从人粪便样本中提取DNA的试剂盒、提取方法及应用与流程

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种从人粪便样本中提取dna的试剂盒、提取方法及应用。

背景技术：

随着分子生物学的发展，基于对外泌体、ctc(循环肿瘤细胞)、cfdna(游离dna(脱氧核糖核酸))检测的液体活检技术较传统检测方式展现出无与伦比的优势。液体活检技术的优点在于高灵敏性，高特意性，无/低创性。

对于消化系统疾病而言，胃肠道上皮特别是病变处上皮细胞凋亡或死亡时释放的dna能更有效的反应受试者消化系统的具体情况。但是，正常人排泄粪便是一个极其混杂的混合物，包含水和固体，其中，固体中包含死亡细菌、脂肪、蛋白质、无机盐和未消化的残存食物及消化液中的固体成分,而dna分散于混合物中，如何从那么多的混合物中找到并提取出合格的dna用于后期检测是目前粪便无创检测技术的难题。

目前，用于粪便dna提取的试剂盒，存在组成成分复杂，提取成功率低的技术问题。对于粪便dna提取方法，存在提取纯度不高，或从相同用量粪便中提取出的dna浓度不高以及不能适用于不同形状粪便的技术问题。同时现有技术还存在提取出的粪便dna不能很好的用于甲基化检测的技术问题。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提供一种从人粪便样本中提取dna的试剂盒，该试剂盒组成成分简单且提取成功率高。同时本发明还提供了一种从人粪便样本中提取dna的提取方法，该提取方法能极大提高提取出的dna的纯度和从相同用量粪便中提取出的dna浓度。

为了实现本发明的技术效果，采用了以下技术方案予以实现：

一种从人粪便样本中提取dna的试剂盒，包括样品保存液、细胞裂解液、dna沉淀剂、dna洗涤剂、dna提取液和dna洗脱液；所述样品保存液的组分包括三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、氯化钠、硫酸铵和乙二胺四乙酸；所述细胞裂解液的组分包括异硫氰酸胍、螯合剂、二硫苏糖醇、tritonx-100和ph调节剂；所述dna提取液的组分包括盐酸胍，所述dna沉淀剂为无水乙醇或异丙醇。

作为进一步的改进，所述试剂盒不包含细胞捕获剂；所述dna洗涤剂为75％的乙醇。

作为进一步的改进，所述样品保存液组分的浓度为：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液100mmol/l、氯化钠5mmol/l、硫酸铵50mmol/l、乙二胺四乙酸50mmol/l。

作为进一步的改进，所述细胞裂解液组分的浓度为：异硫氰酸胍472.5g/l、乙二胺四乙酸20mmol/l、二硫苏糖醇32.5mmol/l、tritonx-1004％v/v；所述ph调节剂为tris-hcl缓冲液，所述细胞裂解液的ph为6.5。

作为进一步的改进，所述dna提取液中盐酸胍的浓度为：573g/l；dna洗脱液为ph为8.0的te缓冲液；所述细胞捕获剂的组成成分包括peg6000和氯化钠。

本发明还提供了一种从人粪便样本中提取dna的提取方法，采用上述任意一项所述的试剂盒进行提取，所述提取方法包括如下步骤：

1)将粪便样品与保存液混合均匀，制备得粪便悬液；

2)将粪便悬液离心后取粪便上清液，在粪便上清液中加入细胞裂解液，混匀，50-70℃孵育20min，得到混合液ⅰ；

3)向混合液ⅰ中加入dna沉淀剂，混匀，离心后舍弃上清液，保留沉淀；

4)加入dna提取液到步骤3)得到的沉淀中，混匀，直至沉淀消失，得到混合液ⅱ；

5)将混合液ⅱ转移至dna吸附柱中，离心；

6)向dna吸附柱中加入dna洗涤剂洗涤dna吸附柱，再对吸附柱进行离心；本发明中dna洗涤剂为能够让dna沉淀同时溶解可能结合在dna上的盐离子的试剂或者说能够让dna吸附柱中dna沉淀同时溶解可能结合在dna上的盐离子的试剂。

7)用dna洗脱液将dna从dna吸附柱上洗脱下来，得到洗脱液即为dna样本液；此步骤包括将dna吸附柱放入离心管，用dna洗脱液洗涤dna吸附柱，并将离心管放入离心机10000rpm离心2min得到dna样本液。

作为进一步的改进，所述提取方法包括如下步骤：

1)将粪便样品与保存液混合均匀，制备得粪便悬液；其中，粪便和保存液的体积比为10:25；

2)将粪便悬液离心后取上清液，在上清液中加入细胞裂解液，混匀，65℃孵育20min，得到混合液ⅰ；其中，此步骤中离心速度为4200rpm，离心时间为20min；所取上清液和细胞裂解液的体积比为4:1；

3)向混合液ⅰ中加入dna沉淀剂，混匀，离心后舍弃上清液，保留沉淀；当dna沉淀剂为无水乙醇时，加入dna沉淀剂和混合液ⅰ的体积比为：2:1；当dna沉淀剂为异丙醇时，加入dna沉淀剂和混合液ⅰ的体积比为：1:1；离心时转速为5000rpm，离心时间为20min；

4)加入dna提取液到步骤3)得到的沉淀中，震荡混匀，直至沉淀消失，得到混合液ⅱ；所述步骤2)中所取上清液和加入dna提取液的体积比为：40：(6-8)；

5)将混合液ⅱ转移至dna吸附柱中，使dna被dna吸附柱吸收，将dna吸附柱10000rpm，离心1min,去滤液，保留吸附柱；

6)向dna吸附柱中加入dna洗涤剂洗涤dna吸附柱，再对吸附柱进行10000rpm离心30s,去滤液，保留吸附柱；所述步骤2)中所取上清液和dna提取液的体积比为：40：6；

7)重复步骤6)一到两次；

8)对dna吸附柱进行离心；该步骤离心速度为10000rpm，离心时间为2min；

9)用dna洗脱液将dna从dna吸附柱上洗脱下来，得到洗脱液即为dna样本液；此步骤包括将吸附柱放在一离心管中，室温放置，使得残留乙醇挥发，然后进行洗脱，洗脱方法为：向该dna吸附柱中加入经60-75℃预热的dna洗脱液，室温放置5min后，将该离心管放入离心机中10000rpm离心2min,获得dna样本液1，即离心管中的获得的液体即为dna样本液1；其中，步骤2)中所取上清液和dna洗脱液的体积比为：40:1。

作为进一步的改进，所述提取方法包括如下步骤：在获得dna样本液后，重复以下步骤至少一次，即将吸附柱放在另一离心管中，然后进行洗脱，洗脱方法为：向该离心管中加入经60-75℃预热的dna洗脱液，室温放置5min后，将该离心管放入离心机中10000rpm离心2min,获得dna样本液2；其中，步骤2)中所取上清液和dna洗脱液的体积比为：40:1。dna样本液1和dna样本液2均为dna样本液。

作为进一步的改进，步骤3)种加入的是4℃的dna沉淀剂；所述dna样本液中dna浓度为87.6-501.5ng/ul，dna纯度a260/280为1.85-2.07。

本发明还提供了上述所述提取方法提取的dna样本液的应用，即所述dna样本液在粪便dna甲基化检测中的应用。所述甲基化检测包括甲基化荧光定量pcr检测、sanger测序、数字pcr、二代测序等。

本发明还提供了所述提取方法提取的dna样本液在粪便dna甲基化检测中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明试剂盒，由于样品保存液组成成分含有三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、氯化钠、硫酸铵和乙二胺四乙酸，能很好地用于粪便中dna的提取，不会存在因保存液的问题出现提取时堵塞dna吸附柱的情况，提取成功率高。现有技术中保存液，由于无法完全去除粪便(或者说是一部分粪便)中的各种杂质，进而后期很容易使dna吸附柱堵塞，造成无法提取dna，或者纯度低，从相同用量粪便中提取出的dna量少、提取出的dna样品液浓度低，不能满足后期检测要求，造成提取成功率低。本发明样品保存液相比于现有技术保存液解决了这一问题，具有显著的优势。

2)本发明试剂盒，不使用细胞捕获剂，能很好地用于粪便中dna的提取，不会产生由于添加细胞捕获剂堵塞dna吸附柱而不能提取的情况。现有技术中一般会在试剂盒中添加细胞捕获剂，例如包括peg6000和氯化钠的细胞捕获剂(可以是peg6000150-250g/l,nacl2-5mol/l)，实验中发现，当加入这种细胞捕获剂以后，容易产生杂质，进而后期提取过程中很容易使dna吸附柱堵塞，从而容易造成无法提取dna，或者从相同用量粪便中提取出的dna量少，或者提取方法应用范围窄(只有成形粪便可以提取，对于部分不成形粪便例如粘性较高的稀便(比正常见到的要黏)，几乎不能提取，容易堵塞dna吸附柱；水样粪便提取得到的dna质量差，不适用于下一步检测)，或者从相同用量粪便中提取出的dna样品液浓度低，不能满足后期检测要求的问题，严重影响了试剂盒和提取方法的应用范围。本发明试剂盒，可以对不成形粪便和成形粪便进行提取，应用范围广泛。不使用细胞捕获剂，对于游离细胞稀少的粪便样本(例如水样便)，提取成功率也很高，提取出的dna能很好的用于如甲基化荧光定量pcr检测在内的甲基化检测。

3)本发明提取方法，加入细胞裂解液后，采用在50-70℃孵育20min,洗脱是采用10000rpm离心2min,相比于现有技术孵育15min，洗脱是采用14000rpm离心1min，能极大的提高从相同用量粪便中提取的dna样品液的浓度和纯度。

4)采用本发明提取方法提取的dna样品液，能够用于甲基化检测。由于现有技术中，甲基化检测通常需要进行亚硫酸盐转化这一步，而这一步对dna都有损伤的，故采用现有技术方法从粪便中提取的dna一般不能很好的用于甲基化检测，采用本发明试剂盒和提取方法提取的dna，能很好的应用于甲基化检测，得到好的结果。

附图说明

图1为实施例1和对比例1得到的dna样本液甲基化荧光定量pcr检测结果；

其中，曲线1为实施例1s3得到的dna样本液甲基化荧光定量pcr检测结果；曲线2为对比例1s3得到的dna样本液甲基化荧光定量pcr检测结果。

具体实施方式

一种从人粪便样本中提取dna的试剂盒,包括样品保存液、细胞裂解液、dna沉淀剂、dna洗涤剂、dna提取液和dna洗脱液；所述样品保存液的组分包括三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、氯化钠、硫酸铵和乙二胺四乙酸；所述细胞裂解液的组分包括异硫氰酸胍、螯合剂、二硫苏糖醇、tritonx-100和ph调节剂；所述dna提取液的组分包括盐酸胍，所述dna沉淀剂为无水乙醇或异丙醇。试剂盒也可以是由这些组分组成。

优选地，所述试剂盒不包含细胞捕获剂。

其中，细胞裂解液中异硫氰酸胍可以迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酶，得到的高质量的dna；edta可以螯合镁、钙等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对dna的降解且更有利于溶菌酶作用的发挥，二硫苏糖醇(dtt)是疏基化dna的还原剂和去保护剂，以用于还原蛋白质中的二硫键，tritonx-100(可以购买于市场，例如：北京索莱宝科技有限公司)是非离子型表面活性剂，有助于蛋白质与dna的分离。

dna提取液中的盐酸胍是变性剂，盐酸胍水溶液可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸上解离下来。

实施例1

一种从人粪便样本中提取dna的试剂盒,包括样品保存液、细胞裂解液、dna沉淀剂和dna洗涤剂、dna提取液、dna洗脱液；所述样品保存液的组分包括三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、氯化钠、硫酸铵和乙二胺四乙酸；所述细胞裂解液的组分包括异硫氰酸胍、螯合剂、二硫苏糖醇、tritonx-100和ph调节剂；所述dna提取液的组分包括盐酸胍。所述dna沉淀剂为无水乙醇或异丙醇。所述试剂盒可以是仅仅由这些物质组成。所述试剂盒不包含细胞捕获剂。例如包括peg6000和氯化钠的细胞捕获剂(可以是peg6000150-250g/l,nacl2-5mol/l)。

所述样品保存液组分的浓度为：三羟甲基氨基甲烷盐酸(tris-hcl)缓冲液为100mmol/l、氯化钠5mmol/l、硫酸铵50mmol/l、乙二胺四乙酸50mmol/l；该保存液的制备方法可以为：用纯化水将三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、氯化钠、硫酸铵、乙二胺四乙酸溶解混合并稀释至上述浓度。三羟甲基氨基甲烷盐酸也可以称三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐。

所述dna洗涤剂为质量分数为75％的乙醇水溶液。

所述细胞裂解液组分的浓度为：异硫氰酸胍472.5g/l、乙二胺四乙酸20mmol/l、二硫苏糖醇32.5mmol/l、tritonx-1004％v/v；所述ph调节剂为tris-hcl缓冲液，细胞裂解液的ph可以为6.5；

所述细胞裂解液的制备方法可以为：将异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇、tritonx-100、tris-hcl用纯化水溶解混合并稀释至上述浓度和ph即可。可以是采用异硫氰酸胍47.25g、灭菌纯化水30ml、0.5mol/ledta4ml、1mol/l二硫苏糖醇(dtt)3.25ml、tritonx-1004ml、1mol/ltris-hcl缓冲液(ph6.5)1ml，调节ph到6.5，灭菌纯化水定容至100ml即可。其中灭菌纯化水也可以用纯化水代替。

所述dna提取液中盐酸胍的浓度为：573g/l(可以是573.18g盐酸胍溶于1000ml纯化水或灭菌纯化水中)；

dna洗脱液可以为ph为8的te缓冲液，所述te缓冲液的成分可以包含：10mmol/l的tris-hcl以及1mmol/ledta。ph为8的te缓冲液可以购买于市场，例如北京索莱宝科技有限公司售卖的te缓冲液(ph8.0),也可以从其他公司购买。

一种从人粪便样本中提取dna的提取方法，采用上述所述的试剂盒进行提取，所述提取方法包括如下步骤：

1)将粪便样品与保存液混合均匀，制备得粪便悬液；

2)将粪便悬液离心后取粪便上清液(该上清液为悬浮液，是离心后去除沉淀的部分)，在粪便上清液中加入细胞裂解液，混匀，50-70℃孵育20min，得到混合液ⅰ；

3)向混合液ⅰ中加入dna沉淀剂，混匀，离心后舍弃上清液(离心后去除沉淀的部分)，保留沉淀；

4)加入dna提取液到步骤3)得到的沉淀中，混匀，直至沉淀消失，得到混合液ⅱ；

5)将混合液ⅱ转移至dna吸附柱中，离心；

6)向dna吸附柱中加入dna洗涤剂洗涤dna吸附柱，再对吸附柱进行离心；

7)用dna洗脱液将dna从dna吸附柱上洗脱下来，得到洗脱液即为dna样本液；此步骤包括将dna吸附柱放入离心管，用dna洗脱液洗涤dna吸附柱，并将离心管放入离心机10000rpm离心2min得到dna样本液。

具体可以为：

1、粪便样品的采集

将保存液倒入50ml离心管1，至离心管1的刻度达到25毫升，再将粪便装入离心管1，使得离心管1中液体刻度达到35ml,震荡混合均匀，得到粪便悬液。若粪便为成形状，使用勺子取样；若粪便较稀或水状，使用注射器取样。

2、dna提取流程

1)将粪便悬液以4200rpm的速度离心20min。可以是将离心管1放入离心机中以4200rpm的速度离心20min。如果粪便悬液是冷冻保存的，可以待完全解冻后离心；

2)离心结束后，取上清液(悬浮液)4ml转移到15ml离心管2中，弃离心后的残渣；向离心管2中加入1ml的细胞裂解液，震荡混匀，将离心管插于板上，65℃孵育20min，得到混合液ⅰ。孵育温度也可以是50-70℃之间，结果一致。

3)向离心管2中加入混合液ⅰ2倍体积的4℃的无水乙醇(实验前将无水乙醇预冷至无水乙醇的温度为4℃,可以用冰盒冷却)，轻震混匀，将离心管2放入离心机中5000rpm，离心20min。弃上清液，保留沉淀(约1-2ml)，进行后续提纯。此处无水乙醇的作用为dna沉淀剂，乙醇会夺去dna周围的水分子，使dna失水而易于聚合。离心可以是将离心管2放入离心机中5000rpm，离心20min。无水乙醇温度为4℃，相比于不冷冻时的温度，能提高得到的dna样品液的浓度和纯度。如果dna沉淀剂为异丙醇，此处可以将无水乙醇换为混合液ⅰ1倍体积的异丙醇，采用异丙醇时，加入异丙醇温度也是4℃。

4)加入600-800μl的dna提取液到步骤3)得到的沉淀中，震荡混匀，直至沉淀消失(若沉淀难以散开，可置于56℃加热，至沉淀消失)，得到混合液ⅱ。

5)将混合液ⅱ转移至dna吸附柱中，室温静置2min，使dna被dna吸附柱充分吸收，将dna吸附柱10000rpm，离心1min，弃掉滤液，保留吸附柱。可以是将以上混合液分多次(如3-5次)转移至dna吸附柱中，进而使得dna吸附柱更好的吸收混合液。

6)向dna吸附柱中加入75％的乙醇洗涤dna吸附柱，再对吸附柱进行离心；即向吸附柱中央加600μl75％的乙醇，将dna吸附柱10000rpm，离心30s，去掉滤液，保留吸附柱。加入75％的乙醇的作用为沉淀dna的同时溶解可能结合在dna上的盐离子。

7)重复步骤6)一次。(若重复一次后发现漂洗(或洗涤)后得到的滤液依然很黄，可再加600μl75％的乙醇进行再次重复漂洗一次)。

8)对dna吸附柱进行离心(空转离心)：该步骤离心速度为10000rpm，离心时间为2min。

9)第一次洗脱：用dna洗脱液将dna从dna吸附柱上洗脱下来，得到洗脱液即为dna样本液；此步骤包括将离心柱放在一洁净的1.5ml离心管3中，标记好样本名称，打开离心柱的管盖，室温放置3-5分钟(挥发残留乙醇)，然后进行洗脱，洗脱方法为向dna吸附柱中央加入100μl经75℃预热的dna洗脱液，室温放置5min，将该离心管3放在离心机中10000rpm离心2min，获得dna样本液。dna洗脱液可以是经60-75℃预热的dna洗脱液，步骤10也是如此,结果一致。选择经60-75℃预热的dna洗脱液，可以增加洗脱效果，使洗脱出来的dna样本液浓度增加。

10)第二次洗脱：再次将离心柱放在另一洁净1.5ml离心管4中，标记好样本名称，打开离心柱的管盖，然后向dna吸附柱中央加入100μl75℃预热的dna洗脱液，室温放置5min，将该离心管4放在离心机中10000rpm离心2min，获得dna样本液。(备注：洗脱dna后可保留dna吸附柱，后期可再次洗脱)

对比例1

将dna提取流程步骤2)中的孵育时间改为15min,步骤9)和10)离心转速为14000rpm，离心时间为,1min,加入无水乙醇时温度为20-25℃，其余不变。

测试dna样品液中dna的浓度和纯度，测试时可以采用分光光度计进行测试。结果见表1。表1中，实施例1和对比例1成形便各做了三组实验，不成形便包括稀便和水样便，实施例1和对比例1各做了4组实验。

表1采用不同形状的粪便得到的dna浓度和纯度结果数据

注意，每组s(s1-s10中的任意一组)实验中，实施例1和对比例1选择的是同一粪便样品，例如，s1中实施例1和对比例1选择的是同一粪便样品。

成形便即成形的大便。

不成形便大便稀软如烂泥，见水则散开，或伴有不消化之物。

水样便大便清稀，粪便水样。

从表1可以看出，对于成形便，实施例1和对比例1dna浓度和纯度测试的结果，相差不大，基本持平，对于不成形便，实施例1相比于对比例1,得到的dna浓度和纯度，都得到了极大的提高，说明本发明试剂盒和提取方法，可以很好的用于成形便和不成形便的提取。特别是水样便，能够从对比例1的浓度为2、纯度为0.57，提高至浓度为113.6、纯度为1.94。当然，本发明中，从步骤2)每4ml上清液中或者说从相同用量粪便中提取出的dna样本液浓度和纯度也是很高的。

另外，实验结果显示，实施例1s1-s10得到的dna样品液，都可以很好的用于甲基化荧光定量pcr检测。

同时，将实施例1s3和对比例1s3获得的dna样本液,采用甲基化检测方法进行检测，即采用甲基化荧光定量pcr检测(内参基因gadph)，甲基化荧光定量pcr检测步骤如常规技术，得到的结果见图1。

从图1结果可以看出，将本发明实施例1提取方法提取的dna进行甲基化荧光定量pcr检测，ct值在循环数更小，说明实施例1明显优于对比例1提取方法提取的dna，图1也说明本发明试剂盒和提取方法能很好的用于甲基化检测，满足应用的需求。

本发明先加入dna沉淀剂，后加入dna提取液，不仅提取出的dna样品液中，dna浓度和纯度高，而且提取出的dna能够用于甲基化荧光定量pcr检测，实验中发现，如果采用先加入dna提取液，后加入dna沉淀剂，则不仅提取出的dna样本液中dna浓度和纯度不高，而且得到的dna样本液不能够用于甲基化荧光定量pcr检测，也进一步说明，本发明方法，产生了意料不到的技术效果。

从人粪便样本中提取dna可以包含粪便中游离dna。

注意，本发明中样品保存液、细胞裂解液和dna提取液中，液指的是水溶液。

以上所述者，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施之范围，即大凡依本发明权利要求及发明说明书所记载的内容所作出简单的等效变化与修饰，皆仍属本发明权利要求所涵盖范围之内。此外，摘要部分和标题仅是用来辅助专利文件搜寻之用，并非用来限制本发明之权利范围。