一种猪3号染色体上与猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记及应用的制作方法

1.本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种猪3号染色体上与猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记及应用。


背景技术：

2.猪肉是我国重要的动物蛋白来源，其消费占比在我国肉类消费市场的60％以上。因此，猪的一些重要的经济性状如生长、繁殖和肉质性状等长期受到我国育种工作者研究和改进。近年来，随着人们猪肉消费水平的不断增长和消费观念的转变，瘦肉型猪逐渐主导了我国猪肉消费市场。因此，对优质瘦肉型猪的选育成为育种工作的重点，影响猪生长的相关性状是重要的育种目标。猪的生长性状主要包括日增重和上市体重日龄等。其中，日增重是指达上市体重时的平均每日增重，而上市体重日龄则是指达上市体重时的天龄。在养猪生产中，猪的日增重和上市体重日龄等生长性状能直接影响养殖企业经济效益。因此，如何提高这些生长性状的性能通常是养殖企业关注的重点。
3.杜洛克猪在我国的育种和商业化养殖中应用非常广泛，通常作为“二元杂”或“三元杂”商品肉猪的终端父本。其在商品代的生产性占比能达到50％，如果能加快杜洛克猪生长性状的遗传改良，将会为养殖业带来巨大的经济效益同时能提高我国猪种竞争力。对于生长性状这种复杂而又受到多个基因的共同调控的数量性状，采用常规的育种方法不仅耗时长、进展缓慢、准确度不高，也难以快速实现预期的育种目标。因此，充分发展和利用现代育种技术是我们实现高效育种的关键。
4.全基因组关联分析(genome-wide association study，gwas)是人们用于研究动植物复杂性状的遗传机制的重要方法。近年来，随着高通量测序技术的快速发展及全基因组芯片的商业化应用，gwas在复杂性状的遗传解析中日渐成熟，目前已经被广泛应用到农作物和经济动物的育种研究中。虽然gwas方法发现了许多重要的snp(single nucleotide polymorphisms，snp)、qtl (quantitative trait locus，qtl)和候选基因，这些研究成果有助于分子育种的顺利推进，但是它也存在混杂群体往往会出现假阳性或假阴性结果、难以对基因-变异-环境的相互关系进行解析、对于具体相关基因的功能也无法获取等缺点。在生物基因组的变异中存在有多种形式，包括单位点的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms，snp)、小片段的插入和缺失(insertion/deletion， indel)以及拷贝数变异(copy number variation，cnv)等。cnv作为遗传多样性的重要来源之一，这为我们对于传统gwas方法无法解释的遗传变异提供一种新的思路。
5.cnv是一种片段长度大于50bp的dna片段插入、缺失、重复等引起的拷贝数发生改变的遗传变异。在生物中，大部分cnv都是在基因组中以遗传多样性的形式存在，其对比参考基因组可能发生不同程度的拷贝数增加或者缺失。由于拷贝数发生改变，可能导致了基因的剂量效应或引起基因结构的改变，从而显著地影响对应的表型。因此，在猪的遗传改良育种进程中，cnv与关联分析方法的结合，为进一步解析生长性状等复杂性状的遗传机制提
供了重要的途径。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种猪3号染色体上与猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记(cnv)。
7.本发明的另一目的在于提供上述猪3号染色体上与猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记的应用。
8.本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述拷贝数变异分子标记的引物对。
9.本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。
10.本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良方法。
11.本发明的目的通过下述技术方案实现：
12.一种猪3号染色体上与猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记，其拷贝数区域对应于国际猪基因组11.1版本参考序列3号染色体上位于 162027bp-2026411bp区间的片段；
13.所述的猪3号染色体上与猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记的核苷酸序列对应于国际猪基因组11.1版本参考序列3号染色体上162027 bp-2026411bp区域内，序列的拷贝数正常或增加，导致猪日增重和上市体重日龄的差异；其中，序列的拷贝数＝2，为拷贝数正常；序列的拷贝数>2，为拷贝数增加；
14.所述的猪3号染色体上与猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记在鉴定猪日增重、上市体重日龄相关性状和猪遗传育种中的应用；
15.一种用于鉴定上述拷贝数变异分子标记的核苷酸序列优选为seq id no:1，序列的拷贝数正常或增加，导致猪日增重和上市体重日龄的差异；其中，序列的拷贝数＝2，为拷贝数正常；序列的拷贝数>2，为拷贝数增加；
16.利用上述猪3号染色体上与猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记筛选高生长效率的猪品种的方法，包含如下步骤：
17.检测上述猪3号染色体上与猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记，所述分子标记区间内的核苷酸序列是拷贝数正常还是增加，其中，当猪的个体拥有该片段的正常拷贝数(即拷贝数＝2)时，则有利于提高猪的生长效率；
18.所述的猪为杜洛克及其合成系；
19.所述的猪优选为加系杜洛克及其合成系；
20.一种检测上述拷贝数变异分子标记的引物对，包含引物对p1和p2，其中，引物对p1包含引物f1和引物r1，引物对p2包含引物f2和引物r2，其核苷酸序列如下所示：
21.上游引物f1：5
’-
ctcccactccacccaccctaaag-3’，
22.下游引物r1：5
’-
tgcggacggaaagatgagaacaag-3’；
23.上游引物f2：5
’-
tgcagaactacagggctcaggac-3’，
24.下游引物r2：5
’-
gtggaacagggcaggtggaaag-3’；
25.所述的引物对在鉴定猪日增重和上市体重日龄相关性状中的应用；
26.所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用；
27.所述的引物对在提高猪生长效率中的应用；
28.一种检测上述拷贝数变异分子标记的试剂盒，包含上述引物对；
29.一种用于检测上述拷贝数变异分子标记的方法，包含如下步骤：
30.以猪组织样全基因组dna为模板，以检测上述拷贝数变异分子标记的引物对或上述试剂盒中的引物对为引物，分别通过实时荧光定量pcr扩增3号染色体上位于162027bp-2026411bp区域内的特异性序列seq id no:1以及作为内参的gcg基因的部分片段，根据定量结果鉴定拷贝数变异区域的拷贝数类型；
31.所述的根据定量结果鉴定拷贝数变异区域的拷贝数类型的具体操作优选为：
32.实时荧光定量pcr结束后，根据2
×
2-δδct
计算方法将实时荧光定量pcr 结果分为两类：正常型，2
×
2-δδct
＝2；增加型，2
×
2-δδct
>2；
33.其中，δδct的计算公式为[(ct
目标序列-ct
参考序列
)]
试验组-[(ct
目标序列
-ꢀ
ct
参考序列
)]
对照组
。其中，ct
目标序列
和ct
参考序列
分别指目标序列(seq id no:1) 和参考序列(gcg)的ct值，试验组即为需要检测是否存在拷贝数变异的待测样本，对照组即为已知的无拷贝数变异的对照样本；
[0034]
一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：
[0035]
确定种猪核心群中的种猪的上述拷贝数变异分子标记的区域，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本3号染色体上位于162027bp-2026411bp区域内为拷贝数正常的种猪个体，淘汰在162027bp-2026411bp区域内为拷贝数增加的种猪个体，以逐代提高该区域内的拷贝数正常类型的频率，从而提高后代猪的生长效率；
[0036]
所述的猪为杜洛克猪及其合成系；
[0037]
所述的猪优选为加系杜洛克猪及其合成系；
[0038]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0039]
(1)本发明在杜洛克猪种猪群体中采用关联分析的策略，研究并确定影响猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记位于猪的3号染色体上 162027bp-2026411bp区域内，验证其对日增重和上市体重日龄相关性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪生长效率的遗传改良中，从而提高后代猪群的生长性能，同时也能增加养殖企业经济效益，提升猪种业核心竞争力。通过优选该cnv片段的拷贝数正常个体，能够逐代提高拷贝数正常类型的频率，提高种猪的日增重、缩短种猪达上市体重时的日龄。协同选育上述两个性状的优良猪种，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。
[0040]
(2)本发明提供一种鉴定猪3号染色体上与猪日增重和上市体重日龄相关的拷贝数变异分子标记的引物对和方法，通过p1和p2引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对种猪生长效率进行选育改良，加快育种进程。
附图说明
[0041]
图1是加系杜洛克在3号染色体上关于日增重、上市体重日龄性状的关联分析曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logp值；a：日增重，b：上市体重日龄。
[0042]
图2是测试样本拷贝数变异分子标记区域内的拷贝数类型检测图；其中：横坐标表示测试样本的id号；纵坐标表示根据公式2
×
2-δδct
计算出来的拷贝数值。
具体实施方式
[0043]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0044]
实施例1
[0045]
(1)实验动物
[0046]
本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种加系杜洛克2857头，为种猪分公司核心群。
[0047]
本实验共选取该资源群体中2857头加系杜洛克种猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。
[0048]
(2)样本采集
[0049]
收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。
[0050]
(3)猪全基因组50k snp判型
[0051]
从上述资源群体中选取的2857头杜洛克种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组dna，经nanodrop2000/2000c 核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的dna的浓度和od比值(od260/280、 od260/230)。经nanodrop2000/2000c核酸蛋白检测仪检测合格的dna样品，按照检测的浓度将dna稀释至50ng/μl左右。再将6μl已提取好的待测dna 样品与2μl loading buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150v 电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察dna 的完整性。
[0052]
dna样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在illumina beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50k snp芯片(illumina，美国)基因型判定。利用r语言genabel包中checkmarker对所有样本50k芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6
的snp，最终得到 36700个snp的有效基因型数据。
[0053]
(4)cnv片段关联分析
[0054]
使用penncnv软件对质控后的snp芯片数据进行分析，并通过bedtools 和cnvruler软件获得该群体的拷贝数变异片段数据，经过质控和校正，保留了拷贝数变异频率在0.5％以上的拷贝数变异片段，最终有81个cnv片段用于关联分析以及2645个个体用于关联分析。本发明采用一般线性模型单点回归分析并结合gemma软件进行关联分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用fdr法确定cnv与日增重和上市体重日龄性状关联程度的显著性阈值，显著水平阈值为0.05乘以原始p值小于0.05的cnv数量再除以有效cnv数量，即显著水平阈值分别为8.20e-03和8.20e-03，即0.05
×
10/81(有效cnv数量)。
[0055]
关联分析结果如图1所示。从图1可知，在加系杜洛克猪中，在3号染色体中存在显著影响日增重和上市体重日龄的cnv片段，最强关联的cnv为chr 3:162027bp-2026411bp(p值分别为2.49e-03、2.24e-03)。
[0056]
(5)不同拷贝数类型与日增重和上市体重日龄表型的关联性分析
[0057]
根据表1可知，chr 3:162027bp-2026411bp片段内存在拷贝数变异，且与日增重极
显著相关(p<0.001)。说明此分子标记显著影响猪的日增重性状，可以通过对猪的此cnv片段的辅助选择，从而提高该群体的达上市体重时的日增重，进而加快育种进程。
[0058]
根据表2可知，chr 3:162027bp-2026411bp片段内存在拷贝数变异，且与上市体重日龄极显著相关(p<0.001)。说明此分子标记显著影响猪的上市体重日龄性状，可以通过对猪的此cnv片段的辅助选择，从而缩短该群体的达上市目标体重的日龄，进而加快育种进程。
[0059]
另外根据表1～2可知，拷贝数正常的个体，其日增重比拷贝数增加的个体大，其达上市体重所需要的日龄比拷贝数增加的个体短。对于日增重性状，拷贝数正常型个体表型平均值比拷贝数增加型个体表型平均值大8.65，且两者之间差异显著(p<0.05)。对于上市体重日龄性状，拷贝数正常型个体表型平均值比拷贝数增加型个体表型平均值小2.33，且两者之间差异显著(p<0.05)；这些结果表明，在育种中逐步剔除拷贝数增加型的种猪，以逐代提高该区域内的拷贝数正常型的频率，可以显著缩短上市体重日龄以及显著提高日增重，为养殖企业带来更多的经济效益。
[0060]
表1分子标记的cnv片段拷贝数类型与日增重的相关性分析
[0061][0062]
表2分子标记的cnv片段拷贝数类型与体重日龄的相关性分析
[0063][0064]
实施例2目的dna序列扩增及测序
[0065]
(1)引物设计
[0066]
通过ncbi网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载位于猪的3号染色体上 162027bp-2026411bp序列内具有特异性的dna序列(seq id no:1)为参考序列，并利用引物设计软件primer premier 6.0设计qpcr引物(引物对p1)。同时，以ncbi公布的猪gcg基因序列(nc_010457.5)作为参考序列，采用相同方法设计qpcr引物(引物对p2)。设计的引物对p1和p2的dna序列如下所示。
[0067]
引物对p1为：
[0068]
上游引物f1：5
’-
ctcccactccacccaccctaaag-3’，
[0069]
下游引物r1：5
’-
tgcggacggaaagatgagaacaag-3’；
[0070]
引物对p2为：
[0071]
上游引物f2：5
’-
tgcagaactacagggctcaggac-3’，
[0072]
下游引物r2：5
’-
gtggaacagggcaggtggaaag-3’；
[0073]
(2)qpcr扩增
[0074]
10μl的反应体系中加入dna模板1μl，双蒸水3.4μl，2
×
power-up sybrgreen master mix 5μl，上下游引物各0.3μl。qpcr反应条件为：95℃预变性10min 后，95℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸20s，40个循环。溶解曲线：95℃持续10s，65℃持续1min，95℃持续15s。每个样本分别用p1和p2引物对进行扩增，并且每对引物3个重复。
[0075]
(3)拷贝数变异类型检测
[0076]
实验组样本的拷贝数变异分子标记的拷贝数类型可根据实验组与对照组ct 值(cycle threshold)的差异进行推算，及通过计算2
×
2-δδct
将拷贝数变异分子标记的拷贝数类型分为2类：正常型，2
×
2-δδct
＝2；增加型，2
×
2-δδct
>2。δδct的计算公式为 [(ct
目标序列-ct
参考序列
)]
试验组-[(ct
目标序列-ct
参考序列
)]
对照组
。其中，ct
目标序列
和ct
参考序列
分别指目标序列(seq id no:1)和参考序列(gcg)的ct值，试验组即为需要检测是否存在拷贝数变异的待测样本，对照组即为已知的无拷贝数变异的对照样本，可以为实施例1中已确定为无拷贝数变异的样本。
[0077]
根据图2可知，在随机挑选的6个待测样本中，检测到了分子标记区域内拷贝数数目的变化。检测结果显示：1个样本的2
×
2-δδct
＝2，其分子标记区域内拷贝数类型判定为正常型；剩余5个样本的2
×
2-δδct
>2，其分子标记区域内拷贝数类型判定为增加型，该结果与实施例1cnv片段关联分析一致。
[0078]
(4)dna序列测定
[0079]
dna序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，得出对应拷贝数变异区域。测序结果如下所示：
[0080]
ctcccactccacccaccctaaagctcagcgctccccgtgagtggatttgaagatttgggggacctgggagacggagagcttgttctcatctttcc gtccgca
[0081]
注：序列表中，用标有下划线显示的为所验证的拷贝数变异区域，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。
[0082]
gcg基因qpcr扩增序列：
[0083]
tgcagaactacagggctcaggacactgcacacacgaagttctgaaaagagtctcactctctttccacctgccctgttccac
[0084]
注：序列表中，用标有下划线显示的为扩增区域，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。
[0085]
实施例3拷贝数变异分子标记的拷贝数类型qpcr验证以及效应分析
[0086]
根据表1～2可知，对于日增重，cnv区域内优势拷贝数类型(拷贝数正常) 的效应比拷贝数增加型表型平均值显著提高了8.65；对于上市体重日龄，cnv 区域内优势拷贝数类型(拷贝数正常)的效应比拷贝数增加型表型平均值显著缩短了2.33。因此，通过分子标记辅助选择，逐步对群体内拷贝数类型为增加的猪进行淘汰，则能显著提高拷贝数正常类型的频率，提高群体的日增重，缩短群体的上市体重日龄，有效做到短时高产，从而给养殖企业带来巨大的经济效益。
[0087]
本发明通过对seq id no:1序列的拷贝数变异进行检测，初步进行其拷贝数类型与猪的日增重和上市体重日龄性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的拷贝数变异分子标记。
[0088]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。