绿色木霉新菌株及其用途的制作方法

[0001]
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种绿色木霉新菌株及其用途。


背景技术：

[0002]
绿色木霉属于木霉属trichoderma，半知菌门，丝孢目。木霉菌可用来防治病害或抑制病原的主要机制，其行为通常可归类成五大类，即产生抗生素、营养竞争、微寄生、细胞壁分解酵素、以及诱导植物产生抗性。
[0003]
木霉属的部分种类具有代谢产生6-戊基-2h-吡喃-2-酮的特性，如哈茨木霉、深绿木霉等。6-戊基-2h-吡喃-2-酮呈蘑菇、蓝干酪、椰香或乳品香气，具有风味化合物和生物活性物的双重特性，是一种极具价值的食品添加剂和生物防治剂，但供给却有限。张量等人通过对渐绿木霉抑菌物质的分离纯化，鉴定出主要活性物质为6-戊基-2h-吡喃-2-酮，以及其对不同植物病原菌起抑制作用所需浓度(中国农业科学，2005,48(5)：882-888)。陈利军等人通过对一株木霉菌(xyt-12)挥发性物质的研究表明，其主要成分为6-戊基-2h-吡喃-2-酮，对番茄灰霉病菌具有抑菌活性。(生物技术，2010，20(4))。
[0004]
目前，现有的产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的木霉属菌株还比较少，产量还远远达不到需求，因此还需要开发新的能够产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的木霉属菌株。


技术实现要素：

[0005]
本发明要解决的技术问题为：现有产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的木霉属菌株种类少，无法满足产量需求的问题。
[0006]
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种绿色木霉新菌株。该绿色木霉新菌株保藏编号为cgmcc no.20254，保藏时间为2020年9月2日；保藏中心为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
[0007]
本发明所述的绿色木霉新菌株的its序列如seq id no:1所示。
[0008]
seq id no:1绿色木霉新菌株的its序列
[0009]
tttcctccggctattgatatgcttaagttcagcgggtattcctacctgatccgaggtcaacatttcagaagttgggtgttttacggacgtggacgcgccgcgctcccggtgcgagttgtgcaaactactgcgcaggagaggctgcggcgagaccgccactgtatttcggggccgggatcccgtcttaggggctcccgaggtccccaacgccgaccccccggaggggttcgagggttgaaatgacgctcggacaggcatgcccgccagaatactggcgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttgattcattttgaatttttgctcagagctgtaagaaataacgtccgcgaggggactacagaaaagagtttggttggtccctccggcgggcgcctggttccggggctgcgacgcacccggggcgtgaccccgccgaggcaacagtttggtatggttcacattgggtttgggagttgtaaactcggtaatgatccctccgcaggttcaccctacggaaggat。
[0010]
其中，上述绿色木霉新菌株的生物学特征为：菌落圆形、呈白色菌丝发散状，中心
出现绿色孢子；菌体细胞特征为，可见分生孢子梗，分生孢子梗有隔膜，垂直对称分枝，产生分生孢子，分生孢子单生或簇生，圆形或卵形。
[0011]
其中，上述木霉新菌株最高乳酸耐受浓度为52.62g/l，最低耐受ph值为1.97。
[0012]
其中，上述绿色木霉新菌株的筛选方法为：
[0013]
利用重力沉降法，将制备好的采集培养基100ml，于四川宜宾市五粮液技术中心实验室敞口放置6小时，无菌纱布封口后于28℃恒温培养5天，培养基中长出疑是木霉属丝状菌体，接种环挑取菌体于pda琼脂培养基中，编号并划线纯化，重复纯化2～3次，直至平板上的菌落都为同一形态，挑取单菌落制成水浸片，于显微镜下观察菌体细胞形态，环境空气木霉分离纯化完成，斜面试管保存于4℃冰箱。
[0014]
进一步地，上述筛选方法中所用的培养基组成为：
[0015]
采集培养基：乳酸2％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯霉素0.01％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。pda琼脂培养基：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯霉素0.01％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
[0016]
进一步地，所述绿色木霉在pda培养基和孟加拉红培养基上生长代谢产6-戊基-2h-吡喃-2-酮。
[0017]
进一步地，所述的pda培养基组成为：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯霉素0.01％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
[0018]
进一步地，所述的孟家拉红培养基组成为：蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁(mgso4·
7h2o)0.05％，1/3000孟加拉红溶液10％，氯霉素0.01％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
[0019]
其中，上述绿色木霉新菌株产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的量能够达到600mg/l。
[0020]
进一步地，所述绿色木霉发酵产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的最适发酵温度为26～30℃。
[0021]
进一步地，上述酿酒生产环境空气绿色木霉新菌株产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的同时还产3-甲基丁醇、苯乙醇或己醇。
[0022]
进一步地，上述酿酒生产环境空气绿色木霉新菌株具有大曲黄曲霉抑制能力。
[0023]
本发明还提供了一种上述酿酒生产环境空气绿色木霉新菌株在大曲制备或配制酒制备上的用途。
[0024]
本发明的有益效果为：
[0025]
本发明首次从酿酒生产环境空气中获得了绿色木霉，并创新性的采用含高浓度乳酸的采集培养基进行采集，选育出的绿色木霉具有很高的耐乳酸能力，最高耐受乳酸浓度为52.62g/l，最低耐受ph值为1.97(现有木霉生长ph值为3.5～5.8)，扩大了绿色木霉属的应用范围。本发明选育出的绿色木霉还具有一定的大曲黄曲霉抑制能力，扩大了其在酿酒原辅料方面的应用范围。本发明选育出的绿色木霉代谢主产物为6-戊基-2h-吡喃-2-酮，代谢副产物主要有3-甲基丁醇、苯乙醇、己醇等香气成分，为提升白酒的香气成分的来源提供了一条生成途径。
[0026]
本发明提供一种酿酒生产环境空气绿色木霉新菌株，保藏编号为cgmcc no.20254，保藏时间为2020年9月2日；保藏中心为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微
生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为绿色木霉trichoderma viride。
附图说明
[0027]
图1为实施例2中pda平板菌落形态特征图；
[0028]
图2为实施例2中绿色木霉的细胞学特征图；
[0029]
图3为实施例4绿色木霉对黄曲霉菌的抑制能力对比图；
[0030]
图4为实施例5绿色木霉产物gc-ms检测色谱图；
[0031]
图5为实施例6中孟加拉红培养基和察氏培养基菌落形态对比图；
[0032]
图6为实施例7中发酵周期对产率的影响对比图。
具体实施方式
[0033]
本发明提供了一种酿酒生产环境空气绿色木霉新菌株，保藏编号为cgmcc no.20254，保藏时间为2020年9月2日；保藏中心为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
[0034]
本发明所述的酿酒生产环境空气绿色木霉新菌株的its核苷酸序列如seq id no:1所示。
[0035]
本发明所述的绿色木霉新菌株来自于四川宜宾市五粮液技术中心实验室的酿酒生产环境空气中，在偶然的条件下采集得到，经pda琼脂培养基培养后分离鉴定为木霉属trichoderma。
[0036]
本发明的木霉新菌株能够代谢产6-戊基-2h-吡喃-2-酮，在pda液体培养基中培养15天，产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的量约为40mg/l，在高粱固体培养基中培养15天，产率能够达到大于600mg/l，产量显著高于现有分离得到的木霉菌株。本发明木霉新菌株能够所产6-戊基-2h-吡喃-2-酮具有椰香风味，同时，本发明的木霉新菌株还能产3-甲基丁醇、苯乙醇或己醇，能够提升酒类风味，可以应用于配制酒生产中。
[0037]
另一方面，本发明筛选分离得到的木霉新菌株还具有大曲黄曲霉抑制能力，其代谢产物是白酒风味成分，具有食品安全特征，可以应用于大曲生产过程中对黄曲霉的抑制。
[0038]
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
[0039]
实施例1木霉菌株的筛选
[0040]
采集培养基：乳酸2％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯霉素0.01％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
[0041]
pda琼脂培养基：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯霉素0.01％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
[0042]
利用重力沉降法，将制备好的采集培养基100ml，于四川宜宾市五粮液技术中心实验室敞口放置6小时，无菌纱布封口后于28℃恒温培养5天，培养基中长出疑是木霉属丝状菌体，接种环挑取菌体于pda琼脂培养基中，编号并划线纯化，重复纯化2～3次，直至平板上的菌落都为同一形态。挑取单菌落制成水浸片，于显微镜下观察菌体细胞形态，环境木霉分
离纯化完成，斜面试管保存于4℃冰箱。
[0043]
实施例2本发明木霉属菌株的形态特征及分子鉴定
[0044]
1、菌落及菌体形态观察
[0045]
将经活化的木霉属新菌株用接种环划线接种于pda培养基上，28℃培养3d，观察菌落形态特征；挑取菌丝，以乳酸石炭酸棉蓝染色液进行染色制片，于显微镜下观察菌体细胞特征。
[0046]
菌落形态特征：菌落圆形、呈白色菌丝发散状，中心出现绿色孢子。如图1所示。
[0047]
菌体细胞特征：可见分生孢子梗，分生孢子梗有隔膜，垂直或锐角对称分枝，产生分生孢子，分生孢子单生或簇生，圆形或卵形，如图2所示。
[0048]
2、分子鉴定
[0049]
提取菌株基因组dna，选用its通用引物对正向引物its1：tccgtaggtgaacctgcgg(seq id no:2)、反向引物its4:tcctccgcttattgatatgc(seq id no:3)扩增基因组dna，反应条件为：95℃预变性5min后,进入以下循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将pcr扩增产物寄送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在ncbi数据库上进行blast序列比对，确定为绿色木霉，并命名为wly-l-m-01。该菌株已于2020年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.20254，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株的核苷酸序列如seq id no:1所示。
[0050]
实施例3本发明绿色木霉新菌株乳酸耐受力
[0051]
pda培养基：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯霉素0.01％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
[0052]
绿色木霉菌悬液：将适量的无菌水加入已活化的绿色木霉pda试管斜面培养基中，用无菌接种环洗脱孢子，制备孢子悬液。
[0053]
乳酸-pda发酵培养基：配制pda培养基，分装11份，各50ml于150ml三角瓶中，其中10份加入不同量的乳酸调节ph，另1份空白对照样加入等量的pda培养基补充，自然ph；121℃灭菌20min，冷却，无菌条件下，各接入1ml绿色木霉菌悬液，28℃恒温培养15天，取各发酵培养基0.1ml,甲醇稀释，0.2um膜过滤后作为待测样品，进样液相色谱-四极杆飞行时间质谱(lc-qtof)，测定6-戊基-2h-吡喃-2-酮含量。各乳酸-pda发酵培养基，过滤得菌体，菌体烘干称重，与1ml绿色木霉菌悬液烘干重量(初始菌体重量)对比，下表1所示为乳酸耐受性情况表，大于初始菌体重量则说明菌体生长，以“√”表示，小于或等于初始菌体重量则说明菌体没有生长，以
“×”
表示。
[0054]
表1乳酸耐受性
[0055]
样品编号乳酸浓度(g/l)ph值菌体生长情况6pp产率/14d(mg/l)rs105.82√43.20rs20.114.51√35.90rs30.633.67√34.52rs44.652.88√34.36rs511.462.51√11.91rs621.232.32√3.47
rs730.962.18√1.47rs838.292.10√0.77rs947.002.05√0.41rs1052.621.97√0.27rs1164.041.91
×0[0056]
由表1可看出，本发明筛选得到的木霉最高耐受乳酸浓度为52.62g/l，最低耐受ph值为1.97。
[0057]
实施例4本发明绿色木霉新菌株黄曲霉菌抑制能力
[0058]
将适量的无菌水加入已活化的黄曲霉(编号wly-l-hqm-1，来自于酿酒大曲)试管斜面培养基中，用无菌接种环洗脱孢子，制备孢子悬液；再将孢子悬液稀释至适宜梯度，涂布于已灭菌pda平板培养基上，另空白对照平板上不涂布黄曲霉菌悬液，在平板培养基中心，用打孔器各接入直径5mm的实施例4中所述绿色木霉pda平板菌，在28℃恒温培养室内培养3天，观察绿色木霉对黄曲霉的抑制效果，空白对照平板与黄曲霉涂布平板对比图，如图3所示。pda平板中心绿色木霉圆形发射状生长区域未见黄曲霉生长，平板边缘，未生长绿色木霉的地方才可见黄曲霉菌落，由此说明，该绿色木霉对大曲黄曲霉具有抑制生长能力。
[0059]
实施例5本发明绿色木霉新菌株产物分析
[0060]
pda平板菌的制备：将适量的无菌水加入已活化的绿色木霉pda试管斜面培养基中，用无菌接种环洗脱孢子，制备孢子悬液。再将孢子悬液稀释至适宜梯度，涂布于已灭菌pda琼脂培养基上，在28℃恒温培养室内培养3天，待整个平板中长满白色菌丝出后便可使用，或于4℃下保藏备用。
[0061]
取pda平板菌，用打孔器取直径5mm的平板菌5份于顶空瓶中，采用顶空固相微萃取，结合气相质谱法鉴别分析菌株挥发性产物，菌株主产物为6-戊基-2h-吡喃-2-酮。副产物主要有3-甲基丁醇、苯乙醇、己醇，gc-ms分析色谱图，如图4所示。
[0062]
实施例6对本发明的绿色木霉新菌株采用不同培养基培养
[0063]
pda培养基：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯霉素0.01％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
[0064]
孟家拉红培养基：蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁(mgso4·
7h2o)0.05％，1/3000孟加拉红溶液10％，氯霉素0.01％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
[0065]
察氏培养基：硝酸钠0.3％，磷酸氢二钾0.1g％，硫酸镁(mgso4·
7h2o)0.05％，氯化钾0.05％，硫酸亚铁0.001％，蔗糖3％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
[0066]
分别配制pda培养基，孟家拉红培养基，察氏培养基，挑取试管斜面菌种，点接于三种培养基平板上，于28℃恒温培养4天，对比该霉菌在不同培养基上的生长形态。结果显示，pda培养基上白色菌丝繁殖最快，菌落中心出现绿色孢子，椰香浓郁，说明代谢生成了椰香成分6-戊基-2h-吡喃-2-酮，见图1；孟加拉红培养基上菌丝长势较好，易形成孢子，孢子呈黄色，浅绿色，产椰香成分6-戊基-2h-吡喃-2-酮，见图5；察氏培养基上未见菌丝繁殖，可见孢子形态，不产椰香成分，见图5。由此，pda培养基和孟加拉红培养基均适合该菌的生长代谢。
[0067]
实施例7产6-戊基-2h-吡喃-2-酮最适温度及发酵周期
[0068]
pda培养基：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯霉素0.01％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
[0069]
配制pda培养基，分装6份，各50ml，自然ph，121℃灭菌20min，冷却；打孔器各接入直径5mm pda平板菌(同实施例5中pda平板菌的制备方法)，分别放置在24℃、26℃、28℃、30℃、32℃5个不同温度下恒温培养，从第5天开始，每隔2天检测液体培养基中6-戊基-2h-吡喃-2-酮的产率，如图6所示，26～30℃之间，6-戊基-2h-吡喃-2-酮产率较高且基本一致，为该绿色木霉的最适培养温度；培养15天后，6-戊基-2h-吡喃-2-酮产率增长缓慢，由此15～20天，为最佳培养周期。