抗艰难梭菌的重组乳酸乳球菌、活载体疫苗及其制备方法与流程

1.本发明属于生物制药技术领域，涉及抗艰难梭菌的活载体疫苗，尤其涉及种针对艰难梭 菌的重组乳酸乳球菌及活载体疫苗技术。


背景技术：

2.艰难梭菌(clostridium difficile，cd)是一种严格厌氧的革兰阳性芽孢杆菌，是艰难梭 菌相关腹泻的直接致病菌。由于抗生素的不恰当使用以及艰难梭菌孢的难消除，使其成为 医院抗生素腹泻的主要病原菌之一。艰难梭菌感染的轻度患者通常体现为腹泻、水泻样便、 痉挛性腹痛；重度患者则会成为伪膜性肠炎、中毒性巨结肠，甚至感染性休克死亡。100％ 的伪膜性肠炎与此菌有关。我国由于抗生素药物的滥用，形势更为严峻，2010到2016年艰 难梭菌感染率已增为14％。
3.艰难梭菌相关腹泻多数是正常肠道菌群失调的结果，正常肠道菌群平衡时，cd受到优 势菌群的抑制而不致病；当肠道菌群失调时，cd会过度繁殖并释放毒素，引发艰难梭菌相 关腹泻。艰难梭菌的主要致病因子为毒素a、毒素b及二元毒素。
4.毒素a(tcda，约308kda)是由位于致病性决定区(pathogenicity locus，paloc)tcda 基因编码的糖基转移酶，也被称为肠毒素；它可与肠黏膜细胞的毒素受体结合，引起肠黏 膜损伤；它能破坏细胞间的紧密联接，造成上皮屏障的破损；它能促进强效炎症因子的释 放，增加局部黏膜血管的通透性，致使绒毛损害，黏膜出血、坏死。毒素a是多模块位点 结构，由abcd模块构成，不同模块在致病过程中起着不同的调节作用：a是具有生物活 性的n-端位点；b是c-端结合位点；c是半胱氨酸蛋白酶位点；d是疏水位点。毒素a分 子表面结构的大部分是由模块b重复单位构成的，模块b的c-端结合位点具有很强的抗原 性，能引发机体的体液免疫和细胞免疫，从而保护细胞免受a毒素的侵袭。因而本发明着 重于研究a毒素c端的重复序列。
5.目前对于艰难梭菌相关腹泻的常规治疗方案是甲硝唑、万古霉素、利福平等抗生素治 疗。但由于不能杀灭其芽胞，故停药后治愈患者会出现反复感染的现象，以及多重耐药菌 株的出现。因此，越来越多的研究人员提出对cd感染的治疗应寻找新疗法，在杀灭致病 菌株的同时恢复胃肠道的正常菌群。


技术实现要素：

6.本发明的目的旨在针对上述现有技术，提供一种抗艰难梭菌的重组乳酸乳球菌及其制 备方法，所制备的重组乳酸乳球菌能够短期粘附定植、繁殖于肠道内，表达tcda蛋白，诱 导机体产生免疫反应，从而产生特异性抗体。
7.本发明的另一目的是提供一种以重组乳酸乳球菌为有效活性成分的活载体疫苗，用于 预防由艰难梭菌感染所引起的疾病。
8.本发明提供的抗艰难梭菌的重组乳酸乳球菌，其由艰难梭菌亚单位tcda质粒转化入 乳酸乳球菌得到。
9.上述抗艰难梭菌的重组乳酸乳球菌，制备艰难梭菌亚单位tcda质粒用的载体为 pmg36e。
10.上述抗艰难梭菌的重组乳酸乳球菌，所述乳酸乳球菌被命名为hxllc20-1，保存单位 为cgmcc-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.20064，保存状态为存活，保存日期为2020年 06月10日，分类命名为乳酸乳球菌lactococcus lactis。乳酸乳球菌(l.lactis)作为益生菌之一，它不仅能调整肠道微生物菌群，本身也具有 很强的佐剂特性，可有效增强疫苗的免疫效应。利用乳酸乳球菌制备成口服活载体疫苗， 通过口服或者滴鼻，除了能诱导机体产生非特异性，特异性免疫外，还能通过接触黏膜表 面区域，刺激机体产生siga，引起黏膜免疫反应。此外，不同于其他乳酸菌，l.lactis不是 人和动物的正常微生物群，基本不会定植于胃肠道，可一定程度上避免了因为长期定植形 成的免疫耐受。因此，乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗拥有非常好的应用前景，是理 想候选菌种。此外，所述乳酸乳球菌也可以被其它宿主菌替代，例如双歧杆菌、干酪乳杆 菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌等。
11.本发明进一步提供了一种抗艰难梭菌的重组乳酸乳球菌活载体疫苗，其包括活性成分 和药学上可接受的辅料。所述活性成分为上述抗艰难梭菌的重组乳酸乳球菌。所述辅料为 药学上可接受的淀粉、糖粉、乳糖、羧甲基纤维素钠、氢化植物油等常用辅料中的至少一 种。
12.本发明进一步提供了上述抗艰难梭菌的重组乳酸乳球菌的制备方法，包括以下步骤：
13.(1)重组质粒：将艰难梭菌亚单位的目的基因片段tcda插入到双酶切后的载体质粒 中得到重组质粒；
14.(2)重组乳酸乳球菌：将重组质粒电转化入乳酸乳球菌感受态细胞中得到重组乳酸乳 球菌。
15.上述抗艰难梭菌亚单位乳酸乳球菌活载体疫苗的制备方法，步骤(1)中，合成编码艰 难梭菌亚单位的目的基因片段tcda，核酸序列如下：
16.gcaaaatggttaccggtgttttcaaaggtccgaacggtttcgaatacttcgctcc ggctaacacccacaacaacaacatcgaaggtcaggctatcgtttaccagaacaaattc ctgaccctgaacggtaaaaaatactacttcgacaacgactctaaagctgttaccggtt ggcagaccatcgacggtaaaaaatactacttcaacctgaacaccgctgaagctgctac cggttggcagaccatcgacggtaaaaaatactacttcaacctgaacaccgctgaagct gctaccggttggcagaccatcgacggtaaaaaatactacttcaacaccaacaccttca tcgcttctaccggttacacctctatcaacggtaaacacttctacttcaacaccgacggt atcatgcagatcggtgttttcaaaggtccgaacggtttcgaatacttcgctccggctaa caccgacgctaacaacatcgaaggtcaggctatcctgtaccagaacaaattcctgacc ctgaacggtaaaaaatactacttcggttctgactctaaagctgttaccggtctgcgtac catcgacggtaaaaaatactacttcaacaccaacaccgctgttgctgttaccggttgg cagaccatcaacggtaaaaaatactacttcaacaccaacacctctatcgcttctaccg gttacaccatcatctctggtaaacacttctacttcaacaccgacggtatcatgcagatc ggtgttttcaaaggtccggacggtttcgaatacttcgctccggctaacaccgacgcta acaacatcgaaggtcaggctatccgttaccagaaccgtttcctgtacctgcacgacaa catctactacttcggtaacaactctaaagctgctaccggttgggttaccatcgacggta accgttactacttcgaaccgaacaccgctatggg
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17.上述抗艰难梭菌的乳酸乳球菌的制备方法，步骤(1)中，所述抗艰难梭菌亚单位的目 的基因片段tcda与重组质粒用的载体的质量比为(15～30):(5～10)。
18.上述步骤(1)包括以下分步骤：
19.(11)以tcda/puc57-simple质粒为dna模板，经双酶切得到目的基因；
20.(12)对载体进行双酶切；
21.(13)利用连接酶将经双酶切得到的目的基因片段tcda和载体进行连接；
22.(14)将步骤(13)所得连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养；
23.(15)对步骤(14)中所得培养液进行抽提质粒，得到重组质粒。
24.上述步骤(2)包括以下分步骤：
25.(21)制备乳酸乳球菌感受细胞；
26.(22)将重组质粒电转化入乳酸乳球菌感受态细胞中得到抗艰难梭菌的重组乳酸乳球 菌，该步骤包括以下分步骤：
27.(221)在冰浴环境下，将重组质粒与乳酸乳球菌感受态细胞混匀，然后置于电转仪中 进行电激；
28.(222)电激结束后，向所得混合体系中加入再生培养基，经孵育得到含有重组乳酸乳 球菌的培养液。
29.本发明进一步提供了上述抗艰难梭菌的乳酸乳球菌在制备抗艰难梭菌的活载体疫苗中 的应用。
30.与现有技术相比，本发明提供具有以下有益效果：
31.1、本发明所提供的重组乳酸乳球菌，具有良好的免疫原性和免疫保护作用，能够有效 预防艰难梭菌感染，且安全无毒。
32.2、本发明所提供的重组乳酸乳球菌，能够调节肠道微生物菌群，诱导机体产生非特异 性免疫，引起黏膜免疫反应。
33.3、本发明以乳酸乳球菌作为载体，可短期粘附定植、繁殖于肠道内，表达tcda蛋白， 诱导机体产生免疫反应，从而产生特异性抗体。
34.4、本发明所使用的乳酸乳球菌还能发挥佐剂特性，增强疫苗的免疫效应，从而起到保 护宿主、预防艰难梭菌的作用。
35.5、本发明所提供的重组乳酸乳球菌的制备方法，制备过程简洁，且可直接应用、口服 免疫，不需要注射给药，较为经济的同时避免了静脉注射的潜在感染危险，从而为预防艰 难梭菌提供了一种潜在有效方法。
附图说明
36.图1为目的基因tcda的双酶切结果；其中，(a)为检测图谱，泳道1为酶切结果，得 到片段约1360bp；泳道m为mark；(b)为mark的标准泳道大小。
37.图2为重组质粒pmg36e/tcda的xba i单酶切鉴定结果；其中，(a)为检测图谱， 泳道1-3为酶切结果，得到片段约5000bp；泳道m为mark；(b)为mark的标准泳道大小。
38.图3为重组乳酸乳球菌pmg36e/tcda/ll的xba i单酶切鉴定结果；其中，(a)为检 测图谱，泳道1-3为质粒，得到片段约小于5000bp；泳道4为阴性质粒，得到片段约小于 3600bp；泳道5-7为酶切结果，得到片段约5000bp；泳道8为阴性酶切结果，得到片段约 3600bp；泳道m为mark；(b)为mark的标准泳道大小。
39.图4为重组乳酸乳球菌pmg36e/tcda/ll的pcr鉴定结果；其中，(a)为检测图谱， 泳道1-3为pcr鉴定结果，得到片段约2000bp；泳道m为mark；(b)为mark的标准泳 道大小。
40.图5为重组乳酸乳球菌的sds-page鉴定结果；其中，(a)为检测图谱，泳道1为空 载乳酸乳球菌的鉴定结果，泳道2为重组乳酸乳球菌的鉴定结果，得到目的蛋白约50kda， 泳道m为mark；(b)为mark的标准泳道大小。
41.图6为重组乳酸乳球菌的western blot鉴定结果；其中，(a)为检测图谱，泳道1为重 组乳酸乳球菌的鉴定结果，得到目的蛋白约50kda，泳道2为空载乳酸乳球菌的鉴定结果， 泳道m为mark；(b)为mark的标准泳道大小。
具体实施方式
42.以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述 实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本 领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发 明。
43.实施例重组艰难梭菌亚单位tcda质粒-乳酸乳球菌菌株制备及鉴定
44.本实施例使用的艰难梭菌亚单位tcda的目的基因片段，核酸序列为如下(下划线为酶 切位点xba i和sac i的碱基序列)：
45.ccatgggcaaaatggttaccggtgttttcaaaggtccgaacggtttcgaatactt cgctccggctaacacccacaacaacaacatcgaaggtcaggctatcgtttaccagaac aaattcctgaccctgaacggtaaaaaatactacttcgacaacgactctaaagctgtta ccggttggcagaccatcgacggtaaaaaatactacttcaacctgaacaccgctgaagc tgctaccggttggcagaccatcgacggtaaaaaatactacttcaacctgaacaccgct gaagctgctaccggttggcagaccatcgacggtaaaaaatactacttcaacaccaaca ccttcatcgcttctaccggttacacctctatcaacggtaaacacttctacttcaacacc gacggtatcatgcagatcggtgttttcaaaggtccgaacggtttcgaatacttcgctcc ggctaacaccgacgctaacaacatcgaaggtcaggctatcctgtaccagaacaaattc ctgaccctgaacggtaaaaaatactacttcggttctgactctaaagctgttaccggtct gcgtaccatcgacggtaaaaaatactacttcaacaccaacaccgctgttgctgttacc ggttggcagaccatcaacggtaaaaaatactacttcaacaccaacacctctatcgctt ctaccggttacaccatcatctctggtaaacacttctacttcaacaccgacggtatcatg cagatcggtgttttcaaaggtccggacggtttcgaatacttcgctccggctaacaccg acgctaacaacatcgaaggtcaggctatccgttaccagaaccgtttcctgtacctgca cgacaacatctactacttcggtaacaactctaaagctgctaccggttgggttaccatcg acggtaaccgttactacttcgaaccgaacaccgctatgggtgctaacggttacaaaac catcgacaacaaaaacttctacttccgtaacggtctgccgcagatcggtgttttcaaa ggttctaacggtttcgaatacttcgctccggctaacaccgacgctaacaacatcgaag gtcaggctatccgttaccagaaccgtttcctgcacctgctgggtaaaatctactacttc ggtaacaactctaaagctgttaccg
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46.上述酶切位点xba i和sac i也可以替换为本领域使用的载体pmg36e上存在的其他常 规酶切位点。
47.依据艰难梭菌亚单位tcda的碱基序列，经双酶切(酶切位点分别为xba i和sac i)得 到艰难梭菌亚单位tcda的目的基因片段，然后在xba i和sac i中插入质粒 puc57-simple，保存于大肠杆菌top10中，记为puc57-simple/tcda/top10。
48.本实施例提供的抗艰难梭菌亚单位乳酸乳球菌活载体疫苗制备方法包括以下步骤：
49.(1)重组质粒：将艰难梭菌亚单位tcda的目的基因片段插入到双酶切后的载体质粒 中得到重组质粒。该步骤包括以下分步骤：
50.(11)以tcda/puc57-simple质粒为dna模板，经双酶切得到目的基因。
51.采用diaspin柱式质粒dna小量抽提试剂盒(diamond，b110091-0100)从菌株 puc57-simple/tcda/top10抽提质粒，作为dna模板。经双酶切得到表1所述的酶切反应 体系。反应结束后，利用1.5％琼脂糖凝胶对双酶切所得酶切体系进行电泳检测，结果如图 1所示。从图1中可以看出，约1360bp处有目的条带。之后采用琼脂糖凝胶dna回收试 剂盒(tiangen，dp209-03)回收目的片段；其中，目的基因片段tcda的浓度为 22μg/μl。
52.表1酶切反应体系
[0053][0054]
(12)对载体进行双酶切得到载体质粒。
[0055]
对载体pmg36e(购自丰晖生物，yh014)利用xba i/sac i进行双酶切，得到如表2 所示的酶切反应体系。反应结束后，利用1.5％琼脂糖凝胶对双酶切所得酶切体系进行电泳 检测，之后采用超薄dna产物纯化试剂盒(tiangen，dp203-02)回收载体pmg36e； 其中，载体pmg36e的浓度为8μg/μl。
[0056]
表2酶切反应体系
[0057][0058]
(13)利用连接酶将目的基因片段和载体进行连接。
[0059]
在10
×
t
4 dna ligase buffer中，利用t4连接酶将步骤(12)回收的基因片段tcda和 载体pmg36e，于22℃连接2h，所得连接体系如表3所示。
[0060]
表3连接体系
[0061][0062]
(14)将步骤(13)所得连接产物转入大肠杆菌感受态细胞中进行培养。
[0063]
将连接产物转入大肠杆菌top10感受态细胞(购自生工，b528412-0010)中，置于冰 浴中静止30min，然后于42℃热休克90sec，再置于冰浴3min，之后加入1ml soc培养 基，于37℃、220rpm振荡孵育45min；孵育结束后，取100μl菌液均匀涂布于含红霉素抗 性lb(lb culture)平板，于37℃培养过夜。之后，从转化平板上挑取单菌落，接种于含 红霉素抗性lb培养基中，于37℃、220rpm条件下培养过夜。
[0064]
(15)对步骤(14)中所得培养液利用试剂盒进行抽提质粒，得到pmg36e/tcda重组 质粒，试剂盒洗脱液中pmg36e/tcda重组质粒浓度为0.1～1mg/ml。
[0065]
将抽提的质粒进行xba i单酶切，参考表4所示的酶切反应体系。反应结束后，利用 1.5％琼脂糖凝胶对单酶切所得酶切体系进行电泳检测，结果如图2所示。从图2中可以看 出，在5000bp附近有目的条带。
[0066]
表4酶切反应体系
[0067][0068][0069]
将步骤(15)得到的重组质粒送至测序(本实施例中由生工生物工程股份有限公司完 成)，测序结果与提交的合成序列信息完全一致，说明成功构建pmg36e/tcda重组质粒。
[0070]
(2)重组乳酸乳球菌：将重组质粒电转化入乳酸乳球菌感受态细胞中得到重组乳酸 乳球菌。该步骤包括以下分步骤：
[0071]
(21)制备乳酸乳球菌感受细胞，包括以下分步骤：
[0072]
(211)培养乳酸乳球菌。
[0073]
本实施使用的乳酸乳球菌，被命名为hxllc20-1，保存于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.20064。
[0074]
按2％接种量将2ml乳酸乳球菌接种于含1％甘氨酸的100ml mrs培养基，于30℃、 220rpm条件下培养5h至对数中期。
[0075]
(212)对培养的乳酸乳球菌进行多次离心洗涤，得到乳酸乳球菌感受细胞。
[0076]
首先，将培养所得菌液转移至两个预冷的50ml离心管中，置于冰浴冷却20min。
[0077]
然后，将两离心管中菌液分别进行洗涤，具体包括以下操作：(i)将两离心管于4℃、 4000rpm离心7min，吸除上清，再分别向两个离心管中加入30ml预冷的无菌水，轻柔吹 打，使菌体沉淀混合均匀；(ii)将两离心管于4℃、4000rpm离心7min，吸除上清，再分 别向两个离心管中加入30ml预冷的洗涤液(为含有0.5m蔗糖、10％甘油的无菌水)，轻 柔吹打，使菌体沉淀混合均匀，再将两离心管合为一管。
[0078]
再次，将合并后的离心管中菌液进行洗涤，具体包括以下操作：(i)将离心管于4℃、 4000rpm离心7min，吸除上清，再加入30ml预冷的洗涤液(为含有0.5m蔗糖、10％甘 油的无菌水)，轻柔吹打，使菌体沉淀混合均匀；(ii)将离心管于4℃、4000rpm离心7min， 吸除上清，再加入10ml预冷的洗涤液(为含有0.5m蔗糖、10％甘油的无菌水，轻柔吹打， 使菌体沉淀混合均匀；(iii)将离心管于4℃、4000rpm离心7min，吸除上清，再加入2ml 预冷的保存液(为含有0.5m蔗糖、10％甘油的无菌水)，轻柔吹打，混合均匀，得到含有 乳酸乳球菌感受细胞的菌悬液。
[0079]
最后，按照100μl/管将菌悬液分装到预冷的1.5ml无菌离心管中，于-80℃保存备用。
[0080]
(22)将重组质粒pmg36e/tcda电转化入乳酸乳球菌感受态细胞中得到抗艰难梭菌的 重组乳酸乳球菌，包括以下分步骤：
[0081]
(221)在冰浴环境下，将pmg36e/tcda重组质粒与乳酸乳球菌感受态细胞混匀，然 后置于电转仪中进行电激；
[0082]
将10μl步骤(15)pmg36e/tcda重组质粒与100μl乳酸乳球菌感受态细胞轻轻混匀 后，加入预冷的2mm电转化杯中，置于冰浴中静置5min，以上操作均在冰浴环境中操作。
[0083]
之后，迅速将电转杯擦拭干净，置于电转仪中电激，电激条件：200ω、10kv/cm、25 μf。
[0084]
(222)电激结束后，向所得混合体系中加入再生培养基，经孵育得到含有重组乳酸乳 球菌菌株的培养液。
[0085]
电激结束后，立即向电转杯中加入1ml的再生培养基(含0.5m蔗糖、20mm mgcl2、 20mm cacl2的mrs培养基，混合均匀后，转移至1.5ml离心管中，再置于冰浴静置10min， 之后于30℃、220rpm调节下震荡孵育2h。
[0086]
之后，取100μl所得孵育产物涂布于含红霉素抗性的mrs培养基平板上，于30℃培 养过夜，得到含有重组乳酸乳球菌pmg36e/tcda/ll株的单克隆。
[0087]
下面对本实施例制备得到的抗艰难梭菌亚单位乳酸乳球菌活载体疫苗进行菌株鉴定、 重组蛋白tcda及免疫原性鉴定、稳定性检测。
[0088]
(一)重组菌株的筛选和鉴定
[0089]
从含有抗艰难梭菌亚单位乳酸乳球菌活载体疫苗的培养液平板上挑取单菌落接种至含 红霉素抗性的mrs培养基中，于30℃、220rpm培养5h。菌液浑浊后，抽提质粒。
[0090]
将抽提的质粒进行xbai单酶切鉴定(酶切反应体系同上表4)，单酶切条件为：在10
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fast digest buffer缓冲液和去离子组成的混合体系中，将xba i插入相应酶切位点，然后 于37℃消化1h。反应结束后，利用1.5％琼脂糖凝胶对单酶切所得酶切体系进行电泳检测， 结果如图2所示。从图3中可以看出，约5000bp处有目的条带。
[0091]
将单酶切鉴定结果正确的质粒，以pmg36e-cxf/pmg36e-cxr为引物，进行pcr扩增 鉴定(扩增反应体系见表5，反应条件见表6)。反应结束后，利用1.5％琼脂糖凝胶进行电 泳检测，结果如图4所示。从图4中可以看出，约2000bp处有目的条带。
[0092]
表5扩增体系
[0093][0094]
表6反应体系
[0095][0096][0097]
将pcr鉴定结果正确质粒送测序(本实施例中由生工生物工程股份有限公司完成)， 测序结果与提交的合成序列信息完全一致，说明成功构建重组乳酸乳球菌pmg36e /tcda/ll株。
[0098]
(二)重组蛋白tcda及其免疫原性的鉴定
[0099]
将重组乳酸乳球菌pmg36e/tcda/ll株候选疫苗、pmg36e/ll空载重组菌株(制备方 法同上)在含红霉素抗性的mrs培养基中培养后，于5000rpm离心10min，收集培养液 上清。
[0100]
将上清液用超滤管浓缩至原体积1/10后，然后对其进行sds-page电泳检测，结果如 图5所示。从图5中看出，在50kda处有目的条带，说明成功表达重组蛋白tcda。
[0101]
将sds-page凝胶图中预期目的条带切下，采用pierce银染试剂盒进行硝酸银染色 (thermo，24600)。再将染色后的目的条带与经甲醇处理后大小一致的pvdf膜、sds-page 凝胶于4℃转膜过夜，电转膜的电压为14v。电转膜结束后，所得pvdf膜于pbst中浸泡 10min，再放入5％脱脂奶粉中封闭1h。之后加入tcda免疫小鼠阳性抗血清作为一抗，于4℃ 过夜后，再于室温温和震荡孵育1h，之后使用pbst洗涤。然后，加入hrp标记羊抗小鼠 igg(生工，货号d10087-0100)，于室温温和震荡孵育1h，再使用pbst洗涤。
[0102]
按照pierce高灵敏底物显色试剂盒(thermo，34096)，对pvdf膜进行显影，结果如 图6所示。从图6中看出，相对于pmg36e/ll空载重组株，重组乳酸乳球菌pmg36e/tcda/ll 在50kda处可明显检测到目的条带，说明表达的tcda蛋白具有免疫原性，成功构建抗艰 难梭菌亚单位乳酸乳球菌活载体疫苗菌株。
[0103]
(三)重组乳酸乳球菌的稳定性检测
[0104]
测定pmg36e/tcda/ll菌株的生长曲线，得出其迟缓期与世代时间。
[0105]
将重组乳酸乳球菌pmg36e/tcda/ll于30℃、220rpm下传代培养至第20、40代后， 分别随机取100μl新鲜菌液涂布接种于不含红霉素抗性的mrs培养基平板上，于30℃培 养过夜。每个平板再分别随机挑取单菌落100个分别点种在不含红霉素抗性和含红霉素抗 性的mrs培养基平板上，于30℃培养过夜。不含红霉素抗性平板100％生长，含红霉素抗 性平板98％生长，说明该重组乳酸乳球菌pmg36e/tcda/ll在有、无选择压力的情况下均 能稳定
体外传代。
[0106]
应用例重组乳酸乳球菌对艰难梭菌感染的小鼠具有免疫保护作用
[0107]
(1)特异性抗体表征
[0108]
将重组乳酸乳球菌pmg36e/tcda/ll、pmg36e/ll接种于含4μg/ml红霉素的mrs培 养基，于30℃、220rpm培养至对数中期，用生理盐水将菌液调整至10
10
cfu/ml备用。
[0109]
将30只spf级雌性balb/c小鼠，随机分为空白组、阴性组和实验租三组，每组10只。 空白组每只小鼠灌胃200μl无菌生理盐水，阴性组每只小鼠灌胃200μl 10
10
cfu/ml重组 乳酸乳球菌pmg36e/ll菌液，实验组每只小鼠灌胃200μl 10
10
cfu/ml重组乳酸乳球菌 pmg36e/tcda/ll菌液。分别于第0d、1d、2d、7d、14d、23d灌胃给药。
[0110]
收集各组小鼠0d、7d、23d的尾血，离心取上清(即血清)，采用elisa检测小鼠tcda 的特异性igg水平变化。结果显示相比于空白组和阴性组，实验组的抗体效价持续增加， 23d时可达到1：262144且阳性率达到100％，说明实验组中重组乳酸乳球菌pmg36e /tcda/ll定植成功，并顺利分泌表达重组蛋白tcda，刺激宿主产生特异性抗体。
[0111]
(2)免疫保护作用
[0112]
将新鲜艰难梭菌接种于疱肉液体培养基中，厌氧情况下于37℃、100rpm培养至对数中 期，用生理盐水将菌液调整至105cfu/ml备用。
[0113]
第19d起各组小鼠均给予10mg克林霉素，饮用水中添加抗生素混合液(0.4mg/ml卡 那霉素、0.035mg/ml庆大霉素、850u/ml粘菌素、0.215mg/ml甲硝唑、0.045mg/ml万 古霉素)，连续操作三天。
[0114]
各组小鼠在第21d结束克林霉素灌胃4h后，灌胃0.3ml胃酸中和液(nahco3： hank’s＝1：4)，30min后每只小鼠灌胃100μl 105cfu/ml艰难梭菌菌液。
[0115]
攻毒后72小时内每4h观察一次，观察实验动物的粪便、肛门、活动、皮毛形态光泽， 是否有腹泻、死亡。结果显示空白组小鼠在攻毒后全部发生腹泻且症状严重，攻毒1d后陆 续出现死亡，第5d该组小鼠全部死亡。阴性组在攻毒后也全部腹泻但症状略轻于空白组， 23d最后一次给药后出现好转，该组2只小鼠死亡。实验组在攻毒后第1d有2只小鼠出现 轻微腹泻，最后一次给药pmg36e/tcda/ll菌液后2d腹泻停止，该组无小鼠死亡。说明重 组乳酸乳球菌pmg36e/tcda/ll对艰难梭菌感染的小鼠具有免疫保护作用。
[0116]
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的 原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通 技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体 变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。