一种用于细胞内靶向线粒体的转运载体及其应用

1.本发明涉及一种用于细胞内靶向线粒体的转运载体及其制备和在蛋白质复合物分析中的应用，属于生物分析技术领域。


背景技术：

2.线粒体作为细胞必不可少的能量中心，参与细胞增殖，死亡和分化。蛋白质复合物是细胞和线粒体的基本组成部分，是生物途径的执行者。研究线粒体蛋白质复合物，对线粒体中蛋白质复合物进行时空动态变化规律的分析，对于解析蛋白质复合物在生物途径中如何发挥作用至关重要。传统技术如cryo-em，x射线，nmr可以提供处于晶体状态的线粒体蛋白复合物的结构信息，酵母双杂交和免疫沉淀(ip)已规模化研究蛋白质相互作用信息的成熟工具。传统技术已成功实现高分辨的蛋白结构解析，蛋白质复合物相互作用的高覆盖解析，但目前传统的方法在进行蛋白质构象和蛋白质相互作用分析前样品制备较为复杂，需纯化结晶获得纯度高的蛋白质复合物，或对细胞进行基因改造以高表达富集蛋白。综上因素，传统方法在活细胞中进行实时瞬时和动态蛋白质相互作用组的分析存在一定困难。
3.交联质谱法(xlms)作为对传统方法的补充已发展为一种常见的蛋白质结构及相互作用信息的解析技术，其通过获得高覆盖度的交联肽，提供相互作用位点以及蛋白质复合物结构建模工作的距离约束信息，以实现时瞬时和动态蛋白质相互作用组的蛋白建模和相互作用约束信息。化学交联反应结合质谱技术的分析通量高、灵敏度高的优势，可以对复杂体系进行分析的优势，非常适合于复杂样品中蛋白质复合物的规模化精准解析。
4.交联质谱技术的核心是化学交联剂。近年来，化学交联剂种类增长十分迅速，出现了大量具有不同臂长、不同反应活性的化学交联剂(nat.rev.genet.2013,14(1),35-48.)。n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯衍生的化合物是典型且广泛使用的交联剂，可以与赖氨酸残基高效反应，但其因不溶于水，在使用前需以高浓度溶解在有机相如dmso,dmf中稀释后使用，高浓度的有机相(dmso)会对细胞状态造成扰动且目前尚未报导具有靶向基团交联剂的应用。对于线粒体中的蛋白质相互作用分析，仍需分离线粒体后离体状态下交联，使用非生物相容性溶剂以及细胞器的分离过程将造成对细胞的真实状态的刺激，无法实现在自然的细胞条件下获得蛋白质复合物结构及相互作用信息。因此，亟需发展在细胞水平上可实现线粒体内蛋白质复合物原位分析方法，以满足线粒体内蛋白质复合物原位结构解析的需求。
5.纳米材料具有独特而优良的特性，如高度的稳定性，组织渗透性，出色的细胞内递送，良好的生物相容性和穿过细胞膜的能力，因此发展出更广泛的生物医学应用。在医药领域，跨膜靶向转运载体已经成功用于许多药物的给药系统。它增加了药物在细胞膜上的通透性，辅助药物克服酶等生物屏障，改善药物的体内药代动力学，从而增加药物在靶向位置的分布量，提高药物在体内释放的可控性，最终达到提高药效的目的。目前纳米载药体系可通过靶向基团修饰的纳米载体已经实现了亚细胞水平的递送。利用纳米载药体系的优势克服交联剂使用需要有机溶剂辅助溶解以及暂无靶向性的难题，可实现载体包埋交联剂靶向递送至线粒体进行线粒体蛋白质复合物的原位动态捕获和解析。
6.在本专利中，针对现有化学交联剂需要有机溶剂助溶和无法靶向输运而导致的细胞内线粒体蛋白质复合物的原位分析困难的问题，发展基于交联剂载体的靶向细胞内线粒体的蛋白质复合物原位分析方法，以实现亚细胞器上蛋白质复合物的时空动态分析。


技术实现要素：

7.本发明的目的是一种用于细胞内靶向线粒体的转运载体及其应用，通过本发明的方法解决了细胞内线粒体以及到达线粒体之前途径亚细胞器的亚细胞器层面蛋白质复合物的原位分析困难的问题。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
9.一种用于细胞内靶向线粒体的转运载体及其应用，具体包括以下步骤：
10.(1)制备包裹交联剂的靶向线粒体的载体，载体以聚合物、复合材料、生物膜、靶向基团键合或掺杂的聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇作为载体基质。
11.其中载体骨架特征为：载体骨架共混物中聚丙交酯-乙交酯为分子量5000-100000的聚丙交酯-乙交酯；聚丙交酯-乙交酯中丙交酯与乙交酯的摩尔比为50：50到85：15；靶向基团键合或掺杂的聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇中聚丙交酯-乙交酯为分子量5000-100000的聚丙交酯-乙交酯，聚乙二醇的分子量为2000-30000，载体骨架共混物中靶向基团键合或掺杂的聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇质量比例为99％-1％；聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇中丙交酯-乙交酯的摩尔比为50：50到85：15，靶向基团与聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇的质量比1：100-100：1。
12.其中靶向基团包括：同时具有正电荷和亲脂性的靶向线粒体多肽；或同时具有一个亲水的带电基团与一个疏水基团的离域亲脂阳离子；或强正电化合物中的一种或两种以上。
13.其中的交联剂包括：其两侧基团能同时为与蛋白上氨基反应的琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃、亚胺酸酯；或同时为与蛋白上巯基反应的马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶、硫代磺酸盐、卤代乙酰基；或同时为与蛋白上羧基反应的碳二亚胺、异氰酸盐；或同时为与蛋白上糖链反应的酰肼基团；或与蛋白中氨基酸残基发生反应非特异的反应基团的苯基叠氮基团、双吖丙啶、二苯基甲酮；所述的交联剂，其两侧基团分别为上述任一反应基团。
14.(2)载体制备方法包括乳液固化法或纳米沉淀法，乳液固化法的制备的特征在于：将载体骨架、溶于蓖麻油聚氧乙烯醚中的交联剂共溶于二氯甲烷中形成原料溶解油相，随后将原料溶解油相分散至0.1wt％-5wt％pva(聚乙烯醇)水相中搅拌固化成球，其中水相与油相体积比例范围为1-10：1；纳米沉淀法的制备过程：将载体骨架、溶于蓖麻油聚氧乙烯醚中的交联剂共溶于乙腈中形成原料溶解油相，随后将原料溶解油相滴入水中或0.1wt％-5wt％水相中pva搅拌固化成球，其中水相与油相体积比例范围为1-10：1。
15.(3)包裹交联剂的修饰靶向基团的靶向线粒体的载体与的细胞递送孵育为，共同孵育1-48小时，胰酶消化或者用细胞刮刮下收集细胞，也可以进一步通过分离处理收集细胞内特定部位。
16.包裹交联剂的载体通过动物模型进行递送时通过进行给药递送1-48h，递送后收集小鼠组织，组织研磨处理收集细胞，也可以进一步通过分离处理收集细胞内特定部位。
17.所述的亚细胞器的特定部位为靶向性亚细胞器线粒体或靶向线粒体所途径位置
包括：线粒体内膜、线粒体外膜、线粒体基质、溶酶体、高尔基体、内质网、胞内小体。
18.(4)在收集的细胞及细胞内特定部位中加入离子液体或加入0.5-1％sds以提取蛋白质及其复合物，然后加入二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦，并进行高温变性，高温变性温度为56℃-95℃；然后将高温变性后的样品转移至滤膜上或溶液中，利用碘代乙酰胺或n乙基马来酰亚胺进行烷基化；利用胰酶对蛋白质及其复合物进行膜上酶切或者溶液中酶切，并利用离心或直接收集肽段及其交联肽段样品。
19.(5)对上述收集到的肽段及其交联肽段，采用液质联用进行分析，其中质谱选择具有高精度和高分辨的质量分析器。质量分析器采用静电场轨道阱(oribitrap)、飞行时间管(tof)和傅里叶变换质谱(ft-icr)等质谱。
20.(6)用mascot，pfind以及plink对质谱数据进行解析，从而得到蛋白质及其交联蛋白质信息。用cytoscape,proxl-ms对蛋白质相互作用信息以及蛋白pdb位点匹配信息进行解析。
21.(7)一种用于细胞内靶向线粒体运输交联剂的靶向载体应用于细胞内蛋白质复合物原位分析，包括细胞内线粒体蛋白质复合物规模化分析、蛋白质的空间结构解析、蛋白质-蛋白质相互作用解析以及线粒体的蛋白质的时空动态解析。
22.本发明具有如下优点：
23.(1)本发明解决了交联剂使用需要有机溶剂辅助溶解以及暂无靶向性的难题。(2)本发明解决了交联剂实现原位亚细胞器蛋白质相互作用困难的问题。
24.(3)本发明解决了交联剂通过载体靶向递送至线粒体的问题。
25.(4)本发明解决了解析线粒体以及到达线粒体之前所途径亚细胞层面的蛋白质复合物时空动态变化规律、追踪线粒体参与细胞功能、理解生命过程、揭示疾病机制、筛选生物标志物以及寻找药物靶标。
附图说明
26.图1：包埋交联剂的载体通过纳米沉淀法所制载体的tem图
27.图2:交联剂载体进入细胞6小时，所制载体到达线粒体内部的tem图
28.图3：包埋交联剂的载体通过乳化固化法所制球的tem图
29.图4：交联剂载体进入细胞6小时，所制载体到达线粒体内部的tem图
30.图5：proxl-ms用于线粒体蛋白中phb-phb2相互作用绘制
具体实施方式：
31.实施例1(包埋bspno的靶向线粒体载体的纳米沉淀法制备及其在肿瘤细胞中靶向递送交联剂至线粒体的应用)
32.制备以80质量份的分子量10000聚丙交酯-乙交酯(聚丙交酯与乙交酯的摩尔量比为50：50)共混20质量份的修饰分子量3500聚乙二醇的分子量10000聚丙交酯-乙交酯(聚丙交酯与乙交酯的摩尔量比为50:50)为载体骨架，其中靶向基团三苯基膦(tpp)是通过酯化缩合后键合在聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇上；其中二者质量比为10：1。取40质量份的交联剂bspno(双琥珀酰亚胺酯炔丙基硝基交联剂，其中交联臂长为7个碳，交联臂上接枝有富集基团-生物素)，溶解于20质量份的蓖麻油聚氧乙烯醚中，将载体骨架溶于500质量份的乙腈
中，将溶解载体骨架的乙腈和溶解交联剂的蓖麻油聚氧乙烯醚混合构成原料溶剂，将原料溶剂油相滴入2000质量份的水中，油相和水相的比例关系为1：4，搅拌挥发完水中的有机溶剂以对原料油相进行固化从而制备载体。tem图见图1。
33.在37℃，体积含量5％co2空气条件下，将该载体与肿瘤细胞hepg2细胞在dmem培养基中，其中载体在dmem终浓度为1mg/ml的条件下，hepg2细胞数目为2e7共同孵育。共同孵育6小时，收集细胞，经过样品预处理，样品预处理过程为5质量份2.5％戊二醛固定，2质量份的石蜡包埋，超薄生物切片后进行bio-tem的拍摄。观察其靶向性行为，通过tem图2中拍摄到的线粒体内部，我们明显观察到载体的存在，证明载体通过靶向基团的作用到达了线粒体。
34.将载体在37℃,将该载体与hepg2细胞在dmem培养基中，放置于体积含量5％co2空气条件下，共同培养6小时，收集细胞，并加入终浓度4wt％sds对细胞中蛋白进行提取，提取之后加入10质量份的点击试剂对交联肽段进行点击生物素，点击后的蛋白进行加入8倍蛋白体积的丙酮沉淀以除去多余的生物素小分子，之后复溶于1质量份的8m尿素，蛋白进行95℃，5min进行热变性，加入碘代乙酰胺(iaa)进行还原烷基化处理，用trypsin酶解为肽段，除盐。采用液质联用系统对收集肽段及其交联肽段进行分析，质谱选择具有高精度和高分辨的质量分析器：静电场轨道阱(oribitrap)。通过质谱分析后使用mascot和plink对质谱数据进行解析，鉴定到的交联肽段(cross-linked peptides pairs)为119条，鉴定到的内部交联的肽段(loop-linked peptides pairs)为155条，鉴定到的单交联的肽段(mono-linked peptides pairs)为1255条。用proxl-ms对鉴定到的线粒体的相互作用信息进行绘制，如图5所示。
35.实验结果证明，纳米沉淀法制备的靶向性包埋交联剂载体实现了在细胞水平递送至线粒体以原位解析线粒体蛋白质复合物信息的目的。
36.实施例2(包埋bspno的靶向线粒体载体的乳化固化法的制备及其在肿瘤细胞中靶向递送交联剂至线粒体的应用)
37.制备以80质量份的分子量15000聚丙交酯-乙交酯(聚丙交酯与乙交酯的摩尔量比为75：25)共混20质量份的修饰分子量5500聚乙二醇的分子量10000聚丙交酯-乙交酯(聚丙交酯与乙交酯的摩尔量比为75:25)为载体骨架，其中靶向基团二甲基二十八烷基溴化铵(ddab)是通过物理共混的方式掺杂在聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇上；其中二者质量比为10：1.25。取40质量份的交联剂bspno(全名双琥珀酰亚胺酯炔丙基硝基交联剂，其中交联臂长为7个碳，交联臂上接枝有富集基团-生物素)，溶解于20质量份的蓖麻油聚氧乙烯醚中，将载体骨架溶于500质量份的二氯甲烷中，将溶解载体骨架的二氯甲烷和溶解交联剂的蓖麻油聚氧乙烯醚混合构成原料溶剂超声分散于2000质量份的1％聚乙烯醇水溶液中，油相和水相的比例关系为1：4。搅拌挥发完水中的有机溶剂以对原料油相进行固化从而制备载体。tem图见图3。
38.在37℃，体积含量5％co2空气条件下，将该载体与肿瘤细胞hepg2细胞在dmem培养基中，其中载体在dmem终浓度为1mg/ml的条件下，hepg2细胞数目为2e7共同孵育。共同孵育6小时，收集细胞，经过样品预处理，样品预处理过程为5质量份2.5％戊二醛固定，2质量份的石蜡包埋，超薄生物切片后进行bio-tem的拍摄。观察其靶向性行为，通过tem图4中拍摄到的线粒体内部，我们明显观察到载体的存在，证明载体通过靶向基团的作用到达了线粒体。
39.将载体在37℃,将该载体与hepg2细胞在dmem培养基中，放置于体积含量5％co2空
气条件下，共同培养6小时，收集细胞，并加入终浓度4wt％sds对细胞中蛋白进行提取，提取之后加入10质量份的点击试剂对交联肽段进行点击生物素，点击后的蛋白进行加入8倍蛋白体积的丙酮沉淀以除去多余的生物素小分子，之后复溶于1质量份的8m尿素，蛋白进行56℃，1h进行热变性，加入碘代乙酰胺(iaa)进行还原烷基化处理，用trypsin酶解为肽段，除盐。采用液质联用系统对收集肽段及其交联肽段进行分析，质谱选择具有高精度和高分辨的质量分析器：静电场轨道阱(oribitrap)。通过质谱分析后使用mascot和plink对质谱数据进行解析，通过质谱分析后使用mascot和plink对质谱数据进行解析，鉴定到的交联肽段(cross-linked peptides pairs)为107条，鉴定到的内部交联的肽段(loop-linked peptides pairs)为49条，鉴定到的单交联的肽段(mono-linked peptides pairs)为1229条。用cytoscape对鉴定到的线粒体的相互作用信息进行绘制。
40.实验结果证明，乳化固化法制备的靶向性包埋交联剂载体实现了在细胞水平递送至线粒体以原位解析线粒体蛋白质复合物信息的目的。
41.实施例3(包埋bspno的靶向线粒体载体的乳化固化法的制备及其在动物模型细胞中靶向递送交联剂至线粒体的应用)
42.制备以100质量份的分子量9000聚丙交酯-乙交酯(聚丙交酯与乙交酯的摩尔量比为60：40)共混30质量份的修饰分子量4500聚乙二醇的分子量6000聚丙交酯-乙交酯(聚丙交酯与乙交酯的摩尔量比为60:40)为载体骨架，其中靶向线粒体肽ss-31是通过化学键合的方式掺杂在聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇上；其中二者质量比为5：1。取10质量份的交联剂bspno(全名双琥珀酰亚胺酯炔丙基硝基交联剂，其中交联臂长为7个碳，交联臂上接枝有富集基团-生物素)，溶解于50质量份的蓖麻油聚氧乙烯醚中，将载体骨架溶于500质量份的二氯甲烷中，将溶解载体骨架的二氯甲烷和溶解交联剂的蓖麻油聚氧乙烯醚混合构成原料溶剂超声分散于2000质量份的1％聚乙烯醇水溶液中，油相和水相的比例关系为1：4。搅拌挥发完水中的有机溶剂以对原料油相进行固化从而制备载体。
43.选择无特定病原体(specific pathogen free,spf)小鼠，小鼠的模型构建为原发肝癌肿瘤小鼠模型。通过皮下注射，分别进行给药递送3，6，9，12h，递送后收集小鼠组织(心脏，大脑，肝脏和骨骼肌肉(腿)，肿瘤部位，淋巴脾脏等)，将各个时间点组织研磨处理收集细胞，每部分所收集动物细胞分别进行样品预处理，加入10质量份离子液体对细胞中蛋白进行提取，提取之后加入3质量份点击试剂对交联肽段进行点击生物素，点击后的蛋白加入10倍蛋白体积的丙酮沉淀以除去多余的生物素小分子，之后复溶于1质量份的8m尿素，蛋白进行56℃，1h进行热变性，加入碘代乙酰胺(iaa)进行还原烷基化处理，用trypsin酶解为肽段，除盐后分级。采用液质联用系统对收集肽段及其交联肽段进行分析，质谱选择具有高精度和高分辨的质量分析器：静电场轨道阱(oribitrap)。通过质谱分析后使用mascot和plink对质谱数据进行解析，其中一组交联鉴定结果为鉴定到的交联肽段(cross-linked peptides pairs)为105条，鉴定到的内部交联的肽段(loop-linked peptides pairs)为72条，鉴定到的单交联的肽段(mono-linked peptides pairs)为937条。用cytoscape和proxl-ms(图5)对鉴定到的线粒体的相互作用信息进行绘制。
44.实验结果证明，靶向性包埋交联剂载体实现了在活体水平递送交联剂至线粒体以原位解析线粒体蛋白质复合物信息的目的。