一种红鳍东方鲀生长性状相关的SNP位点及其在遗传育种中的应用的制作方法

一种红鳍东方鲀生长性状相关的snp位点及其在遗传育种中的应用
技术领域
[0001]
本发明属于鱼类遗传选育技术领域，具体涉及一种红鳍东方鲀生长性状相关的snp位点及其在遗传育种中的应用。


背景技术：

[0002]
红鳍东方鲀(takifugu rubripes)属鲀形目(telraodontiformes)，东方鲀属(fugu)，以日本沿海为主要分布中心，在我国沿海野生群体较少且存在种质不纯；且其野生群体因受海洋污染等因素在缩减，故此其每年的捕捞量在逐渐减少。红鳍东方鲀肉质鲜嫩，营养丰富，素有“鱼类之王”的美称。虽然野生红鳍东方鲀其肝脏及卵巢等组织富含河鲀鱼毒素是很强烈的神经毒，但是其毒素制剂可以用于镇痛剂、麻醉剂等且价格昂贵。因此，此种鱼类具有较高的经济价值。目前红鳍东方鲀自然资源量下降严重，养殖规模虽然逐渐增大，而且在人工养殖过程中存在过种质退化现象。因此，选育出有优良生长性状的红鳍东方鲀品种是非常有必要。
[0003]
现阶段普遍使用形态性状选择育种方法进行繁育工作，但实际上生长性状的遗传力在0.2左右，性状选择在子代中的效果并不理想，而分子标记辅助选择育种将大概率使优良性状完全遗传到子代并表达。但目前分子标记辅助选择育种最大的问题是缺乏有效的分子标记。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供一种红鳍东方鲀生长性状相关的snp位点及其在遗传育种中的应用，所提供的snp位点与红鳍东方鲀体重、体长、体全长生长性状相关，可用于选育具有快速生长性状的红鳍东方鲀稚鱼和选配亲本，从而弥补现有技术的不足。
[0005]
本发明首先提供与红鳍东方鲀生长性状相关的snp位点，所述的snp位点位于序列为seq id no：1的核苷酸片段的第482位，其碱基为c或t；
[0006]
本发明还提供与红鳍东方鲀生长性状相关的双倍型，为位于序列为seq id no：1的核苷酸片段的第264位，其碱基为c或t；第303位，其碱基为a或g、第550位，其碱基为c或t，所述的双倍型为纯合的c(c)a(a)c(c)和杂合c(t)a(g)c(t)。
[0007]
本发明提供的snp位点和双倍型用于选育具有快速生长潜力的红鳍东方鲀稚鱼个体和选配亲本。
[0008]
本发明另一个方面提供筛选具有快速生长潜力的红鳍东方鲀稚鱼个体和亲本选配的方法，是通过检测上述的snp位点及双倍型来实现的；
[0009]
所述的方法，是通过pcr产物测序分析检测红鳍东方鲀个体，pcr产物进行测序分析后确定待检测的个体各个snp位点的基因型是否具有快速生长潜力；
[0010]
所述的pcr扩增方法，其中所使用的引物的序列信息如下：
[0011]
f:5
’-
gacattgaggaaaccaccag-3’(seq id no：2)，
[0012]
r:5
’-
gcccacttacaccatctacc-3’(seq id no:3)；
[0013]
所述的pcr产物测序分析，是确定snp位点的基因型分型，其中基因型为tt纯合型个体的体重、体长、体全长显著高于cc、ct基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)；双倍型纯合cac个体体重显著高于杂合cac个体(p<0.05)。
[0014]
本发明通过分析位点基因型与红鳍东方鲀生长性状的相关性，发现红鳍东方鲀核苷酸序列seq id no：1的第482bp处碱基存在与生长性状相关的snp位点，基因型为tt纯合型个体的体重、体长显著高于tc、cc基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)，双倍型的三个位点分别264位、303位、550位，其碱基分别为c或t、a或g、c或t，形成的双倍型为纯合的c(c)a(a)c(c)和杂合c(t)a(g)c(t)，双倍型纯合cac个体体重显著高于杂合cac个体(p<0.05)。并通过pcr产物测序法可快速鉴定对应性状。因此，生产中可优先选择该位点基因型为tt型个体和双倍型纯合cac个体作为亲本进行规模养殖。
附图说明
[0015]
图1：本发明snp标记位点处tt、tc、cc三种基因型的测序峰图；
[0016]
图2：本发明双倍型纯合cac的各位点测序峰图；
[0017]
图3：本发明双倍型杂合cac的各位点测序峰图。
具体实施方式
[0018]
在snp分析中，利用pcr技术定点扩增基因组dna中某一目的片段，将扩增产物进行送去测序，根据测序结果比对后判断目的片段中是否存在突变。结果判定是通过多个样品之间峰图对比，观察峰图之间snp位点碱基差别和双峰的有无，从而显示出不同生物个体的dna特异性。
[0019]
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)是指基因组dna上由单个核苷酸突变所引起的dna序列多态性，通过确定snp及基因型分型进行选种，是成熟的分子生物技术，snps分子标记在禽畜及水产经济动物研究中已得到了广泛地应用，包括qtl定位、分子标记辅助选择等方面。作为新一代的遗传标记技术，snps将在水产经济动物遗传育种研究领域发挥巨大的作用。
[0020]
本发明通过对红鳍东方鲀生长激素受体2基因(growth hormone receptor 2gene)设计1对引物对红鳍东方鲀鱼苗个体和亲本进行pcr产物测序结果snp基因分型分析。
[0021]
通过seqman比对，筛查出一个snp位点位于红鳍东方鲀生长激素受体2基因(核苷酸序列seq id no：1)的片段的第482碱基处。再对488尾红鳍东方鲀稚鱼个体分析点突变基因型频率与红鳍东方鲀生长性状的相关性，发现基因型为tt纯合型个体的体重、体长显著高于tc、cc基因型个体对应生长性状的表型值(p<0.05)；
[0022]
在红鳍东方鲀稚鱼中发现三个snp位点分别位于该基因的第264位、303位、550位，其各位点碱基分别为c或t、a或g、c或t，形成的双倍型为纯合的c(c)a(a)c(c)和杂合c(t)a(g)c(t)。两种双倍型：在100尾全同胞稚鱼中纯合的c(c)a(a)c(c)和杂合c(t)a(g)c(t)，纯合型个体体重显著高于杂合型个体(p<0.05)。
[0023]
因此，生产中可优先选择该位点基因型为tt型个体或双倍型纯合cac个体作为亲
本或者进行规模养殖。
[0024]
下面通过实施例和附图对本发明做进一步说明。
[0025]
实施例1筛选snp位点
[0026]
本发明的snp位点的筛选步骤如下：
[0027]
a)红鳍东方鲀基因组的提取：海洋动物dna提取试剂盒从红鳍东方鲀尾鳍和肌肉中提取基因组dna。取3mg样本组织按照试剂盒说明书提取后保存在1.5ml离心管中，-20℃保存；琼脂糖凝胶电泳检测dna。
[0028]
b)引物设计及筛选：根据红鳍东方鲀ghr2基因的序列，利用引物设计软件primer 5.0在其dna序列上设计多对引物，对若干红鳍东方鲀稚鱼个体进行pcr产物测序法分析碱基差别，筛选出存在snp位点的引物，其引物序列信息如下：
[0029]
f:5
’-
gacattgaggaaaccaccag-3’(seq id no：2)，
[0030]
r:5
’-
gcccacttacaccatctacc-3’(seq id no:3)；
[0031]
c)目的基因pcr扩增：反应体系为25μl：10
×
buffer 2.5μl，dntp 2μl，f引物(seq id no.2)1μl，r引物(seq id no.3)1μl，基因组dna 1μl，taq酶0.3μl，双蒸水补足至25μl。pcr程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62.5℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸7min。得到的pcr扩增产物在1％琼脂糖凝胶下电泳检测浓度。
[0032]
d)目的片段测序：pcr产物送华大基因工程有限公司进行单分子荧光标记测序，获得的目的片段的序列如下：
[0033][0034]
实施例2：pcr产物测序法证明snp位点与生长性状的相关性
[0035]
为确定序列为seq id no：1的红鳍东方鲀片段与生长性状关联的snp位点，进行pcr产物测序分析碱基差别并进行基因分型，包括如下步骤：
[0036]
a)红鳍东方鲀样品的获取：所采用的实验样品鱼全部采自大连天正实业有限公司，于相同的养殖管理和营养条件下长成随机选出2月龄的红鳍东方鲀稚鱼个体488尾。
[0037]
b)数据的采集与基因组dna的提取：对488尾个体的体重和体长的表型值进行测量和记录，同时采取尾鳍肌肉组织用于基因组dna的提取。
[0038]
c)pcr反应及测序。反应体系为25μl：10
×
buffer 2.5μl，dntp 2μl，f引物(seq id no：2)1μl，r引物(seq id no：3)1μl，基因组dna 1μl，taq酶0.3μl，双蒸水补足至25μl。pcr程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62.5℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸7min。得到的pcr扩增产物在1％琼脂糖凝胶下电泳检测，目的片段条带清晰即可送出测序。
[0039]
snp基因型与生长性状表型值关联分析：
[0040]
(1)利用spss22.0软件对seq id no：1的红鳍东方鲀片段上的482位的snp位点的三种基因型与488尾红鳍东方鲀稚鱼体重、体长、体全长的性状表型值分别进行单因素方差分析，计算该snp位点各基因型的生长性状的差异显著性，结果见表1。
[0041]
表1：红鳍东方鲀核苷酸seq id no：1序列的snp各基因型的生长性状(均值
±
标准差)
[0042][0043]
注：同列中字母相同为差异不显著，相邻字母为差异显著(p<0.05)
[0044]
由表1可知，基因型为tt纯合型个体的体重、体长、体全长显著高于tc、cc基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。
[0045]
通过检测本发明的snp位点所筛选的红鳍东方鲀tt基因型个体，其生长速度显著高于tc、cc型个体。
[0046]
(2)利用spss22.0软件对seq id no：1的红鳍东方鲀片段上双倍型与100尾全同胞红鳍东方鲀稚鱼体重、体长、体全长的性状表型值分别进行单因素方差分析，计算该snp位点各基因型的生长性状的差异显著性，结果见表2。
[0047]
表2：红鳍东方鲀核苷酸seq id no：1序列的两种双倍型的生长性状(均值
±
标准差)
[0048][0049]
注：同列中字母相同为差异不显著，相邻字母为差异显著(p<0.05)
[0050]
由表2可知，基因型为双倍型cac纯合型个体的体重显著高于双倍型cac个体体重的表型值(p<0.05)，体长和全长有差异但不显著(p＞0.05)。
[0051]
通过检测本发明的snp位点所筛选的红鳍东方鲀双倍型纯合cac型个体，其体重显著高于双倍型杂合cac型个体。
[0052]
因此，本发明提供选育的snp位点可用作红鳍东方鲀优良品种选育用分子标记。