能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因及其应用

能降低玉米中
α
醇溶蛋白的靶点基因及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因及其应用。
技术背景
2.玉米(zea mays)是世界上产量最高的禾本科作物之一。除了作为粮食外，玉米还是禽畜重要的饲料来源，也是重要的工业原料。因此玉米对于社会的进步起到了重要的作用。随着人们生活水平的不断提高，对于所摄取食物的品质也提出了更高的要求。因而玉米的蛋白质品质是一个重要的研究性状。
3.醇溶蛋白是玉米籽粒中的主要储藏蛋白，占总蛋白的60％以上，然而其赖氨酸和色氨酸等必需氨基酸含量极低，导致传统的玉米籽粒中氨基酸组成不均衡。在籽粒主要农艺性状不改变的条件下，降低籽粒中醇溶蛋白的比例能够显著地提高籽粒的蛋白质品质。
4.玉米籽粒中醇溶蛋白由4个基因家族编码，分为α
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zein(mr 19kda、22kda)，β
‑
zein(mr 14kda)，γ
‑
zein(mr 16kda、27kda)，δ
‑
zein(mr 10kda、15kda)。其中，α醇溶蛋白和γ醇溶蛋白的含量占比较高，分别占了醇溶蛋白的总含量的60
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70％、20
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25％。α醇溶蛋白是最早被描述的储藏蛋白之一。实验研究表明α醇溶蛋白是由几个大的多基因家族编码，通过利用序列同源及基于dna的southern blot实验得到的拷贝数，将α醇溶蛋白分为z1a、z1b、z1c和z1d四个亚家族。根据分子量的不同，其中z1a、z1b、z1d属于19kd蛋白家族，而z1c属于22kd蛋白家族。
5.尽管α醇溶蛋白基因家族的大小和复杂度在各个自交系中有明显的差异，但是基因序列却高度保守。在19kd基因家族内部，z1a、z1b、z1d各亚家族成员之间的同源度在75％到95％之间，而19kd和22kd基因家族之间的同源度也有60％
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65％。根据其同源性，利用crispr/cas9技术构建靶向19kd和22kdα醇溶蛋白基因的转化载体，通过农杆菌介导的玉米幼胚转化技术来获得转基因后代，进而分析一系列生理生化表现及细胞学变化，以期获得高赖氨酸的转基因玉米果穗。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于提供一种能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因。
7.本发明的目的之二在于提供含有该靶点基因的表达载体。
8.本发明的目的之三在于提供该表达载体的构建方法。
9.本发明的目的之四在于提供该基因能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因在降低玉米中α醇溶蛋白含量，提高赖氨酸含量中的应用。
10.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
11.一种能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因，其特征在于该靶点基因为seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示的核酸序列中任意一种或两种。
12.上述的能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因，其特征在于该靶点基因为seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示的核酸序列中任意两种。
13.上述的能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因，其特征在于该靶点基因为seq id no.1和seq id no.2所示的核酸序列或seq id no.3和seq id no.4所示的核酸序列。
14.一种表达载体，其特征在于该表达载体含有上述的能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因。
15.上述的表达载体，其特征在于该表达载体为seq id no.5或seq id no.6所示的核酸序列。
16.一种构建上述的表达载体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将分别带有敲除19kd和22kdα醇溶蛋白基因双靶点的trna
‑
grna连入转基因载体中获得所需的表达载体，其中所述的转基因载体经过改造，以玉米u6启动子和终止子表达grna，同时以玉米泛素启动子和nos终止子表达玉米密码子优化的cas9蛋白。
17.一种上述的能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因在降低玉米中α醇溶蛋白含量，提高赖氨酸含量中的应用。
18.本发明通过sds
‑
page分析和western blot实验明确了19kd和22kdα醇溶蛋白分别有不同程度的下降。
19.通过醇溶蛋白抽提实验以及蛋白定量证明了19kd和22kdα醇溶蛋白分别有不同程度的下降。通过crispr
‑
cas9基因突变创造的19kd和22kdα醇溶蛋白突变体玉米在醇溶蛋白累积中有明显下降，从而使籽粒的营养品质显著提升。
附图说明
20.图1是crispr/cas9双元载体示意图。
21.图2是19kd醇溶蛋白z1a家族靶点选取图。
22.图3是19kd醇溶蛋白z1b家族靶点选取图。
23.图4是22kd醇溶蛋白z1c家族靶点一选取图。
24.图5是22kd醇溶蛋白z1c家族靶点二选取图。
25.图6是19kd
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cas9和22kd
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cas9载体构建过程图。
26.图7是转基因阳性事件的southern blot拷贝数检测分析结果图。
27.图8是19kd
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cas9和22kd
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cas9的转基因事件编辑情况。
28.图9是成熟籽粒的胚乳总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白sds
‑
page分析。其中，1、2、3、4为19kd
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cas9转基因事件，5、6为22kd
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cas9转基因事件。
29.图10是成熟籽粒的胚乳总蛋白、醇溶蛋白及非醇溶蛋白定量分析。
30.图11是成熟籽粒的胚乳19kd、22kd醇溶蛋白western blot检测。
31.图12是成熟籽粒的胚乳19kd、22kd醇溶蛋白氨基酸检测。
32.图13是郑58自交系背景下成熟籽粒的胚乳总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白sds
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page分析。其中，1、2、3、4为19kd
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cas9转基因事件，5、6为22kd
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cas9转基因事件。
33.图14是昌7
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2自交系背景下成熟籽粒的胚乳总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白sds
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page分析。其中，1、2、3、4为19kd
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cas9转基因事件，5、6为22kd
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cas9转基因事件。
具体实施方式
34.下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明
而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(molecular cloning:a laboratory manual,3rd ed.)或植物分子生物学－实验手册(plant molecular biology－a laboratory manual,melody s.clark编，springer
‑
verlag berlin heidelberg,1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
35.实施例一：19kd与22kdα醇溶蛋白的crispr
‑
cas9转基因载体，并用于转基因转化。
36.根据19kd和22kd醇溶蛋白家族，同源性高，且根据cas9蛋白识别位点特征分别为19kd和22kd选择了2个靶点，其中，19kd
‑
cas9载体的两个靶点分别位于z1a和z1b基因上(图2，3)，22kd
‑
cas9载体的两个靶点均位于z1c上(图4，5)。该四个靶点的基因的序列为：
37.gttacctttggtgcatttgttgg；
38.gtcattggtacaaaccatcaggg；
39.gttacttaatccactggcagtgg；
40.ggctcttagtcagctagttgtgg。
41.实施例二：选取玉米的crispr
‑
cas9载体作为农杆菌转化玉米幼胚的载体。实验选择玉米gly
‑
trna系统，设计了双元trna
‑
grna单元，在玉米第一号染色体上的u6启动子的启动下同时产生两个guide rna，引导cas9蛋白在同一个基因的两个位点进行编辑(图1)，极大地提升基因编辑效率。具体构建19kd
‑
cas9和22kd
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cas9载体表达载体的过程：
42.1.合成的有目的靶点片段经bsshⅱ单酶切后，获得带有目的靶点片段的产物；
43.2.将合成片段与连有u6启动子与u6终止子的改造后的pmd18
‑
t载体相连接之后的中间过渡载体，进行菌液鉴定，选取阳性克隆测序；
44.3.测序正确的中间过渡载体经hindⅲ单酶切后，获得由u6启动子与u6终止子驱动的含有目的靶点片段的产物；
45.4.由ubq启动子启动且已改造到pcambia3301载体上的crispr/cas9终载体系统经hindⅲ单酶切后，再与由u6启动子与u6终止子驱动的含有目的靶点片段相连，完成载体构建；
46.5.终载体转化成功后菌液鉴定，挑取阳性克隆，电击转化eha105菌株。
47.选取pbpa玉米品系授粉8
‑
12天的幼胚，大小约1.5mm左右作为受体材料，进行幼胚转化，具体流程：
48.6.农杆菌侵染10min共培养20℃3天。
49.7.恢复培养28℃7天
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筛选培养(双丙氨磷1.5mg/l)28℃14天。
50.8.筛选培养(双丙氨磷3mg/l)28℃14天3
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5轮。
51.9.获得抗性愈伤组织
‑
暗再生培养28℃14
‑
21天。
52.10.光再生培养28℃14
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21天
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获得阳性苗。
53.11.移入盆中，授粉并获得后代。
54.结果：构建了19kd
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cas9和22kd
‑
cas9表达载体(图6)。其基因序列为：aagcttaagtcgtaaaatagtggtgtccaaagaatttccaggcccagttgtaaaagctaaaatgctattcgaatttctactagcagtaagtcgtgtttagaaattatttttttatataccttttttccttctatgtacagtaggacacagtgtcagcgccgcgttgacggagaatatttgcaaaaaagtaaaagagaaagtcatagcggcgtatgtgccaaaaacttcgtcacagagagggccataagaaacatggcccacggcccaatacgaagcaccgcgacgaagcccaaacagcagtccgtaggtggagcaaagcgctgggtaatacgcaaacgttttgtcccaccttgactaatcacaagagtggagcgtaccgcgcgcaccgagccgca
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cctcgcccgcggcaactcccgcttcgcctggatgacccgcaagtccgaggagaccatcaccccctggaacttcgaggaggtcgtcgacaagggcgcctccgcccagtccttcatcgagcgcatgaccaacttcgacaagaacctccccaacgagaaggtcctccccaagcactccctcctctacgagtacttcaccgtctacaacgagctgaccaaggtcaagtacgtcaccgagggcatgcgcaagcccgccttcctctccggcgagcagaagaaggccatcgtcgacctcctcttcaagaccaaccgcaaggtcacggtcaagcagctcaaggaggactacttcaagaagatcgagtgcttcgactccgtcgagatcagcggcgtcgaggaccgcttcaacgcctccctcggcacctaccacgacctcctcaagatcatcaaggacaaggacttcctcgacaacgaggagaacgaggacatcctcgaggacatcgtcctcaccctcaccctcttcgaggaccgcgagatgatcgaggagcgcctcaagacctacgcccacctcttcgacgacaaggtcatgaagcagctcaagcgccgccgctacaccggctggggccgcctctcccgcaagctcatcaacggcatccgcgacaagcagtccggcaagaccatcctcgacttcctcaagtccgacggcttcgccaaccgcaacttcatgcagctcatccacgacgactccctcaccttcaaggaggacatccagaaggcccaggtctccggccagggcgactccctccacgagcacatcgccaacctcgccggctcccccgccatcaagaagggcatcctccagaccgtcaaggtcgtcgacgagctggtcaaggtcatgggccgccacaagcccgagaacatcgtcatcgagatggcccgcgagaaccagaccacccagaagggccagaagaactcccgcgagcgcatgaagcgcatcgaggagggcatcaaggagctgggctcccagatcctcaaggagcaccccgtcgagaacacccagctccagaacgagaagctctacctctactacctccagaacggccgcgacatgtacgtcgaccaggagctggacatcaaccgcctctccgactacgacgtcgaccacatcgtcccccagtccttcctcaaggacgactccatcgacaacaaggtcctcacccgctccgacaagaaccgcggcaagtccgacaacgtcccctccgaggaggtcgtcaagaagatgaagaactactggcgccagctcctcaacgccaagctcatcacccagcgcaagttcgacaacctcaccaaggccgagcgcggcggcctctccgagctggacaaggccggcttcatcaagcgccagctcgtcgagacccgccagatcaccaagcacgtcgcccagatcctcgactcccgcatgaacaccaagtacgacgagaacgacaagctcatccgcgaggtcaaggtcatcaccctcaagtccaagctcgtctccgacttccgcaaggacttccagttctacaaggtccgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctcaacgccgtcgtcggcaccgccctcatcaagaagtaccccaagctcgagtccgagttcgtctacggcgactacaaggtctacgacgtccgcaagatgatcgccaagtccgagcaggagatcggcaaggccaccgccaagtacttcttctactccaacatcatgaacttcttcaagaccgagatcaccctcgccaacggcgagatccgcaagcgccccctcatcgagaccaacggcgagaccggcgagatcgtctgggacaagggccgcgacttcgccaccgtccgcaaggtcctctccatgccccaggtcaacatcgtcaagaagaccgaggtccagaccggcggcttctccaaggagtccatcctccccaagcgcaactccgacaagctcatcgcccgcaagaaggactgggaccccaagaagtacggcggcttcgactcccccaccgtcgcctactccgtcctcgtcgtcgccaaggtcgagaagggcaagtccaagaagctcaagtccgtcaaggagctgctcggcatcaccatcatggagcgctcctccttcgagaagaaccccatcgacttcctcgaggccaagggctacaaggaggtcaagaaggacctcatcatcaagctccccaagtactccctcttcgagctggagaacggccgcaagcgcatgctcgcctccgccggcgagctgcaaaagggcaacgagctggccctcccctccaagtacgtcaacttcctctacctcgcctcccactacgagaagctcaagggctcccccgaggacaacgagcagaagcagctcttcgtcgagcagcacaagcactacctcgacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagcgcgtcatcctcgccgacgccaacctcgacaaggtcctctccgcctacaacaagcaccgcgacaagcccatccgcgagcaggccgagaacatcatccacctcttcaccctcaccaacctcggcgcccccgccgccttcaagtacttcgacaccaccatcgaccgcaagcgctacacctccaccaaggaggtcctcgacgccaccctcatccaccagtccatcaccggcctctacgagacccgcatcgacctctcccagctcggcggcgacggctccggatccaagcgccccgccgccaccaagaaggccggccaggccaagaagaagaagtgagctagcgagctcgcacgtggtcgattgatgcatgttgtcaatcaattggcaagtcataaaatgcattaaaaaatattttcatactcaactacaaatccatgagtataactataattataaagcaatgattagaatctgacaaggattctggaaaattacataaaggaaagttcataaatgtctaaaacacaagagga
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55.选取1000个幼胚作为受体材料，经过转化筛选后获得10个转基因阳性事件。获得后对各个事件进行鉴定，通过tps法抽提各事件植株的基因组，并针对guide rna序列所在基因组的位置，设计跨越guide rna序列pcr引物，扩增得到目的片段后进行ta克隆，挑选阳性克隆进行测序，由于19kd和22kd醇溶蛋白家族基因数量庞大，同源性高，因此我们只能做一个粗略的基因型鉴定(图8)。
56.实施例三：19kd
‑
cas9和22kd
‑
cas9转基因阳性事件的叶片基因组大量抽提
57.1.首先向50ml离心管中加入10ml基因组大量抽提液，并在离心管盖和离心管壁上做相应的标记；
58.2.取1
‑
3g整片的新鲜嫩叶，去除叶脉，放进
‑
80℃冰箱进行备用；或者，放入液氮中进行速冻，研磨成泛白的粉末，直接进行实验。将粉末放进相应编号的50ml离心管中(含有dna大抽提取液)，并加入20ul的10mg/ml的rna酶母液，上下颠倒，混合均匀，室温静置10min；
59.3.每管加入与提取液等量的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，剧烈震荡，充分混匀，4℃，12000rpm离心10min；
60.4.吸取全部上清到新的50ml离心管中，写上编号，向其中加入总体积0.7倍的异丙醇，上下轻轻颠倒，出现絮状沉淀，立即进行下一步；也可放置于
‑
20℃，30min，使基因组dna充分沉淀；
61.5.将絮状沉淀挑出，移到2ml ep管中，用70％乙醇洗3次；
62.6.吸尽乙醇，将沉淀放在65℃条件下烘干，加入1ml 1
×
te溶液溶解沉淀，再加入20ul的10mg/ml rnaase，37℃，1h，消化rna；
63.7.电泳检测：取1ul的样品加3ul的染色液进行琼脂糖凝胶电泳，判断rna是否被完全消化；
64.8.确定样品中rna降解完全后，向其中加入与溶液等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分混匀，4℃，12000rpm，离心10min；
65.9.将上清转移到另一个新的2ml ep管中(注意不要吸到下层杂质)，加入7/10体积的异丙醇和1/10体积的醋酸钠(ph＝5.2)，轻柔混匀，待出现絮状沉淀；
66.10.将沉淀转移至新的2ml ep管中，用70％乙醇洗3遍，除尽乙醇，将沉淀在37℃条件下烘干，加入100μl的1
×
te溶解沉淀，用于做southern blot实验。实施例四：19kd
‑
cas9和22kd
‑
cas9转基因阳性事件的southern blot拷贝数检测分析为了研究转基因玉米中转化拷贝数的情况，我们对部分转基因阳性植株用ecorⅰ和hindⅲ两种酶进行酶切，并进行southern blot分析。本实验选取了19kd
‑
cas9的4、5、8、9、10号事件以及22kd
‑
cas9的6、7号事件这7个事件进行了southern blot实验分析拷贝数。
67.1.酶切体系50μl：1
‑
2μl的限制性内切酶(内切酶体积应小于酶切体系的1/10)、5μl 10
×
buffer、适量的基因组dna(10μg
‑
15μg)，加ddh2o定容至50μl。37℃水浴，酶切8h；
68.2.配制低浓度的大孔琼脂糖凝胶(无eb)，向酶切完全的体系中加入8μl染色液，在恒定低温条件下，25
‑
36v，电泳13
‑
18h；
69.3.准备转膜装置，在装置方槽中加入400ml的ddh2o和20μl的eb染料，混合均匀后将电泳好的凝胶浸泡其中，10min后拍照显影，用ddh2o冲洗2遍；
70.4.在装置的另一个方槽中加入500ml的0.2m盐酸，将凝胶轻轻放入其中，浸泡10min；
71.5.倒掉盐酸溶液，再加入500ml的变性液，浸泡15min，重复一次。变性期间剪取一张尼龙膜(11
×
12)和滤纸(12
×
12)，并将尼龙膜放在碱转液中浸泡5
‑
10min；
72.6.组装转膜装置：先在转膜台上倒少许的碱转液，铺1层滤纸，再在滤纸中间铺上尼龙膜，然后用黑皮垫子压住尼龙膜，最后在中间放置凝胶(每铺一层都要用玻璃棒赶气泡，确保形成转膜的封闭环境)；
73.7.启动真空泵进行真空抽提，加入少量碱转液，100mbar，预抽5min，然后向转膜装置中加入适量的碱转液，注意不要漫过凝胶，75min；
74.8.转膜结束后，关闭电源。用镊子将尼龙膜取出，放在适量的中和液中浸泡10min，然后将尼龙膜放置在滤纸上约25
‑
35min左右，晾干，紫外交联固定；
75.9.将尼龙膜放到杂交管中(与凝胶接触的那一面朝里)，加入10ml的预杂液，42℃的杂交炉，杂交2h。
76.10.取约250ng制备好的探针，加1
×
te溶液补足至40μl，封口膜封口，沸水浴，10min，反应结束后立刻冰浴5min，瞬离，待用。
77.11.将变性的探针加到预热的10ml杂交液中，轻轻吹打混匀。将混匀的杂交液用玻璃棒导流入杂交管中，50℃杂交炉，低转速孵育16
‑
20小时(18
‑
19小时最佳)。
78.12.杂交后加入10ml的洗膜液i(25℃度预热)，25℃杂交炉，15min，重复一遍。
79.13.加入10ml洗膜液ii(65℃预热)，65℃杂交炉，30min，重复一遍。
80.14.配制洗膜液20ml，25℃，每次10ml，5
‑
10min，共洗两次。
81.15.加10ml封闭液(用马来酸将试剂盒中10
×
blocking solution稀释至1
×
)，25℃，30
‑
40min。
82.16.加10ml抗体溶液，避光，25℃，30
‑
60min。
83.17.加20ml洗膜液，每次10ml，25℃，10min。
84.18.加10ml检测液，25℃，5
‑
10min。
85.19.将保鲜膜平铺在水平实验台上，最好不要有褶皱，把cspd显色液均匀滴在保鲜膜上，将尼龙膜的内侧一面与其接触，显影保存。
86.结果显示杂交背景低，样本的拷贝数清晰(图7)。通过统计发现，所有样本仅只有1
‑
2个拷贝，19kd
‑
cas9的4、5、8、9、10号样本分别有2、1、1、2、1个拷贝，22kd
‑
cas9的6、7号样本都各有一个样本，而且两种酶切结果一致。这种转化低拷贝数可能为我们后代筛选培育带来便利。
87.实施例五：19kd
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cas9和22kd
‑
cas9基因敲除材料醇溶蛋白的sds
‑
page检测
88.1.将籽粒去皮去胚，剩下胚乳待用。
89.2.使用液氮研磨胚乳达到粉末级。
90.3.取研磨后的籽粒胚乳粉末装入ep管中，放入冷冻干燥机中，冷冻抽干。
91.4.取50mg冷冻抽干的籽粒胚乳粉末装入ep管中，加入1ml石油醚，涡旋混匀后，摇床室温孵育1小时。
92.5. 12,000rpm，离心15分钟，弃上清。
93.6.再加入1ml石油醚，斡旋混匀后，12,000rpm，离心15分钟，弃上清。
94.7.得到的沉淀放入冷冻干燥机中，冷冻抽干。
95.8.加入1ml硼酸钠缓冲液，20μl巯基乙醇。斡旋混匀后，置于37度恒温摇床中，孵育过夜(12小时)。
96.9. 12,000rpm，离心15分钟，移取上清大约900μl至新管中，上清液则为总蛋白。
97.10.取300μl总蛋白溶液，加入700μl无水乙醇，斡旋混匀，摇床室温孵育2小时。
98.11.12,000rpm，离心15分钟，吸取全部上清至新管中，上清液则为醇溶蛋白，沉淀为非醇溶蛋白。
99.12.用70％的乙醇洗沉淀两次，12,000rpm，离心5分钟。风干至边缘透明且管中没有乙醇味后，加入200μl ipg溶液后，弹匀溶解。
100.13.上清液放入冷冻干燥机中，冷冻抽干，加入200μl ipg溶液后，弹匀溶解。
101.14.取300μl总蛋白溶液，放入冷冻干燥机中，冷冻抽干，加入200μl ipg溶液后，弹匀溶解。
102.15.各取4μl的溶解的总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白，加入1μl混有1m dtt的5
×
sds蛋白上样缓冲液，99℃变性10分钟后，立即将蛋白样品插在冰上。
103.16.sds
‑
page电泳验证，堆积胶为5％，80v电泳半小时后，分离胶为12.5％，电泳时间约为2小时。
104.17.取下蛋白胶，放入考马斯亮蓝中摇床室温染色4小时，使用脱色液脱色，至背景透明，使用bio
‑
rad电泳成像仪拍胶。
105.18.完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9％nacl或pbs稀释标准品。
106.19.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。
107.20.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。
108.21.各孔加入200μl g250染色液，室温放置3
‑
5分钟。
109.22.用酶标仪测定a595，或560
‑
610nm之间的其它波长的吸光度。
110.23.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
111.结果显示醇溶蛋白在基因编辑突变体籽粒中出现显著的下降，非醇溶蛋白略有上升(图9，10)。19kd和22kdα醇溶蛋白的含量在基因编辑突变体籽粒中出现显著的下降(图9，10)。
112.实施例六：19kd
‑
cas9和22kd
‑
cas9基因敲除材料醇溶蛋白的western blot检测
113.使用实施例三的方法分别抽提19kd
‑
cas9和22kd
‑
cas9基因敲除材料醇溶蛋白。
114.1. 7个事件分别各取4μl的蛋白，加入1μl混有1m dtt的5
×
sds蛋白上样缓冲液，
99℃变性10分钟后，立即将蛋白样品插在冰上。
115.2.sds
‑
page电泳，堆积胶为5％，80v电泳半小时后，分离胶为12.5％，电泳时间约为2小时。
116.3. 200ma转膜1h。用tbst配置5％牛奶室温封闭1h。
117.4.分别用19kd和22kd醇溶蛋白抗体和tubulin抗体(sigma)以1/1000比例稀释在5％牛奶中。室温杂交1h。
118.5.tbst洗膜6次，每次5min。
119.6.用相应二抗室温杂交1h。
120.7.tbst洗膜6次，每次5min。
121.8.加入显色底物，用tanon化学发光成像仪现象。
122.结果显示内参tubulin在七个材料中都存在，而结果发现19kd
‑
cas9的4号事件19kd醇溶蛋白完全消失，22kd醇溶蛋白也有明显下降；19kd
‑
cas9的8号与9号事件，19kd醇溶蛋白也有明显下降，22kd无显著下降；19kd
‑
cas9的10号19kd醇溶蛋白有显著的下降，22kd醇溶蛋白有些许的上升；22kd
‑
cas9的6号与7号事件的19kd醇溶蛋白无显著差异，22kd醇溶蛋白有显著下降，这同sds
‑
page的实验结果与定量结果相符(图9，11)。
123.实施例七：成熟籽粒的胚乳19kd、22kd醇溶蛋白氨基酸检测
124.为了检测我们所获得的转基因玉米是否达到了α醇溶蛋白显著降低，从而促进赖氨酸的显著升高，提高玉米的蛋白品质的目标，我们对19kd
‑
cas9的4号、10号事件以及22kd
‑
cas9的6号和7号事件进行氨基酸含量的测定。
125.1.每个事件分别取30mg成熟籽粒粉末，同时做3个生物学重复。
126.2.每个样品中加入5ml 6mol/l hcl和20ul苯酚。
127.3.氮气吹5min。
128.4. 110℃高温处理22h。
129.5.将样品漩涡后取1ml离心，4℃12000rpm 20min。
130.6.取200ul上清于试管，用氮气吹干液体，温度设置在60℃。
131.7.加入200ul 0.02mol/l hcl完全溶解样品。
132.8.取完全溶解后样品于1.5ml ep管离心，4℃12000rpm 20min。
133.9.取上清于上样柱中，上机测定。
134.结果我们可以看出四个事件的赖氨酸含量都有升高(图12)。其中，19kd
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cas9的4号事件赖氨酸含量从2217ng/mg上升到了3205ng/mg，上升了70％。其余三个事件也有一定的上升，19kd
‑
cas9的10号事件和22kd
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cas9的7号事件的赖氨酸含量分别升高到了2649ng/mg、2740ng/mg。22kd
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cas9的6号事件上升的最少，只提高到了2477ng/mg。但是，结果表明我们此次对于玉米的蛋白品质改良是成功的。