一种人液体样本全核酸抽提试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人液体样本全核酸抽提试剂盒及其应用。

背景技术：

随着高通量测序技术的飞速发展，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。许多研究与临床应用需要dna和rna共检测，迫切需要核酸共提取，可以提高疾病的检出率及出报告的时间。目前市面上有组织和细胞的全核酸抽提试剂盒，没有液体样本的全核酸抽提试剂盒。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种人液体样本全核酸抽提试剂盒及其应用，以填补现有技术的空白。

本发明提供一种人液体样本全核酸抽提试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：含有gttc和guhcl的裂解液、含有gttc和guhcl的漂洗液以及其他漂洗液、硅基纳米磁珠和洗脱液。

所述含有gttc和guhcl的裂解液的组成为：4-10mmgitc，2-10mmguhcl，50-200mmnacl，1-4mmedta，10-100mmtris-hcl，1-5％sds，5-15％tween-20，1-2mmdtt。

所述含有gttc和guhcl的漂洗液的组成为：1-4mmgitc，1-4mmguhcl，10-20mmtris-hcl，70％异丙醇。

所述其他漂洗液的组成为：1-20mmtris-hcl，70％乙醇。

所述硅基纳米磁珠浓度为40-60mg/ml。

所述洗脱液的组成为rnase-freeddh2o。

本发明还提供一种人液体样本全核酸抽提试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

首先向样本中加入含有gttc和guhcl的裂解液和硅基纳米磁珠，涡旋震荡混匀后室温震荡，静置后加入含有gttc和guhcl的漂洗液，涡旋震荡混匀，离心后静置，然后加入其他漂洗液涡旋震荡混匀，离心后静置，再加入洗脱液，涡旋后静置进行检测。

所述样本与含有gttc和guhcl的裂解液的体积比为1:1.5-2.5。

所述样本与硅基纳米磁珠的体积比为1:0.03-0.05。

所述样本与含有gttc和guhcl的漂洗液的体积比为1:1.5-2.5。

所述样本与其他漂洗液的体积比为1:1.5-2.5。

所述样本与洗脱液的体积比为1:0.07-0.09。

本发明还提供一种人液体样本全核酸抽提试剂盒在液体人体样本检测中的应用。

所述液体人体样本包括血液、尿液、肺泡灌洗液、脑脊液和其他体液等样本。

有益效果

(1)本发明可以一次操作，同时获得样本中的dna和rna。

(2)本发明采用磁珠法纯化核酸，易于自动化。

(3)本发明适用于液体人体样本，包括血液、尿液、肺泡灌洗液、脑脊液和其他体液等样本。

附图说明

图1为本发明实施例2中共抽提全核酸组和仅抽提dna样本试剂盒组的dna检测结果。

图2为本发明实施例2中共抽提全核酸组和仅抽提rna样本试剂盒组的rna检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例中所用全核酸抽提试剂盒的组成如下：

裂解液：5mmgitc，2mmguhcl，50mmnacl，1mmedta，50mmtris-hcl，1％sds，5％tween-20，1mmdtt。漂洗液1：1mmgitc，1mmguhcl，10mmtris-hcl，70％异丙醇。漂洗液2为：1mmtris-hcl，70％乙醇。硅基纳米磁珠，50mg/ml。洗脱液：rnase-freeddh2o。

实施例1

针对正常人血液样本，使用本发明的全核酸抽提试剂盒及对比试剂盒抽提核酸进行比对实验。

1.样本准备：

取6例正常人全血样本，每例2ml，每个样本分成三组，组1为使用本发明试剂盒抽提全核酸，组2为使用市面上仅抽提dna样本试剂盒(如，天根生化，中量血液基因组dna提取试剂盒，dp332)抽提dna，组3为使用市面上仅抽提rna样本试剂盒(如，天根生化，血液总rna提取试剂盒，dp433)抽提rna。

2.核酸提取

2.1本发明的全核酸抽提试剂盒核酸抽提方法

a、1ml样本中加入2ml裂解液和40μl硅基纳米磁珠，涡旋震荡混匀，置于混匀仪上，室温振荡6min。在振荡期间，每隔2分钟颠倒混匀5sec。

b、将上述样本管置于磁力架上，静置1min。静置结束后，小心移除上清，液面的泡沫也一并移除。

c、将上述样本管取下磁力架并加入2ml漂洗液1，涡旋震荡混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置1min；静置结束后，小心移除上清，液面的泡沫也一并移除。

d、将上述样本管取下磁力架并加入2ml漂洗液2，涡旋震荡混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置1min；静置结束后，小心移除上清，液面的泡沫也一并移除。

e、将上述样本管置于磁力架上，开盖静置5min。磁珠干燥后将样本管取下磁力架，加入80ul洗脱液，涡旋打散磁珠。室温静置5min，期间每隔2分钟涡旋打散一次。

f、将上述样本管置于磁力架上，静置5min，将上清转移至新的nuclease-free离心管中。

2.2使用市面上仅抽提dna样本试剂盒抽提dna方法，操作步骤如下，详情可参阅试剂盒说明书。

a、向15ml离心管加入200μlproteinasek(20mg/ml)溶液，直接加入1ml血液样本，混匀。

b、加入3.6ml缓冲液ge，振荡30sec混匀；加入40μlrnasea(100mg/ml)溶液，振荡15sec，室温放置5min。

c、65℃放置10min，每隔3min振荡一次，以助裂解。简短离心以收集管盖内壁的水珠。

d、向样本中加入3ml无水乙醇，混匀，所得混合液一半转移至一个吸附柱中，1,850g离心3min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；重复步骤一次。

e、向吸附柱中加入2ml缓冲液gd，4,500g离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

f、向吸附柱中加入2ml缓冲液pw，4,500g离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

g、向吸附柱中加入2ml缓冲液pw，4,500g离心15min，丢弃收集管，将吸附柱放到一个新的15ml离心管中。

h、向吸附膜的中间部位悬空滴加300μl洗脱缓冲液，室温放置5min，4,500×g离心2min，将溶液收集到离心管中。

2.3使用市面上仅抽提rna样本试剂盒抽提rna方法，操作步骤如下，详情可参阅试剂盒说明书。

a、向200μl人类全血中加1ml1×红细胞裂解液,冰上孵育10min，期间涡旋振荡混匀2次；4℃400g离心10min，去上清。

b、向沉淀中加400μl1×红细胞裂解液，用移液枪反复吹打重悬沉淀；4℃400g离心10min，去上清；向沉淀中加入裂解液。

c、将溶液转移至过滤柱中，400g离心2min，收集滤液。

d、向滤液中加入1倍体积70％乙醇，混匀转入吸附柱中，13,400g离心30sec，弃废液；向吸附柱中加入350μl去蛋白液，13,400g离心30sec，弃废液；将吸附柱放回收集管中。

e、向吸附柱中央加入80μldnasei工作液，加入350μl去蛋白液，13,400g离心30sec弃废液，将吸附柱放回收集管中。

f、向吸附柱中加入500μl漂洗液，室温放置2min，13,400g离心30sec弃废液，将吸附柱放回收集管中；重复操作步骤一次。

g、将吸附柱放入新的2ml收集管中，13,400g离心2min，去除残余液体；将吸附柱cr2置于超净工作台上通风片刻，充分晾干。

h、将吸附柱转入核酸酶free离心管中，加50μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，4℃13,400g离心2min。

3.检测

用qubit检测获得的核酸的质量，结果如表1所示，可以看出本发明共抽提dna和rna的浓度与市面上单独抽提dna/rna的浓度相当。

表1

实施例2

针对正常人尿液样本，使用本发明的全核酸抽提试剂盒及对比试剂盒抽提核酸进行比对实验。

4.样本准备：

取6例正常人尿液样本，每例2ml，每个样本分成三组，组1为使用本发明试剂盒抽提全核酸，组2为使用市面上仅抽提dna样本试剂盒(如，天根生化，中量血液基因组dna提取试剂盒，dp332)抽提dna，组3为使用市面上仅抽提rna样本试剂盒(如，天根生化，血液总rna提取试剂盒，dp433)抽提rna。

5.核酸提取

5.1本发明的全核酸抽提试剂盒核酸抽提方法

a、1ml样本中加入2ml裂解液和40μl硅基纳米磁珠，涡旋震荡混匀，置于混匀仪上，室温振荡6min。在振荡期间，每隔2分钟颠倒混匀5sec。

b、将上述样本管置于磁力架上，静置1min。静置结束后，小心移除上清，液面的泡沫也一并移除。

c、将上述样本管取下磁力架并加入2ml漂洗液1，涡旋震荡混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置1min；静置结束后，小心移除上清，液面的泡沫也一并移除。

d、将上述样本管取下磁力架并加入2ml漂洗液2，涡旋震荡混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置1min；静置结束后，小心移除上清，液面的泡沫也一并移除。

e、将上述样本管置于磁力架上，开盖静置5min。磁珠干燥后将样本管取下磁力架，加入80ul洗脱液，涡旋打散磁珠。室温静置5min，期间每隔2分钟涡旋打散一次。

f、将上述样本管置于磁力架上，静置5min，将上清转移至新的nuclease-free离心管中。

5.2使用市面上仅抽提dna样本试剂盒抽提dna方法，操作步骤如下，详情可参阅试剂盒说明书。

a、取2ml尿液至离心管中，16000g，10min离心，弃上清。

b、加入3.6ml缓冲液ge，振荡30sec混匀；加入200μlproteinasek(20mg/ml)溶液，混匀；加入40μlrnasea(100mg/ml)溶液，振荡15sec，室温放置5min。

c、65℃放置10min，每隔3min振荡一次，以助裂解。简短离心以收集管盖内壁的水珠。

d、向样本中加入3ml无水乙醇，混匀，所得混合液一半转移至一个吸附柱中，1,850g离心3min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；重复步骤一次。

e、向吸附柱中加入2ml缓冲液gd，4,500g离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

f、向吸附柱中加入2ml缓冲液pw，4,500g离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

g、向吸附柱中加入2ml缓冲液pw，4,500g离心15min，丢弃收集管，将吸附柱放到一个新的15ml离心管中。

h、向吸附膜的中间部位悬空滴加300μl洗脱缓冲液，室温放置5min，4,500×g离心2min，将溶液收集到离心管中。

5.3使用市面上仅抽提rna样本试剂盒抽提rna方法，操作步骤如下，详情可参阅试剂盒说明书。

a、取2ml尿液至离心管中，16000g，10min离心，弃上清。

b、向沉淀中加入裂解液。

c、将溶液转移至过滤柱中，400g离心2min，收集滤液。

d、向滤液中加入1倍体积70％乙醇，混匀转入吸附柱中，13,400g离心30sec，弃废液；向吸附柱中加入350μl去蛋白液，13,400g离心30sec，弃废液；将吸附柱放回收集管中。

e、向吸附柱中央加入80μldnasei工作液，加入350μl去蛋白液，13,400g离心30sec弃废液，将吸附柱放回收集管中。

f、向吸附柱中加入500μl漂洗液，室温放置2min，13,400g离心30sec弃废液，将吸附柱放回收集管中；重复操作步骤一次。

g、将吸附柱放入新的2ml收集管中，13,400g离心2min，去除残余液体；将吸附柱cr2置于超净工作台上通风片刻，充分晾干。

h、将吸附柱转入核酸酶free离心管中，加50μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，4℃13,400g离心2min。

6.检测

因尿液中dna和rna的含量相对较少，用定量pcr的方法进行核酸质量的评估。

dna检测：对获得的全核酸进行荧光定量pcr验证，检测内参基因β-actin基因，结果如图1所示，通过检测ct值的大小反应所加入核酸样本的浓度，ct值的大小与核酸样本的浓度成反比。结果显示本发明共抽提全核酸组的平均ct值与单独仅抽提dna样本试剂盒组的平均ct值相近，本发明共抽提的dna与市面上单独抽提dna的浓度相当。

rna检测：对获得的全核酸进行荧光定量pcr验证，检测mirnamir-21，先经过反转录，后进行荧光定量pcr检测，结果如图2所示，通过检测ct值的大小反应所加入核酸样本的浓度，ct值的大小与核酸样本的浓度成反比。结果显示本发明共抽提全核酸组的平均ct值与单独仅抽提rna样本试剂盒组的平均ct值相近，本发明共抽提的rna与市面上单独抽提rna的浓度相当。