一种高产的流感病毒制备体系及制备方法与流程

[0001]
本发明涉及病毒制备方法领域，尤其涉及一种高产的流感病毒制备体系及制备方法。


背景技术：

[0002]
流行性感冒是人类至今尚不能有效控制的传染病之一，其特点是在短期内突然爆发，迅速蔓延，造成不同程度的流行。除感染人外，流感病毒在动物体内也广泛存在并能引起猪、鸡、马等动物发病，导致动物的大量死亡。虽然有少数抗病毒药物对流感病毒的感染有一定疗效，但并不能完全消除流感病毒给人类造成的威胁，因此疫苗接种仍然是预防流感的得力措施。
[0003]
目前接种传统的鸡胚灭活疫苗仍是预防流感的主要措施，但是基于哺乳动物细胞培养的流感疫苗在欧美国家已经上市,有替代传统疫苗的趋势。由于生产疫苗的哺乳动物细胞能够利用生物反应器进行大规模培养，同时与鸡胚来源的疫苗比较，在细胞上得到的流感疫苗可以产生较强的体液免疫反应和细胞免疫反应。近年来who积极支持和鼓励以哺乳动物细胞为基质生产流感疫苗。本申请建立了利用缺失march8的mdck细胞系制备流感病毒的方法，提高了流感病毒在哺乳动物细胞中的产量。同时，本申请建立了利用m2突变体构建流感病毒高产毒株的体系，提高了流感病毒在mdck细胞及鸡胚中的产量，为满足市场对流感疫苗的需求提供新的技术方法。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供一种高产的流感病毒制备体系及制备方法，提高了流感病毒的产毒滴度。
[0005]
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006]
本发明首先提供了一种高产的流感病毒制备体系，利用缺失march8 的mdck细胞系制备流感病毒或利用m2突变体制备高产毒株。其中：
[0007]
缺失march8的mdck细胞系采用crispr-cas方法敲除内源 march8。
[0008]
包含m2突变体的高产毒株为m2 k78r突变的毒株，例如a/pr8毒株。
[0009]
所述制备流感病毒的哺乳动物细胞为mdck细胞但不仅限于mdck 细胞。
[0010]
本发明还提供了一种高产的流感病毒制备方法，该方法利用缺失 march8的mdck细胞系制备或利用包含m2突变体的高产毒株制备。其中：
[0011]
利用缺失march8的mdck细胞系制备流感病毒的步骤包括：
[0012]
a1、lenticrispr-gmarch8质粒的构建；
[0013]
a2、制备转导用假病毒；
[0014]
a3、筛选缺失march8的mdck细胞系；
[0015]
a4、在缺失march8的mdck细胞中扩增流感病毒。
[0016]
利用包含m2突变体的高产毒株制备流感病毒的步骤包括：
[0017]
b1、march8对m2及m2突变体蛋白表达的影响；
[0018]
b2、免疫共沉淀co-ip检测m2的泛素化；
[0019]
b3、利用反向遗传学制备m2 k78r突变的流感病毒；
[0020]
b4、利用m2 k78r突变制备的流感病毒，在mdck细胞或鸡胚中扩增。
[0021]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0022]
本发明提供的高产的流感病毒制备体系及制备方法，一方面利用缺失 march8的mdck细胞进行流感病毒的制备，提高了产毒滴度，优化了基于哺乳动物细胞的流感病毒制备体系。另一方面利用不受march8影响的带有m2突变的高产毒株进行流感病毒的制备，提高了在哺乳动物细胞和鸡胚中制备的流感病毒的产量，优化了利用哺乳动物细胞和鸡胚制备流感病毒的方法。
附图说明
[0023]
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024]
图1为本发明实施例1提供的构建march8缺失的mdck细胞 western blot检测结果。其中，ctrl为对照细胞，ko march8#1、komarch8#2为缺失march8的mdck细胞。
[0025]
图2本发明实施例1提供的在缺失march8的mdck细胞中扩增 a/pr8病毒结果。其中，ctrl为对照细胞，ko march8#1、ko march8 #2为缺失march8的mdck细胞。**p<0.01。
[0026]
图3本发明实施例2提供的march8降解流感病毒m2蛋白的结果。
[0027]
图4本发明实施例2提供的march8和突变体w114a影响流感病毒 m2蛋白表达的结果。
[0028]
图5本发明实施例2提供的march8减少m2在质膜上分布的情况。 **p<0.01，ns：无显著差异。
[0029]
图6本发明实施例2提供的march8通过泛素化m2介导其降解的结果。
[0030]
图7本发明实施例2提供的march8促进m2经溶酶体途径降解结果。其中，dmso为对照，mg132为蛋白酶体抑制剂处理细胞，cq为溶酶体抑制剂处理细胞。
[0031]
图8本发明实施例2提供的m2细胞质区中赖氨酸位点及赖氨酸突变示意图。
[0032]
图9本发明实施例2提供的m2及相关赖氨酸突变体在膜表面表达的阳性细胞相对占比，m2 k78r突变体表达不受march8影响。**p<0.01， ns：无显著差异。
[0033]
图10本发明实施例2提供的m2及相关赖氨酸突变体被march8泛素化实验结果，k78是m2被march8泛素化的主要位点。
[0034]
图11本发明实施例2提供的m2 k78r突变的a/pr8病毒在mdck 细胞中扩增能力增强。**p<0.01。
[0035]
图12本发明实施例2提供的m2 k78r突变的a/pr8病毒在鸡胚中扩增能力增强。**p<0.01。
具体实施方式
[0036]
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本
发明作进一步的详细介绍。
[0037]
本发明使用的hek293、hek293t、mdck细胞用含10％胎牛血清、 100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem培养液，在37℃，5％co2培养箱中培养，每2-3天传代一次。
[0038]
实施例1建立march8缺失的mdck细胞
[0039]
1、方法
[0040]
1.1缺失march8的mdck细胞系的建立
[0041]
1.1.1 lenticrispr-gmarch8质粒的构建
[0042]
针对march8基因，通过网站http://www.e-crisp.org/e-crisp/设计 grna序列，包括gmarch8#1和gmarch8#2。
[0043]
gmarch8#1序列：gtaagaccaaagaaaaggag
[0044]
gmarch8#2序列：gagctcgcagcagcgcgtgt
[0045]
通过分子克隆将两条靶向march8的grna序列导入lenticrispr-v2 中，获得lenticrispr-gmarch8质粒。
[0046]
1.1.2制备转导用假病毒
[0047]
hek293t细胞(4
×
106)接种在10cm培养板中培养过夜，细胞生长密度达到60％～70％时，转染vsv-g、pspax2质粒及 lenticrispr-gmarch8或lenticrispr-v2对照质粒。48h后，收获包装了 crispr-gmarch8的假病毒上清，3000g离心10min去掉细胞碎片，分装保存于-80℃冰箱。
[0048]
1.1.3筛选缺失march8的mdck细胞系
[0049]
mdck细胞(4
×
106)接种在六孔板中培养过夜，加入1ml上述假病毒颗粒进行转导。48h后加入0.6μg/ml嘌呤霉素(puromycin)进行筛选。两周后获得缺失march8的mdck细胞系。
[0050]
1.2在缺失march8的mdck细胞中扩增a/pr8病毒，并检测病毒滴度
[0051]
在dmem中生长良好的缺失march8的mdck细胞(ko march8 #1、ko march8#2)及对照细胞ctrl，转接到75cm2培养瓶中，第二天长到90％密度时，以pbs液洗涤两次；将p1代a/pr8病毒感染细胞(moi ＝0.002)，室温吸附1h，pbs液洗涤两次；加入病毒维持液37℃培养3d，收集病毒培养上清，空斑法检测新生病毒滴度。
[0052]
2、结果
[0053]
2.1建立march8缺陷的mdck细胞系
[0054]
经过嘌呤霉素筛选，最终获得的缺失march8的mdck细胞，利用 western blot检测内源march8蛋白的表达，与对照ctrl相比，缺失 march8的mdck细胞(ko march8#1、ko march8#2)中march8 蛋白的表达明显降低(如图1所示)。
[0055]
2.2在缺失march8的mdck细胞中扩增a/pr8病毒，提高产毒滴度
[0056]
将野生型a/pr8病毒p1代以moi＝0.002分别接种于对照或缺失 march8的mdck细胞，在72h收集病毒上清，并通过空斑法检测病毒滴度，发现a/pr8病毒在缺失march8的mdck细胞中产毒能力增强，最终获得病毒滴度达到8
×
106pfu/ml，比对照mdck细胞中产毒滴度提高了8倍(如图2所示)。
[0057]
实施例2构建m2突变体获得不受march8影响的高产毒株
[0058]
1、方法
[0059]
1.1检测m2蛋白的表达
[0060]
1.1.1流感病毒感染
[0061]
在hek293(5
×
105)细胞中转染march8或对照质粒vector 24h；感染a/pr8病毒(moi＝2.0)8h。
[0062]
1.1.2 western blot检测m2总蛋白的表达
[0063]
收取感染细胞，3000rpm离心3min，pbs洗一次，加入100μl细胞裂解液ripa，-20℃保存备用。制备蛋白样品，并进行sds-page电泳，western blot检测m2蛋白的表达。
[0064]
1.1.3流式细胞术检测质膜上m2蛋白的表达
[0065]
收取感染细胞，3000rpm离心3min，pbs洗一次，m2抗体4℃结合 1h，冷的pbs洗1次，alexagoat anti-mouse荧光二抗避光4℃结合30min，pbs洗1次，4％多聚甲醛室温固定细胞15min，pbs洗1次，细胞重悬于300μl pbs中，通过流式细胞仪检测质膜上m2蛋白的分布。
[0066]
1.2免疫共沉淀co-ip检测m2的泛素化
[0067]
hek293t细胞(4
×
106)接种在10cm培养板中培养过夜，细胞生长密度达到60％～70％时，转染flag-march8、ha-ub质粒及不同m2突变体。48h后，收获细胞，加入ripa裂解，离心后取裂解液上清加入m2抗体及磁珠4℃混4h，取出后离心，加入ripa洗4次，最后加入2xloadingbuffer，98℃煮10min，取上清进行sds-page及western blot实验检测泛素化(带有ha标签的ubiquitin)情况。
[0068]
1.3利用反向遗传学制备m2 k78r突变的a/pr8病毒
[0069]
在6孔板中以1:1比例接种5
×
105hek293t细胞和5
×
105mdck细胞。培养24h后，更换为1ml opti-mem培养基。转染a/pr8病毒反向遗传系统(其中编码m片段的质粒为野生型或携带m2 k78r突变)，每质粒转染量为1μg，转染试剂为lipofectamine2000，根据使用说明书，每孔使用 16μl。转染24h后，补充1ml含有0.1％tpck胰酶的opti-mem培养基。 48h后收上清，3000g离心10min去掉细胞碎片后0.45μm滤膜过滤，分别标记为p0代病毒，分装保存于-80℃冰箱。
[0070]
1.5利用鸡胚扩增病毒
[0071]
将100μl p0代病毒注入10～12日龄的鸡胚，并于37℃温箱内孵育72 h。收获前将鸡胚置-20℃冰箱1h左右处死，用毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水，平均每胚可收获0.5～1.0ml含有病毒的羊水，空斑法检测新生病毒滴度。
[0072]
1.6利用mdck细胞扩增病毒
[0073]
dmed培养液中生长良好的mdck细胞，转接到75cm2培养瓶中，第二天长到90％密度时，以pbs液洗涤两次；将收集的p0代病毒感染细胞(moi＝0.002)，室温吸附1h，pbs液洗涤两次；加入病毒维持液37℃培养3d，收集病毒培养上清，空斑法检测新生病毒滴度
[0074]
2、结果
[0075]
2.1 march8减少病毒感染后m2蛋白的表达
[0076]
通过瞬时转染在hek293细胞中过表达march8或其对照质粒，以 moi＝2.0感染a/pr8病毒4和6小时后，收集细胞通过western blot检测，发现march8可以显著降低m2的表达，而对于其它病毒蛋白ha、na、 np的表达均无明显影响(如图3所示)。march8是一种位于膜上的e3 泛素连接酶，w114a是其酶活性缺失的突变体，通过在hek293细胞中分别共转染
vector、march8或w114a与m2，发现march8酶活性缺失的突变体w114a不能降低m2的表达，表明march8对m2的下调依赖其e3酶活性(如图4所示)。
[0077]
2.2 march8减少m2在质膜上分布
[0078]
利用抗体标记质膜上的m2蛋白并通过流式细胞术检测发现， march8能够显著减少质膜上m2的分布，酶活性缺失的突变体w114a 则不能(如图5所示)。
[0079]
2.3 march8下调m2的分子机制
[0080]
hek293t细胞转染flag-march8、ha-ub质粒及不同m2突变体后，进行泛素化实验，结果表明march8能够泛素化修饰m2而酶活性缺失的突变体w114a则不能(如图6所示)。此外，在hek293t细胞转染march8 及m2后，分别加入蛋白酶体抑制剂mg132或溶酶体抑制剂cq处理细胞，发现在加入溶酶体抑制剂cq后，march8对m2的下调明显受到抑制，而加入对照dmso或蛋白酶体抑制剂mg132后，march8对m2的下调不受影响，表明march8促进m2经溶酶体途径降解(如图7所示)。
[0081]
泛素化修饰主要发生在胞内区的赖氨酸残基，而m2的胞内区主要有4 个赖氨酸残基：k49，k56，k60，k78。据此我们构建了这四个位点分别突变为精氨酸(k49r，k56r，k60r和k78r)以及全部突变为精氨酸的突变体k/r(如图8所示)。将m2及其不同突变体分别与march8共同表达于hek293t细胞，通过流式细胞术检测细胞表面m2的表达，发现m278位突变为精氨酸的突变体k78r及4个赖氨酸全部突变为精氨酸的 k/r不受march8的下调(如图9所示)，表明k78是march8介导 m2降解的关键氨基酸残基。同时，泛素化实验表明，k78是march8泛素化m2的关键氨基酸(如图10所示)。
[0082]
2.4利用m2 k78r突变制备的a/pr8病毒，在mdck细胞及鸡胚中扩增的滴度提高
[0083]
构建携带m2 k78r的m片段质粒，通过反向遗传学获得m2 k78r的 a/pr8病毒p0代。将野生型和m2 k78r突变的a/pr8病毒p0代以 moi＝0.002接种于mdck细胞，在72h收集病毒上清，并通过空斑法检测病毒滴度，发现m2 k78r突变病毒在mdck细胞中复制能力显著增强，获得病毒滴度达到6
×
106pfu/ml，比野生型病毒产量提高了6倍(如图11 所示)。同时，将m2 k78r突变病毒在鸡胚中扩增，最终在鸡胚中获得病毒滴度达到4
×
108pfu/ml，比野生型病毒产量提高了4倍(如图12所示)。
[0084]
综上，本发明的方法或体系，在缺失march8的mdck细胞中扩增 a/pr8病毒，可以提高产毒滴度，或者，利用m2 k78r突变制备的a/pr8 病毒，在mdck细胞及鸡胚中扩增的滴度也得到了极大的提高。
[0085]
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。