一种CHO-DHFR+细胞株及其应用的制作方法

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种cho-dhfr+细胞株及其应用。

背景技术：

中国仓鼠卵巢(cho)细胞是生产蛋白类药物的首选宿主细胞，因为与其他系统相比，cho细胞具有以下优点：①cho细胞对蛋白有准确的加工、修饰功能，因此其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白；②cho细胞耐受剪切力和渗透压的能力相对较强，可根据培养要求选择可贴壁培养或悬浮培养的方式；③整合外源基因后的细胞稳定，重组基因能高效扩增和表达；④表达的目的蛋白可由细胞内运输到细胞外，并且cho细胞只表达少量的内源蛋白，有利于目的蛋白的提取。如今，市场上一半以上最为畅销的生物制剂是由cho细胞产生的。如，阿达木单抗(humira)、贝伐单抗(avastin)和利妥昔单抗(rituxan)。可以说，cho细胞对现代生物药工业发展做出了不可磨灭的贡献。

目前cho细胞在工业上的筛选类型有：

①二氢叶酸还原酶营养缺陷突变细胞株(代表细胞cho-dg44(thermo),cho-duxb11(chasinlab))：dhfr是dihydrofolatereductase的缩写。该细胞系为dhfr基因缺陷型。dhfr用于催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。突变体不能合成四氢叶酸。因而不能在缺乏次黄嘌呤(hypoxanthine)和胸腺嘧啶(thymidine)的培养基上生长。只有导入dhfr或者培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶才能生长。因此dhfr可作为筛选标记或报告基因。

cho-dg44在1983年诞生。cho-dg44具有dhfr双缺陷，被敲除了2个位点。dg44可用于筛选，在工业使用也最广泛。氨甲喋呤(mtx)是dhfr的拮抗剂，可使dhfr大量表达，因此可使细胞外源基因的拷贝数扩增并得到较高表达。

dhfr基因扩增系统是最常用的基因扩增选择系统。但该系统也存在一些不足，如该方法需要较高浓度的mtx，而外源基因表达水平不高，增加了筛选细胞克隆的工作量等。

②谷氨酰胺合成酶(gs)扩增系统(代表细胞chok1sv-ko(lonza)，chozn(merk)，cho-s(thermo))是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效率，速度快，稳定性好，产量高等优势，同时该系统由于不需要额外谷氨酰胺的添加导致了更低的代谢废物氨的含量，更好的细胞活率，更有利于后续的工业化生产，但使用成本较高。

cn107760650a公开了一种经改造的中国仓鼠卵巢细胞(cho)及其用途，所述经改造的cho细胞能够在无血清、悬浮培养的条件下稳定且高密度生长，并且优选地不表达功能性的谷氨酰胺合成酶和岩藻糖基转移酶8。该方法敲除了cho细胞的内源性gs基因，因此，后续培养过程中需要在培养基中补加较大量的谷氨酰胺，而谷氨酰胺不稳定，4℃下放置7天即可分解约50％，而且降解产物不利于细胞生长。

技术实现要素：

基于现有技术存在的问题，本发明的第一目的在于提供一种高效表达重组蛋白的cho-dhfr+细胞株，该cho-dhfr+细胞株经过筛选获得并进行了生物材料保藏，保藏日期：2019.11.09；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；保藏单位地址：中国武汉武汉大学，邮编430072；保藏编号：cctccno：c2019264；分类命名：中国仓鼠卵巢细胞cho-dhfr+。本发明的第二目的在于提供该保藏的cho-dhfr+细胞株在表达重组蛋白中的应用。本发明的第三目的在于提供一种表达重组il-10的工程细胞株的构建方法。本发明的第四目的在于提供上述构建方法构建获得的表达重组il-10的工程细胞株。本发明的第五目的在于提供一种利用上述表达重组il-10的工程细胞株培养表达重组il-10的方法。

本发明的目的通过以下技术手段得以实现：

一方面，本发明提供一种cho-dhfr+细胞株，该细胞株的保藏编号为cctccno：c2019264。本发明的cho-dhfr+细胞株是通过脂质体将psv2-dhfr质粒转染后利用无ht的cdopticho培养基加压筛选获得，其与谷氨酰胺合成酶(gs)扩增系统细胞株具有类似的性能，该cho-dhfr+细胞株能够无血清悬浮高密度培养，培养过程中仅需在培养体系中添加少量谷氨酰胺，即可维持细胞正常生长和生产，降低了谷氨酰胺代谢产生的有毒废物nh4⁺的积累，同时能够高效表达重组蛋白(例如：重组il-10)。

另一方面，本发明还提供上述筛选保藏的cho-dhfr+细胞株在表达重组蛋白中的应用。

上述的应用中，优选地，所述重组蛋白包括重组il-10。

再一方面，本发明还提供一种表达重组il-10的工程细胞株的构建方法，其包括以下步骤：

将优化后的il-10基因连接至pcdna3.1-β质粒上，构建获得重组质粒载体；

采用脂质体2000将重组质粒载体转染进入上述筛选保藏的cho-dhfr+细胞株中，得到表达重组il-10的工程细胞株。

上述的构建方法中，优选地，所述优化后的il-10基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。

seqidno：1：

atgcactccagcgccctgctgtgctgtctggtgctgctgaccggcgtgagagcttctcctggccagggcacccagtctgagaactcctgcacacatttccccggcaacctgcctaatatgctgagggacctgcgggatgccttttcccgcgtgaagacattctttcagatgaaggaccagctggataatctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaagggctacctgggctgtcaggctctgtctgagatgatccagttttatctggaggaagtgatgccacaggccgagaaccaggaccccgatatcaaggctcacgtgaactccctgggcgagaatctgaagaccctgagactgcgcctgaggcggtgccataggttcctgccatgtgagaataagtccaaggccgtggagcaggtgaagaacgcttttaataagctgcaggagaagggcatctacaaggccatgagcgagttcgatatctttatcaactacatcgaggcttatatgacaatgaagatcaggaattga

所述优化后的il-10基因的氨基酸序列如seqidno：2所示。

seqidno：2：

mhssallcclvlltgvraspgqgtqsenscthfpgnlpnmlrdlrdafsrvktffqmkdqldnlllkeslledfkgylgcqalsemiqfyleevmpqaenqdpdikahvnslgenlktlrlrlrrchrflpcenkskaveqvknafnklqekgiykamsefdifinyieaymtmkirn

将优化后的il-10基因(seqidno：1)连接至pcdna3.1-β质粒上，构建获得重组质粒载体的核苷酸序列如下seqidno：7所示。

seqidno：7：

gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccatgcactccagcgccctgctgtgctgtctggtgctgctgaccggcgtgagagcttctcctggccagggcacccagtctgagaactcctgcacacatttccccggcaacctgcctaatatgctgagggacctgcgggatgccttttcccgcgtgaagacattctttcagatgaaggaccagctggataatctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaagggctacctgggctgtcaggctctgtctgagatgatccagttttatctggaggaagtgatgccacaggccgagaaccaggaccccgatatcaaggctcacgtgaactccctgggcgagaatctgaagaccctgagactgcgcctgaggcggtgccataggttcctgccatgtgagaataagtccaaggccgtggagcaggtgaagaacgcttttaataagctgcaggagaagggcatctacaaggccatgagcgagttcgatatctttatcaactacatcgaggcttatatgacaatgaagatcaggaattgagaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc

再一方面，本发明还提供上述构建方法构建获得的表达重组il-10的工程细胞株。

再一方面，本发明还提供一种利用上述表达重组il-10的工程细胞株培养表达重组il-10的方法，其包括以下步骤：

将上述的表达重组il-10的工程细胞株采用含有g418的cdopticho培养基培养，表达获得重组il-10。

上述的方法中，优选地，所述重组il-10的瞬转表达量大于0.96mg/l。

上述的方法中，优选地，每ml含有g418的cdopticho培养基中，所述g418的质量为200～700μg。

本发明的cho-dhfr+细胞株是通过脂质体将重组质粒转染后利用无次黄嘌呤和胸腺嘧啶的cdopticho培养基加压筛选获得，其与谷氨酰胺合成酶(gs)扩增系统细胞株具有类似的性能，该cho-dhfr+细胞株能够无血清悬浮高密度培养，培养过程中仅需在培养体系中添加少量谷氨酰胺，即可维持细胞正常生长和生产，降低了谷氨酰胺代谢产生的有毒废物nh4⁺的积累，细胞倍增水平高、细胞活力高。采用含il-10基因序列的pcdna3.1-β重组质粒载体转染该cho-dhfr+细胞株，能够获得表达重组il-10的工程细胞株，通过含有g418的cdopticho培养基培养，能够高效表达重组il-10蛋白，重组il-10蛋白的瞬转表达量大于0.96mg/l，有较好的商业应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中采用的psv2-dhfr质粒的图谱。

图2为本发明实施例2中采用本发明实施例1的cho-dhfr+细胞株与市售cho-s细胞株的细胞生长曲线对比图。

图3为本发明实施例3中pcdna3.1-β质粒的图谱。

图4为本发明实施例4中采用本发明实施例1的cho-dhfr+细胞株构建的表达重组il-10的工程细胞株与市售的cho-s细胞株构建的表达重组il-10的工程细胞株的westren-blot对比检测结果。

图5为本发明实施例5中采用本发明实施例1的cho-dhfr+细胞株与市售cho-s细胞株的代谢废物nh4⁺积累量的对比图。

用于专利程序的培养物保藏：

本发明的cho-dhfr+细胞株；

保藏日期：2019.11.09；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；

保藏单位地址：中国武汉武汉大学，邮编430072；

保藏编号：cctccno：c2019264；

分类命名：中国仓鼠卵巢细胞cho-dhfr+。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。本发明实施例中所采用的试剂原料等，若无特殊说明，均为市售获得；本发明实施例中所采用的方法，若无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例1：cho-dhfr+细胞株筛选过程

本实施例提供一种cho-dhfr+细胞株，该cho-dhfr+细胞株是通过如下方法筛选获得的：

(1)复苏cho-dg44细胞(市售获得)进行传代适应培养，待细胞生长状态恢复正常，则开始准备进行转染。

(2)转染当天，将cho-dg44细胞用optimem离心清洗后重悬至3.0×10⁶cells/ml，然后按0.8ml/孔将细胞加入6孔板中备用。

(3)混合dna(每孔)，将2.5μg的dna(psv2-dhfr质粒)加入到100μl的optimem培养基中，轻轻混匀。空白孔使用2.5μl的pbs代替dna，将混合物室温孵育30min。

所述psv2-dhfr质粒的信息如下表1所示：

表1：

所述psv2-dhfr质粒的核苷酸序列如seqidno：3所示。

所述psv2-dhfr质粒中的dhfr的核苷酸序列如seqidno：4所示。

所述psv2-dhfr质粒图谱如图1所示。

(4)混合lipofectamine2000(每孔)，将10μl的lipofectamine2000加入到100μl的optimem培养基中，轻轻混匀后室温孵育30min。

(5)混合(每孔)，将混合dna轻轻加入混合lipofectamine2000中，轻轻混匀后，室温孵育10min。

(6)转染；将孵育好的混合样品均匀加入准备好的6孔板中，并轻轻混匀，混匀完成后将细胞放入37℃，5％二氧化碳培养箱培养5～6小时。

(7)换液加压筛选：将以上转染好的细胞分别收集离心，然后按2ml/孔加入新鲜的筛选培养基cdopticho重悬，然后转入新的6孔板培养。cdopticho培养基不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶，cho-dg44细胞不能正常生长，只有转入目的基因的细胞才能在cdopticho培养基中生长。

(8)转移：换液48小时后将6孔板细胞转入对应数目的10cm细胞培养皿，补加8ml/皿新鲜的cdopticho培养基继续培养筛选。

(9)传代筛选：每隔3～4天将培养皿中的细胞收集至15ml离心管中1000rpm5min离心后弃上清，加入10ml/皿新鲜的cdopticho培养基重悬培养。传代筛选五个代次后，空白对照细胞几乎全部死亡，转染组psv2-dhfr细胞存活并转移至摇瓶继续传代培养。

(10)单克隆铺板：摇瓶传代适应5个代次后，取适量细胞悬液，按0.5cell/200μl/孔的密度铺96孔板，进行单克隆筛选。

(11)换液培养：每隔3～4天从96孔单克隆板中吸出50μl/孔上清液，补加100μl/孔新鲜的cdopticho培养基继续培养，并显微镜观察细胞生长情况。

(12)克隆转移：换液培养4代后，将96孔板中有明显细胞生长的孔转移至24孔板中扩大培养。

(13)扩大培养：24孔板中细胞长满后进一步转移至6孔板中扩大培养。6孔板细胞长满后转移至125ml摇瓶培养，初始摇瓶培养体积10ml，培养条件37℃，5％co2，125rpm培养。

(14)扩大冻存：每隔2～3天传代摇瓶细胞，待细胞适应10个代次左右，细胞生长稳定后，冻存细胞获得成功转入dhfr基因的细胞株cho-dhfr+。

经鉴定，该筛选获得的细胞株为中国仓鼠卵巢细胞cho-dhfr+，该筛选获得的cho-dhfr+细胞株已进行了生物材料保藏，保藏日期：2019.11.09；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；保藏单位地址：中国武汉武汉大学，邮编430072；保藏编号：cctccno：c2019264；分类命名：中国仓鼠卵巢细胞cho-dhfr+。

实施例2：cho-dhfr+细胞株生长性能的对比评估

将本发明实施例1构建保藏的cho-dhfr+细胞株与市售的cho-s细胞株进行细胞生长性能评估对比实验，具体如下：

(1)复苏本发明实施例1的cho-dhfr+细胞株和市售的cho-s细胞株(对照组)至新鲜的cdopticho培养基(含3mm谷氨酰胺)中进行传代适应培养，至细胞生长状态恢复正常。

(2)将恢复至正常生长状态的细胞以0.5×10⁶cells/ml密度接种至125ml的摇瓶中，每瓶30ml。

(3)接种当天记做day0，从接种后每天取50μl细胞悬液在细胞计数仪上进行细胞活率和密度的检测，依次获得day1,day2,day3....等检测数据，直至细胞活率低于70％。

(4)汇总整理所得数据，即得两株细胞的生长曲线图，实验结果如图2所示。

由图2可以看出：本发明cho-dhfr+细胞在相同条件下(均用低浓度3mm谷氨酰胺培养)，该细胞株密度略高于cho-s细胞，而细胞活率维持显著高于cho-s细胞，证明该本发明cho-dhfr+细胞株有较好的商业应用价值。

实施例3：高效表达重组il-10的工程细胞株的构建

本实施例提供一种高效表达重组il-10的工程细胞株的构建方法，其包括以下步骤：

(1)复苏本发明实施例1的cho-dhfr+细胞株至新鲜的cdopticho培养基中进行传代适应培养，至细胞生长状态恢复正常。

(2)将恢复至正常生长状态的细胞以0.5×10⁶cells/ml密度接种至125ml的摇瓶中，每瓶30ml。

(3)将优化后的il-10基因(其核苷酸序列如seqidno：1所示)连接至pcdna3.1-β质粒上，构建获得重组质粒载体(其核苷酸序列如seqidno：7所示)。

所述pcdna3.1-β质粒如下：

pcdna3.1-β质粒的复制子为pucorigin，启动子为cmvpromoter，抗性标记为amp(r)，主要酶切位点包括ecorⅰ和xbaⅰ。质粒中所插入neo(r)基因是氨基糖苷磷酸转移酶基因，该基因表达的蛋白能够使g418(长那霉素衍生物)失活，因此可以用g418对阳性目的基因受体细胞进行筛选。

所述pcdna3.1-β质粒的图谱如图3所示。

图3中，hcmvpromoter：232bp-819bp，人巨细胞病毒启动子序列。

β：967bp-1953bp，人白介素12蛋白β亚基基因序列。5’端插入位点为ecori，3’端插入位点为xbai。

bghpa：1994bp-2218bp，牛生长因子多聚腺苷酸序列。

f1origin：2264bp-2692bp，噬菌体dna复制起始位点。

sv40earlypromoter：2697bp-3066bp，猴空泡病毒40早期启动子序列。

neo(r)：3102bp-3896bp，新霉素抗性基因。

sv40pa：4070bp-4200bp，猴空泡病毒40多聚腺苷酸序列。

pucori：4583bp-5253bp，大肠杆菌dna复制起始位点。

amp(r)：5398bp-6258bp，氨苄青霉素抗性基因序列。

(4)采用脂质体2000将重组质粒载体转染进入步骤(1)的cho-dhfr+细胞株中。

(5)收获检测：将单克隆筛选获得的细胞株进行elisa和westren-blot检测重组il-10蛋白的表达量。

实施例4：cho-dhfr+细胞株生产性能的对比评估

采用实施例3构建的表达重组il-10的工程细胞株，与之进行对比的为采用市售的cho-s细胞株按照实施例3的构建方法，构建获得表达重组il-10的工程细胞株。elisa对比检测结果如表2所示，westren-blot对比检测结果如图4所示。

表2：

由表2的elisa实验结果可以看出：本发明的cho-dhfr+细胞株构建的表达重组il-10的工程细胞株的重组il-10蛋白的瞬转表达量为0.9652214mg/l(965221.4pg/ml)，而采用市售的cho-s细胞株构建的表达重组il-10的工程细胞株的重组il-10蛋白的瞬转表达量为0.32mg/l；其与图4的westren-blot实验结果具有较好的一致性，本发明cho-dhfr+细胞株的生产性能要优于市售的cho-s细胞株。另外通过与外购阳性品对照，结果表明本发明表达重组il-10的工程细胞株能够表达重组il-10蛋白，且表达蛋白的分子量与阳性品一致。

实施例5：cho-dhfr+细胞株代谢性能的对比评估

将本发明实施例1构建保藏的cho-dhfr+细胞株与市售的cho-s细胞株进行细胞代谢性能评估对比实验，具体如下：

(1)复苏本发明实施例1的cho-dhfr+细胞株和市售的cho-s细胞株(对照组)至新鲜的cdopticho培养基(含3mm谷氨酰胺)中进行传代适应培养，至细胞生长状态恢复正常。

(2)将恢复至正常生长状态的细胞以0.5×10⁶cells/ml密度接种至125ml的摇瓶中，每瓶30ml。

(3)接种当天记做day0，从接种后每天取1ml细胞悬液在1000rpm离心5min后收集上清，在生化分析仪上进行nh4⁺的检测，依次获得day1，day2，day3....等检测数据，直至细胞活率低于60％。

(4)汇总整理所得数据，即得两株细胞的nh4⁺积累曲线图，实验结果如图5所示。

由图5以看出：本发明同样浓度3mm谷氨酰胺供应条件下，cho-dhfr+细胞株的代谢废物nh4⁺积累量显著低于cho-s细胞，这有利于后期工业化生产细胞活率维持和蛋白表达。

综上所述，本发明的cho-dhfr+细胞株生长性能，生产性能，代谢性能等均优于市售同类型的对照细胞，本发明的该cho-dhfr+细胞株具有较好的商业化应用前景。

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<110>康立泰药业有限公司

<120>一种cho-dhfr+细胞株及其应用

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<220>

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