猪圆环病毒2d型CAP蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪圆环病毒2d型cap序列及用该序列编码的cap蛋白制备的亚单位疫苗及其应用。

背景技术：

猪圆环病毒2型(porcinecircovirus2,pcv2)的感染能够引起猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome,pmws)。该病多发生在5-12周龄的保育猪，临床主要表现为呼吸困难、喘气、皮肤苍白及消瘦。2005年以前我国流行的毒株主要为pcv2a及pcv2b型，2005年以后pcv2b逐渐增多，导致更严重的pmws，近年来pcv2d逐渐增多呈流行趋势。

pcv2属于单股负链环状dna病毒，基因组全长1767bp或者1768bp，其中orf2编码大小为233-234个氨基酸病毒的核衣壳蛋白cap，cap蛋白是主要的免疫原性蛋白。昆虫杆状病毒表达系统(insectbaculovirusexpressionvectorsystem，ibevs)是一种高效的真核表达系统，能进行蛋白质的加工修饰，表达产物与天然蛋白接近，具有很强的生物活性。

目前，市场上pcv2的疫苗主要是针对pcv2a和pcv2b的亚单位疫苗和灭活疫苗，本发明利用分离的pcv2d毒株的cap序列，利用ibevs进行表达；cap-2d抗原与佐剂乳化制备成猪圆环cap-2d亚单位疫苗，能够抵抗目前流行的猪圆环pcv2d毒株的攻击。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2d型cap蛋白，及用该cap-2d蛋白制备亚单位疫苗及其应用。

本发明提供了一种猪圆环病毒的2d型cap蛋白，所述2d型cap蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示，编码该cap蛋白的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还设计了一种重组杆状病毒的转移载体，所述转移载体包含一个或多个编码2d型cap蛋白的基因序列，所述基因序列按照昆虫细胞密码子偏爱性优化合成pcv2d-cap-dc核苷酸序列，如seqidno.3所示。本发明通过将pcv2d-cap-dc核苷酸序列与杆状病毒表达载体pfastbac11连接，构建能表达猪圆环病毒pcv2d毒株衣壳蛋白cap-2d的杆状病毒表达载体pfastbac11-pcv2d-cap-dc，该载体通过转化dh10bac制备重组杆粒，杆粒转染sf9，收获重组cap-2d杆毒pcv2d-cap-dc-rbv,该毒株的建议分类命名为核型多角体病毒nucleopolyhedovirussp.,于2020年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmccno.20712。

同时本发明设计了上述重组杆状病毒的构建方法，构建方法包括以下步骤，

(1)人工合成一段基因序列pcv2d-cap-dc，该序列根据昆虫细胞密码子偏爱性进行优化，优化合成的pcv2d-cap-dc序列如seqidno.3所示；

(2)bamhi和xbaⅰ酶切上述pcv2d-cap-dc序列和pfastbac11载体，回收酶切后的pcv2d-cap-dc序列和pfastbac11载体片段，连接、转化、克隆pcr并进行测序验证，构建pfastbac11-pcv2d-cap-dc表达载体；

(3)将pfastbac11-pcv2-cap-2d-dc表达载体转化dh10bac，通过蓝白斑筛选以及pcr鉴定获得重组杆粒pcv2d-cap-dc-rbacmid；

(4)将重组杆粒pcv2d-cap-dc-rbacmid转染sf9细胞，收毒，获得能够高效表达猪圆环病毒2d亚型cap蛋白的重组杆状病毒，命名为pcv2d-cap-dc-rbv。

同时本发明专利还将上述pcv2d-cap-dc-rbv在昆虫细胞h5中高效表达pcv2d-cap-dc蛋白，该蛋白用于制备猪圆环cap-2d亚单位疫苗，其步骤为，将重组pcv2d-cap-dc-rbv经h5细胞培养后，离心，收集上清，弃沉淀。测pcv2-2d-cap-dc含量，经bei灭活后，与isa206佐剂按1:1比例混合乳化，得到猪圆环cap-2d亚单位疫苗。

所述猪圆环pcv2d-cap-dc亚单位疫苗cap蛋白含量为10-50ug/ml，优选的，cap蛋白含量为25ug/ml。

经上述方法制得的猪圆环pcv2d-cap-dc亚单位疫苗可用来预防由猪圆环病毒引起的相关疾病。

相对于现有技术，本发明专利的进步之处在于，所选用的序列为pcv2流行毒株2d亚型的cap全序列，包含了核定位序列，经过昆虫细胞密码子偏爱性优化，该序列在杆状病毒中的表达为可溶性表达，能够更好的在感染的昆虫细胞中高效表达，且表达量可以达到180ug/ml，远高于现有工艺中应用的序列的表达量，能更好的应用于猪圆环病毒亚单位疫苗的生产应用，降低成本，提高产量。配制成的猪圆环cap-2d亚单位疫苗免疫原好，能产生较高的中和抗体，可抵抗106tcid50/mlpcv2d-hb强毒株攻击。

附图说明

图1质粒pfastbac11-pcv2d-cap-dc鉴定结果，其中m为markerbm8000；泳道1-3依次为pfastbac11-pcv2d-cap-dc质粒、pfastbac11-pcv2-cap-2d-dc(bamhi+xbai)双酶切，pcr扩增cap序列产物。

图2cap蛋白在h5中表达的sds-page检测结果，其中m为marker，大小依次为100kda，75kda，63kda，48kda，35kda。泳道1为cap蛋白检测结果，泳道2为h5细胞对照，泳道3为扩增的p3代种毒检测结果。

图3猪圆环cap-2d在h5中表达量的灰度分析图，其中m为marker。泳道1-5为cap蛋白标准品浓度为150ug/ml，其中泳道1-5上样量分别为0.625ul、1.25ul、2.5ul、5ul、10ul；泳道6-8为cap-2d测试样品，上样量为5ul、10ul、15ul。

图4猪圆环cap-2d免疫仔猪血清抗体elisa检测结果，其中判定标准为od450nm≥0.4为阳性，od450nm<0.3判定为阴性。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明实施列中所使用的试剂均为市售产品。

本发明试剂、菌株和质粒来源名单如下：

本发明所用pfastbac11杆状病毒表达载体由北京鼎持生物技术有限公司构建和保存；

昆虫细胞sf9和h5购自invitrogen公司；

昆虫细胞培养基ib905均购自壹生科(深圳)有限公司；

isa206vg佐剂购自于赛彼科(上海)特殊化学品有限公司；；

96孔细胞培养板购自康宁公司；

猪圆环抗体elisa检测试剂盒购自北京金诺百泰生物技术有限公司；

easypfudna聚合酶、dntp以及核酸电泳marker购于全式金生物技术公司；

感受态细胞dh5α购自于博迈德生物技术有限公司；

质粒小提试剂盒、质粒大提试剂盒、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒购自天根生化公司；

t4dna连接酶和各种限制性内切酶购自neb公司；

pcv2d-cap-dc基因序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

实施例一

构建表达载体pfastbac11-pcv2d-cap-dc

1.pcv2d-cap-dc序列合成

以临床病料中分离的猪圆环病毒基因组为模板，人工合成pcv2-cap序列，进行测序，其序列如seqidno.1所示,其所编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。根据测序结果和昆虫细胞密码子偏爱性进行pcv2-cap优化和合成，序列两端添加bamhi和xbai酶切位点，序列如seqidno.3所示。

2.pfastbac11-pcv2d-cap-dc杆状病毒表达质粒构建

bamhi和xbaⅰ酶切pcv2-cap序列以及pfastbac11表达载体，回收酶切片段，然后连接，转化dh5α，克隆挑选，酶切验证构建的pfastbac11-pcv2d-cap-dc载体,图1为质粒pfastbac11-pcv2d-cap-dc鉴定结果。pcr、酶切、连接、转化、测序等均为分子生物学常规方法，具体请参考《分子克隆试验操作手册》。图1的结果表明pfastbac11-pcv2d-cap-dc表达载体构建成功。

实施例二

杆粒制备

将实施例1制备的pfastbac11-pcv2d-cap-dc杆状病毒重组表达载体转化感受态细胞dh10bac，37℃培养后，使用蓝白斑筛选法并进行pcr鉴定，获得pcv2d-cap-dc-rbacmid重组杆粒。杆粒转化和筛选方法参考invitrogen公司bac-to-bac^tm杆状病毒表达系统用户指南进行操作。

实施例三

1.重组杆状病毒收获及pcv2d-cap-dc蛋白表达鉴定

将实施例二中获得的pcv2d-cap-dc-rbacmid重组杆粒利用转染试剂expifectaminesf，转染处于对数生长期的sf9细胞，6孔板中27℃静止贴壁培养72h后，收获p1代的重组杆状病毒pcv2d-cap-dc-rbv。其中pcv2d-cap-dc-rbv毒株于2020年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.20712。

将收获的p1代重组杆状病毒继续在sf9细胞上进行传代，t25细胞瓶27℃静止贴壁培养72h后，收p2代毒，按10％的接毒量接p3代毒，27℃悬浮培养72h后收p3代毒，上清为病毒液，通过间接免疫荧光测病毒液毒价。按照接毒量为0.01moi，用p3代重组杆毒感染h5细胞，细胞密度为2ⅹ10⁶cells/ml，培养温度为27℃，转速为120r/min，培养7d，细胞自然破碎，离心，上清为抗原液。同时对抗原液、h5细胞对照及p3代病毒液进行sds-page检测，结果如图2所示。同时对蛋白表达量进行了灰度分析，结果如图3所示，pcv2蛋白表达量为180μg/ml。

实施例四

1.猪圆环cap-2d亚单位疫苗制备

将实施例3制备的抗原液加入灭活剂bei，bei终浓度为1mmol/l，置37℃灭活48小时。然后将抗原液用pbs稀释后与佐剂isa206以1:1混合乳化，制成猪圆环cap-2d亚单位疫苗，疫苗抗原含量为25μg/ml。

2.猪圆环cap-2d亚单位疫苗靶动物评价试验

用28日龄健康易感仔猪10头，随机分成2组，每组5头。免疫组颈部肌肉注射疫苗，2.0ml/头；对照组各颈部肌肉注射生理盐水，2.0ml/头，隔离饲养。免后21日、35日采血，分离血清，用elisa法检测血清抗体效价。于免后35日用检验用强毒pcv2-hb株攻击，攻毒剂量为10^6.0tcid50/ml,每头滴鼻1ml,肌肉注射2ml，隔离饲养，攻毒后临床观察28日，并于攻毒后28日称量体重，计算相对增重率，其计算公式如下。

相对增重率(％)＝(免疫攻毒组平均日增重-对照攻毒组平均日增重)/对照攻毒组平均日增重ⅹ100％

增重统计结果如表1所示，

表1

免疫后35天观察期内免疫猪健康状况良好，与非免疫猪一致，未出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应，此结果表明该疫苗对靶动物猪是安全的。同时用elisa方法测定免疫后21日和35日免疫组和对照组仔猪血清中中和抗体效价。如图4所示，免疫组5头试验猪elisa抗体检测均为阳性，对照组均为阴性。

攻毒后，攻毒对照组仔猪主要表现为一过性食欲减退、被毛粗糙等，7日后基本恢复正常；而疫苗免疫组攻毒后，采食、饮水、精神、粪便未见异常。如表1所示试验免疫组仔猪日增重率为12.79％，表明通过疫苗免疫可有效抵御强毒攻击引起的猪只增重率下降。

本发明专利提供了一种猪圆环流行毒株pcv2d亚型的cap序列及该序列在制备cap-2d亚单位疫苗方面的应用。本发明制备的亚单位疫苗能够产生较高的中和抗体，同时能够抵抗pcv2强毒攻击。

上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。

序列表

<110>浙江鼎持生物制品有限公司北京鼎持生物技术有限公司

<120>猪圆环病毒2d型cap蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用

<141>2020-11-26

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>705

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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