一种从鲜桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法与流程

[0001]
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种从鲜桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法。


背景技术：

[0002]
桑叶，别名铁扇子，是桑科植物桑(morus alba l.)的干燥叶，是一种传统中药。中医认为，桑叶性寒、味甘，具有疏散风热、清肝明目、凉血止血、清肺润燥等功效。桑叶是卫生部批准的药食两用品，在我国资源丰富，极具开发潜力。
[0003]
研究发现桑叶中含有一种特殊的降血糖的物质，即1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,dnj)。dnj可竞争性抑制小肠粘膜
ɑ-糖苷酶的活性，减缓葡萄糖的吸收速率，降低餐后血糖浓度，从而发挥治疗糖尿病的作用。
[0004]
dnj在抑制
ɑ-葡萄糖苷酶的同时，不会抑制
ɑ-淀粉酶，从而避免了未吸收的碳水化合物以低聚糖的形式进入大肠，不会引起排气、腹胀、腹泻等较强的肠道副作用。
[0005]
中国发明专利cn105503700a公开了一种桑叶中1-脱氧野尻霉素的制备方法。该方法是通过粉碎、微波提取、离心分离、水提醇沉、浓缩干燥、膜分离、干燥等步骤实现，但获得的桑叶提取物dnj的含量仅为6.5～7.8％。中国发明专利cn109180563a公开了一种从鲜桑叶中提取dnj的方法，虽然通过该方法获得了高含量的dnj提取物，但该工艺需要对桑叶进行研磨、破壁处理，破壁后的浆液还要加入蛋白酶进行酶解，难以大规模生产且生产成本高。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供了一种提取工艺简单、提取率高、适合大规模生产的从鲜桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法。
[0007]
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种从鲜桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法，包括以下步骤：
[0008]
s1：将新鲜采摘的桑叶清洗、沥干，切成条状；
[0009]
s2：将切条后的桑叶加入醋酸提取液，超声波辅助提取一次，再用同体积的纯净水，超声波辅助提取两次；
[0010]
s3：合并提取液，过滤机过滤，真空浓缩；
[0011]
s4：将浓缩物用纯净水稀释至比重1.15～1.25，0～4℃静置50～80h；
[0012]
s5：取上清液，膜过滤后通过阳离子交换树脂，然后以水洗至无色后，再用碱性水溶液洗脱至无色，收集碱性洗脱液；
[0013]
s6：将洗脱液浓缩干燥即得到1-脱氧野尻霉素的含量不低于20％的桑叶提取物。
[0014]
优选地，步骤s1中，将桑叶切成直径3～8mm的条状，采用3～8mm的条状的桑叶进行提取，提取率较高且可有效减小后续处理的难度。
[0015]
优选地，步骤s2中，所述醋酸提取液，是指温度50～70℃、含醋酸浓度为5～20％的
水溶液；50～70℃此时醋酸的解离度最大，可以有效提高溶液的ph值。
[0016]
优选地，步骤s2中，所述超声波辅助提取，其提取条件为，超声波频率20khz～1mhz，声强0.3～3w/cm2，液料比(v/w)为6～8∶1，每次的提取时间为15～30min。
[0017]
优选地，步骤s3中，真空浓缩至膏状或没有酸味。
[0018]
优选地，步骤s3中，所述过滤机，是指硅藻土过滤机或板框式压滤机中的一种，确保过滤效果好且操作方便。
[0019]
优选地，步骤s5中，所述膜过滤的过滤孔径为5～60μm，可以有效地去除大分子物质，保留有效目的成分。
[0020]
本发明从鲜桑叶中提取1-脱氧野尻霉素的方法具有以下的有益效果：
[0021]
1、本发明采用醋酸溶液，在较高温度下提取，不会破坏成分，同时采用了低频超声波辅助提取，提高了溶剂溶出效率，进而提高了产品的得率。同时醋酸腐蚀性低，而且属于挥发性酸，可在真空浓缩过程中回收再利用。
[0022]
2、通过本发明方法得到的桑叶提取物中含有不低于20％的1-脱氧野尻霉素。
[0023]
3、本发明采用50～70℃提取温度，不仅此温度下醋酸的解离度最大，可以有效提高溶液的ph值，而且dnj容易从桑叶中被分离出来，杂质含量低，提取效果好。
[0024]
4、本发明将新鲜采摘的桑叶切成3～8mm细条状后再进行提取，不仅dnj提取率较高且可有效减小后续处理的难度，还能节约成本。
[0025]
5、本发明整体的提取工艺简单、高效且环保，适合工业化生产。
具体实施方式
[0026]
下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]
实施例1
[0028]
取10kg鲜桑叶，清洗、沥干，切成直径3mm的条状；将切条后的桑叶加入60l温度为70℃、含5％醋酸的提取液，以超声波(频率40khz、声强0.6w/cm2，)辅助提取30min；再用60l的纯净水，以相同超声波辅助提取两次，每次20min；合并提取液，硅藻土过滤机过滤，真空浓缩；将浓缩物用纯净水稀释至比重1.15，0～4℃静置72h；取上清液，8μm滤膜过滤后通过阳离子交换树脂，然后以水洗至无色后，再用碱性水溶液洗脱至无色，收集碱性洗脱液；将洗脱液浓缩干燥即得到提取物1。
[0029]
实施例2
[0030]
取10kg鲜桑叶，清洗、沥干，切成直径4mm的条状；将切条后的桑叶加入70l温度为60℃、含10％醋酸的提取液，以超声波(频率100khz、声强1w/cm2，)辅助提取30min；再用70l的纯净水，以相同超声波辅助提取两次，每次20min；合并提取液，硅藻土过滤机过滤，真空浓缩；将浓缩物用纯净水稀释至比重1.19，0～4℃静置72h；取上清液，20μm滤膜过滤后通过阳离子交换树脂，然后以水洗至无色后，再用碱性水溶液洗脱至无色，收集碱性洗脱液；将洗脱液浓缩干燥即得到提取物2。
[0031]
实施例3
[0032]
取10kg鲜桑叶，清洗、沥干，切成直径6mm的条状；将切条后的桑叶加入80l温度为50℃、含20％醋酸的提取液，以超声波(频率200khz、声强2w/cm2，)辅助提取30min；再用80l的纯净水，以相同超声波辅助提取两次，每次20min；合并提取液，板框式过滤机过滤，真空浓缩；将浓缩物用纯净水稀释至比重1.22，0～4℃静置72h；取上清液，60μm滤膜过滤后通过阳离子交换树脂，然后以水洗至无色后，再用碱性水溶液洗脱至无色，收集碱性洗脱液；将洗脱液浓缩干燥即得到提取物3。
[0033]
一、分别取提取物1、提取物2和提取物3，按照以下方法进行dnj含量的hplc测定：
[0034]
柱前衍生化：精密量取样品溶液10μl，加入硼酸盐缓冲液(ph 8.5)10μl混合，再加入浓度为5mmol/l的fmoc-cl(芴甲氧酰氯)的乙腈溶液20μl，迅速混匀，30℃水浴反应30min，用0.22μm一次性灭菌过滤器过滤，滤液用高效液相色谱法分析。色谱条件:hplc条件：c18柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％醋酸(35∶65，v/v)；流速：1.00ml/min；柱温:30℃；检测波长：254nm；进样量：10μl。重复测定3次，取平均值。测定结果如下表1所示，从表1中得出，通过本发明方法得到的桑叶提取物中含有不低于20％的1-脱氧野尻霉素。
[0035]
表1
[0036][0037]
二、提取温度对dnj提取率的影响：
[0038]
分别精密称取鲜桑叶细条0.5g于50ml离心管中，加入等量的醋酸水溶液，在30、50、70、90℃温度下超声提取30min，于5000r/min高速离心机中离心25min，收集上清液。
[0039]
dnj含量的hplc测定：
[0040]
柱前衍生化：精密量取样品溶液10μl，加入硼酸盐缓冲液(ph 8.5)10μl混合，再加入浓度为5mmol/l的fmoc-cl(芴甲氧酰氯)的乙腈溶液20μl，迅速混匀，30℃水浴反应30min，用0.22μm一次性灭菌过滤器过滤，滤液用高效液相色谱法分析。色谱条件:hplc条件：c18柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％醋酸(35∶65，v/v)；流速：1.00ml/min；柱温:30℃；检测波长：254nm；进样量：10μl。重复测定3次，取平均值，测定结果如表2所示。
[0041]
表2
[0042][0043]
从表2实验结果看，温度对dnj的提取有一定影响，随着提取温度的升高，dnj的提取率也随之升高，但50℃～90℃间dnj的提取率增幅并不明显。一般来说，提取温度越高，提取效率越高，因温度升高，分子运动速度加快，渗透、溶解、扩散速度加快，所以提取效果好。提取温度越高dnj越容易从桑叶中被分离出来。但温度不宜过高，过高杂质含量会增多，给以后分离精制带来困难。因此，从节约能耗方面考虑，最终确定提取温度为50～70℃。
[0044]
三、液料比对dnj提取率的影响：
[0045]
分别精密称取鲜桑叶细条0.5g于50ml离心管中，加入4、6、8、10、12倍量的醋酸水溶液，在50℃下超声提取30min，于5000r/min高速离心机中离心25min，收集上清液。
[0046]
dnj含量的hplc测定：
[0047]
柱前衍生化：精密量取样品溶液10μl，加入硼酸盐缓冲液(ph 8.5)10μl混合，再加入浓度为5mmol/l的fmoc-cl(芴甲氧酰氯)的乙腈溶液20μl，迅速混匀，30℃水浴反应30min，用0.22μm一次性灭菌过滤器过滤，滤液用高效液相色谱法分析。色谱条件:hplc条件：c18柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％醋酸(35∶65，v/v)；流速：1.00ml/min；柱温:30℃；检测波长：254nm；进样量：10μl。重复测定3次，取平均值，测定结果如下表3所示。
[0048]
表3
[0049][0050]
从表3实验结果看，随着液料比的逐渐增大，dnj的提取率也逐渐增加。当液料比达到8时，提取率达到最大，随后，dnj的提取率不增反降(主要原因是溶剂体积增大时，可以使细胞内有效成分从细胞内充分溶解出来，但是当液料比增加到8以后，dnj的提取率不增反降，说明此时细胞内外已经达到溶解平衡。但当溶剂使用量过大时，杂质溶解的也越多，为了节省成本，减少后续的工作量，选液料比6～8:1ml/g，为提取的最佳料液比。
[0051]
四、形状对dnj提取率的影响：
[0052]
精密称取鲜桑叶各0.5g打浆、切成3～8mm的细条、片状分别置于50ml离心管中，加入8倍量的醋酸水溶液，在50℃下超声提取30min，于5000r/min高速离心机中离心25min，收集上清液。
[0053]
dnj含量的hplc测定：
[0054]
柱前衍生化：精密量取样品溶液10μl，加入硼酸盐缓冲液(ph 8.5)10μl混合，再加入浓度为5mmol/l的fmoc-cl(芴甲氧酰氯)的乙腈溶液20μl，迅速混匀，30℃水浴反应30min，用0.22μm一次性灭菌过滤器过滤，滤液用高效液相色谱法分析。色谱条件:hplc条件：c18柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％醋酸(35∶65，v/v)；流速：1.00ml/min；柱温:30℃；检测波长：254nm；进样量：10μl。重复测定3次，取平均值，测定结果如下表4所示。
[0055]
表4
[0056] 打浆细条片状dnj含量(mg/g)3.683.252.32
[0057]
从表4实验结果看，打浆的dnj提取率最高，3～8mm的细条提取率次之，片状的桑叶提取率最低。打浆dnj提取率虽高但颗粒过细不利于后续的过滤，增大了后续的工作量，给以后分离精制带来困难。综合考虑，切成3～8mm细条状，dnj提取率较高且可有效减小后续处理的难度，从节约效能考虑，最终确定切成3～8mm条状。
[0058]
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。