清洗两次。
[0043]
3)吸出pbs，并向培养瓶中加入1ml胰蛋白酶。
[0044]
4)旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待胰蛋白酶反应1～2min
后，在倒置显微镜下观察细胞的形态(胰蛋白酶消化时间在2min左右，可通过在显微镜下观察细胞形态变化掌握消化时间)。
[0045]
5)向培养瓶中加入1ml带血清培养基终止反应(也可以用胰蛋白酶抑制剂终止反应)，并进行第一次吹打混合后吸取15ml细胞悬液转移至离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心操作，其中吹打混合的次数为10次左右。
[0046]
6)弃去离心管中的上清，加入1ml无血清培养基，再次进行吹打混合后，吹打混合的次数为15次左右，然后采用移液枪取900ul细胞悬液于冻存管，并加100uldmso(二甲基亚砜/冻存保护剂)，再次进行吹打混合，然后进行封口膜封口，并立即放入程序降温盒中，保存温度为-80摄氏度，在程序降温盒中保存一夜后，将其放入液氮罐中保存。
[0047]
其中，在对人胎盘间充质干细胞进行冻存时，对细胞进行计数。
[0048]
步骤s3中的细胞计数的具体方法为：
[0049]
a、采用紫外光对超净台提前照射30min，并将无血清培养基、带血清培养基和胰蛋白酶放置于37℃恒温水浴锅15min。
[0050]
b、吸出培养瓶中的培养基，采用2mlpbs将其清洗两次。
[0051]
c、吸出pbs，并向培养瓶中加入1ml胰蛋白酶。
[0052]
d、旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待胰蛋白酶反应1～2min后，在倒置显微镜下观察细胞的形态。
[0053]
e、向培养瓶中加入1ml带血清培养基终止反应，并在进行吹打混合后(吹打混合的次数为10次左右)吸取15ml细胞悬液转移至离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心，其中，离心的转速为1000rpm，温度为24℃，时间为8min。
[0054]
f、弃去离心管中的上清液，加入1ml培养基，并对其进行吹打混合(吹打混合的次数为15次左右)。
[0055]
g、在进行吹到混合后，采用移液枪取10ul细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板置于倒置显微镜下，对细胞进行计数，其中，分别计数4个16小方格的细胞数量，并取其平均数，细胞密度为该平均数乘以104。
[0056]
步骤s3中的步骤5)中的离心操作的离心的转速为1000rpm，温度为24℃，时间为8min。
[0057]
步骤s3中的细胞计数的具体方法还包括：在进行细胞计数后，采样适量培养基稀释细胞悬液，并将其重新接种于25t的培养瓶中。
[0058]
在进行细胞计数后，对其进行接种的密度为50％左右，避免细胞密度太低不利于细胞的生长。如图2所示，其反应了人胎盘间充质干细胞接种在25t培养瓶中的生长情况。其结果为：人胎盘间充质干细胞接种后24h可见贴壁细胞,形态为成纤维细胞样,漩涡状生长。细胞生长速度快，但受接种密度影响。密度为50％即第2天时开始迅速增长。
[0059]
步骤s3中的带血清培养基为含血清的dmem培养基(为一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)。
[0060]
对培养的细胞进行细胞鉴定的具体方法如下：
[0061]
1、将培养细胞用胰蛋白酶重悬后按照每孔4000个细胞的密度接种到96孔板。
[0062]
2、培养细胞48h后吸去培养基。
[0063]
3、用pbs清洗两次后用4％多聚甲醛固定细胞20min。
[0064]
4、采用pbs清洗3次每次5min。
[0065]
5、每孔加100ul的5％的羊血清和0.3％triton-x100封闭液，将96孔板放在湿盒中于37℃孵育30min。
[0066]
6、加一抗。抗体分别为：cd44，cd45，cd90。将抗体稀释在2％羊血清中，稀释倍数1:100。
[0067]
将抗体暗下面的分组每孔30ul加入96孔板中。在湿盒中于4℃孵育18h。其分组对照如下表1。
[0068]
表1
[0069]
分组抗体孔阴性对照无，加2％羊血清1cd45+cd90 3cd44 3
[0070]
7、pbs清洗3次每次5min。
[0071]
8、孵二抗。抗体分别为g&r488，g&m594。将两种抗体一起稀释在2％羊血清中，稀释倍数1:200。每孔加30ul加入96孔板中。在湿盒中于37℃孵育1h。
[0072]
9、pbs清洗3次每次5min。
[0073]
10、吸干pbs。每孔加10uldapi染色液。
[0074]
11、在荧光显微镜下拍照，其胎盘间充质干细胞的免疫荧光鉴定结果如图3所示。
[0075]
如图3所示，间充质干细胞没有特异性表面抗原，表达cd29，cd44，cd71，cd90等基质细胞和间质细胞的特异性表面抗原，不表达cd45，cd34等抗原。选择了cd90，cd44和cd45进行实验，从图3中实验结果能够看出培养胎盘干细胞为cd90+cd44+cd45-细胞，符合间充质干细胞特征。
[0076]
如图4所示，接种96孔板每孔2000细胞，检测了胎盘间充质干细胞p4、p5和p6代的生长曲线。由图4可以看出，p4和p5代细胞都是在前3天迅速生长，第3天到第4天的生长速度最快，第4天之后细胞长到80％左右，生长速度变慢，第5天到达平台期。p6代细胞生长速度慢一点，第6天到达平台期。
[0077]
该人胎盘间充质干细胞的培养方法，能够培养人胎盘间充质干细胞，并在培养过程中观察其生长状态，并对培养的细胞进行传代冻存，从而便于熟练掌握细胞培养的整体流程、复苏、换液、传代及冻存操作。通过该培养方法，便于在培养过程中鉴定胎盘间充质干细胞是否具有间充质干细胞特性的操作。此外，本发明对人胎盘间充质干细胞的培养方法进行优化，采用该方方法来培养人胎盘间充质干细胞的培养成本低，培养操作流程简单可靠。
[0078]
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。