一种酶法生产莱鲍迪苷B的方法与流程

一种酶法生产莱鲍迪苷b的方法
技术领域
[0001]
本发明涉及一种酶法生产莱鲍迪苷b的方法，属于生物合成技术领域。


背景技术：

[0002]
在甜菊糖苷类化合物中，莱鲍迪苷a(ra)已广泛用作食品饮料中的甜味剂。但其缺点是带有天然的后苦味或青草味，这也限制了其的进一步代糖使用。
[0003]
莱鲍迪苷b(rb)也是甜菊糖苷中的甜味成分之一。甜度与ra相当，而后苦味弱于后者，因此rb的口感要优于ra，除了作为甜味剂之外，研究发现其还具有降血糖的功效，是一种具有较大应用潜力的甜菊糖苷化合物。但rb在甜菊糖苷中的含量很小，不到1％。如果植物提取的方式来获取rb，受到原料产量和成本的限制，难以大量生产和推广使用。
[0004]
由于在甜菊叶中的含量较低，所以目前rb的制备方法主要是通过氢氧化钠水解ra、rd、ri等结构相近的甜菊糖得到，比如中国专利cn104725437a。化学水解法具有反应条件极端、产生大量危废试剂、环保压力大等劣势，随着技术的发展，用生物酶法代替化学法进行生产，也是大势所趋。
[0005]
公开号为cn102796790a的中国发明专利公开了甜菊双苷转化为莱鲍迪苷b的方法，以甜菊双苷为原料，以蔗糖为糖源，在黑曲酶ⅲ的催化下转化为莱鲍迪苷b。该方法需要采用特定的黑曲酶ⅲ为催化剂，以甜菊双苷为原料，且需加入额外的糖源，其原料成本较高，且该方法得到莱鲍迪苷b的转化率为70～75％之间，转化率有待进一步提高。


技术实现要素：

[0006]
针对以上缺陷，本发明解决的技术问题是提供一种酶法生产莱鲍迪苷b的新方法。
[0007]
本发明酶法生产莱鲍迪苷b的方法，包括以下步骤：以β-半乳糖苷酶为催化剂，在水溶液中催化底物反应，得到莱鲍迪苷b，其中，所述底物为莱鲍迪苷a(ra)、莱鲍迪苷d(rd)、莱鲍迪苷i(ri)和莱鲍迪苷m(rm)中的至少一种。
[0008]
在本发明的一个具体实施方式中，所述β-半乳糖苷酶来源于硫化叶菌、黑曲霉或克鲁维酵母。
[0009]
在本发明的一个具体实施例中，所述β-半乳糖苷酶来源于乳酸克鲁维酵母。
[0010]
在本发明的一个实施方式中，β-半乳糖苷酶的添加量为1000～20000u/克底物。
[0011]
在本发明的一个实施方式中，催化反应体系中，控制温度25～60℃，ph值为6.0～10.0，底物浓度为20～80g/l，反应时间≥6h。
[0012]
在本发明的一个实施方式中，本发明的催化反应体系中，还加入甘油和β-巯基乙醇。
[0013]
在本发明的一些具体实施方式中，甘油的加入量≤50％(v/v)，β-巯基乙醇的加入量≤10％(v/v)。
[0014]
在本发明的一个实施方式中，催化反应后，采用以下方法进行分离纯化，得到莱鲍迪苷b产品：
[0015]
a、将反应后的反应液加热粗滤后再进行超滤，去除不溶杂质和变性蛋白，得到超滤透过液；
[0016]
b、将超滤透过液采用纳滤的方式分离莱鲍迪苷b，得到纳滤截留液；
[0017]
c、将纳滤截留液浓缩结晶、干燥获得莱鲍迪苷b产品；或将截留液浓缩后喷雾干燥，得到莱鲍迪苷b产品。
[0018]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0019]
本发明方法，首次采用β-半乳糖苷酶为催化剂，催化底物反应得到rb，其方法简单，操作易行，底物的转化率高，成本低廉。
具体实施方式
[0020]
本发明酶法生产莱鲍迪苷b的方法，包括以下步骤：以β-半乳糖苷酶为催化剂，在水溶液中催化底物反应，得到莱鲍迪苷b，其中，所述底物为莱鲍迪苷a(ra)、莱鲍迪苷d(rd)、莱鲍迪苷i(ri)和莱鲍迪苷m(rm)中的至少一种。
[0021]
本发明方法，通过采用β-半乳糖苷酶为催化剂，催化底物反应得到rb。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，ec3.2.1.23)简称乳糖酶，能够将乳糖水解为半乳糖最初应用于食品行业，将乳制品中的乳糖水解，以及制备功能性低聚糖，满足决乳糖不耐受人群对乳制品的需求。β-半乳糖苷酶还具有转苷反应活性，比如来源于曲霉属的β-半乳糖苷酶能够以甜菊苷为底物，水解c13位上的一个葡萄糖基生成悬勾子苷。本发明研究发现，β-半乳糖苷酶能够水解ra、rd、ri和rm中的葡萄糖基，生成rb。其方法简单，操作易行，底物的转化率高。
[0022]
ra、rb、rd、ri和rm的结构通式如下，具体结构及性质见表1。
[0023][0024]
表1
[0025][0026]
在本发明的一个具体实施方式中，所述β-半乳糖苷酶来源于硫化叶菌、黑曲霉或克鲁维酵母。这些来源的β-半乳糖苷酶具有较好的底物专一性，能够很好的转化底物生成rb。在本发明的一个具体实施例中，所述β-半乳糖苷酶来源于乳酸克鲁维酵母。
[0027]
β-半乳糖苷酶的添加量与底物的量相关。为了更好的促进反应，同时兼顾反应速率，在本发明的一个实施方式中，β-半乳糖苷酶的添加量为1000～20000u/克底物。
[0028]
除了酶和底物的量，其他因素也会影响酶促反应。在本发明的一个实施方式中，催化反应体系中，控制温度25～60℃，ph值为6.0～10.0，底物浓度为20～80g/l，反应时间≥6h。
[0029]
温度影响酶的活性，从而影响催化反应的进行。在本发明的实施方式中，控制反应温度为25～60℃。在一个具体实施方式中，控制反应温度为25～40℃。在本发明一些具体实施例中，可以控制温度为25℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃或40℃等。
[0030]
ph值可以通过缓冲液来进行调节，在本发明一个具体实施例中，采用磷酸缓冲液，比如，采用na2hpo4/nah2po4来调节ph值。在本发明的一些实施方式中，反应体系ph值为6.5～8。具体的，ph值可以为6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8或8.0等。
[0031]
随着催化反应的进行，体系中的底物量越来越低，在本发明的一些实施方式中，控制底物浓度为20～80g/l。具体的，底物浓度可以为20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l、75g/l或80g/l等。
[0032]
在本发明的一些实施方式中，反应时间≥6h。催化反应一段时间后，底物反应完全，此时再延长反应时间将不会增加产量，反应影响反应效率。在本发明的一个具体实施例中，反应时间为6h。
[0033]
本发明的催化反应体系中，还可以加入甘油和β-巯基乙醇。甘油可以作为酶的保护剂，而β-巯基乙醇可作为酶的激活剂。加入这二者后，可以提高底物的转化率。
[0034]
本领域常用的甘油用量和β-巯基乙醇用量均适用于本发明。在本发明的一些具体实施方式中，甘油的加入量≤50％(v/v)，β-巯基乙醇的加入量≤10％(v/v)，即甘油加入体积为反应体系体积的50％以下，β-巯基乙醇加入体积为反应体系体积的10％以下。
[0035]
催化完成后，可以生成rb，但是，此时的rb在溶液中，该溶液中除了rb外，还含有β-半乳糖苷酶、未反应完全的底物等杂质，因此需要进行分离纯化才能得到产品。本领域常用的分离纯化方法均适用于本发明。
[0036]
在本发明的一个实施方式中，采用以下方法进行分离纯化，得到rb产品：
[0037]
a、将反应后的反应液加热粗滤后再进行超滤，去除不溶杂质和变性蛋白，得到超滤透过液；
[0038]
b、将超滤透过液采用纳滤的方式分离莱鲍迪苷b，得到纳滤截留液；
[0039]
c、将纳滤截留液浓缩结晶、干燥获得莱鲍迪苷b产品；或将截留液浓缩后喷雾干燥，得到莱鲍迪苷b产品。
[0040]
在本发明的一个实施方式中，步骤a使用的超滤膜规格为10kd，跨膜压力为1.0～1.5mpa，此时，水溶性蛋白在截留液内，反应底物、产物存在于透过液内。
[0041]
在本发明的一个实施方式中，步骤b所使用的纳滤膜规格为0.5kd，跨膜压力为1.5～2.0mpa，底物/产物在截留液内，其余小分子杂质在透过液内。
[0042]
优选的，步骤c所采用的结晶方法为，将结晶条件为，将纳滤浓缩液浓缩至固含量10～30％，加入乙醇调节结晶体系乙醇浓度到10～80％，加热至沸腾，冷却至0～40℃，结晶1～60h。
[0043]
优选的，步骤d所采用的喷雾干燥条件为：将纳滤截留液浓缩至固含量10～60％后，使用喷雾干燥的方法进行干燥，其进风口温度为80℃，喷雾干燥出风口温度为120℃。
[0044]
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例中的β-半乳糖苷酶来源于乳酸克鲁维酵母，购自诺维信(中国)生物技术有限公司。
[0045]
实施例1
[0046]
以ra为底物，称取适量浓度的ra、缓冲盐、甘油，完全溶解后加入β-半乳糖苷酶，水浴反应一定时间，取样，hplc测定反应液中ra、rb的浓度，并计算ra的转化率。具体的反应参数以及转化率结果见表2。
[0047]
反应体系中转化率的计算方法为：
[0048]
ra摩尔转化率＝rb摩尔浓度/(ra摩尔浓度+rb摩尔浓度)
×
100％
[0049]
表2催化体系研究
[0050][0051]
实施例2
[0052]
以ra为底物，在实施例1的组别4的基础上，添加不同浓度的保护剂/激活剂，考察对转化的影响，其结果见表3。
[0053]
表3保护剂/激活剂对转化的影响
[0054][0055]
实施例3
[0056]
分别以ra、rd、ri、rm为底物，考察不同底物下生成rb的转化效果，其结果见表4。
[0057]
表4不同底物转化rb对比
[0058][0059][0060]
实施例4
[0061]
分离纯化实施例1组别1中的rb，其具体步骤为：
[0062]
1、超滤膜分离
[0063]
将转化后的混合溶液用纯化水稀释2倍，加热至60～80℃获得澄清溶液。将澄清溶液用过10kd规格超滤膜，跨膜压力分别控制在0.5mpa，1.0mpa，1.5mpa，并分别取截留液和透过液检测其固形物含量，考察超滤跨膜压力对rb透过量的影响，其结果见表5。
[0064]
当超滤跨膜压力≥1.0mpa时，rb可以透过10kd规格超滤膜，起到产物与大分子杂质分离的效果。
[0065]
表5超滤跨膜压力对rb回收的影响
[0066][0067]
2、纳滤膜分离富集
[0068]
将澄清液过10kd规格超滤膜，跨膜压力控制在1.5mpa，然后将超滤透过液过0.5kd
规格纳滤膜，跨膜压力分别控制在1.0mpa，1.5mpa，2.0mpa，并分别取截留液和透过液检测其固形物含量，考察纳滤跨膜压力对消除小分子杂质的影响，其结果见表6。
[0069]
表6纳滤跨膜压力对消除小分子杂质的影响
[0070][0071]
当纳滤跨膜压力≥1.5mpa时，小分子杂质可以透过0.5kd规格纳滤膜，起到小分子杂质与rb分离的效果。
[0072]
3、结晶
[0073]
将纳滤截留液加热浓缩固含量20％，常温搅拌12h，析出rb晶体，过滤后用少量纯化水淋洗，烘干，获得rb粗品。结晶母液再浓缩为原来的1/10体积，4℃搅拌12h结晶，收集晶体，少量纯化水淋洗，烘干，获得rb粗品。
[0074]
4、精制
[0075]
向rb粗品中加入4倍体积的50％乙醇溶液，加热溶解，制成过饱和溶液，再加入1％活性炭，趁热搅拌30分钟，过滤，在4℃搅拌14h结晶。过滤收集晶体，80℃烘干，获得rb晶体，纯度>95％。