一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法与流程

本发明涉及细胞复苏技术领域，尤其是指一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法。

背景技术：

脐带血单个核细胞是一种从脐带血中分离出来的具有单个核的细胞，区别于无细胞核的红细胞，主要是由单核细胞和淋巴细胞组成。分离方法主要有ficoll(聚蔗糖—泛影葡胺)密度梯度离心法及hes(羟乙基淀粉)沉降法。

分离后的脐带血单个核细胞中富含cd34+造血组细胞(epcs)及cd14+单核细胞，可以释放出多种细胞因子，发挥神经保护、血管生成和免疫调节的作用，可以很好的用于神经系统疾病的治疗，例如新生儿缺氧缺血性脑病、中风等。同时，脐带血单个核细胞中也富含t细胞、nk细胞，可以用于扩增cik、car-t、car-nk等免疫细胞，用于肿瘤免疫治疗。

现有的复苏方法需要将细胞冻存管置于37℃水浴锅中，在快速复温后将细胞迅速转入4℃预冷的洗涤液中。然后进行离心，并去除离心后的上清液，以降低dmso对细胞产生的损伤和降低回输后对人体的副作用。

由于刚复苏脐带血单个核细胞较脆弱，耐受性较差。一方面，复苏后的细胞快速加入4℃预冷的洗涤液中，细胞会经历较大的渗透压变化，从而容易发生破裂；另一方面，加入4℃预冷的洗涤液后再进行离心，外部施加的离心力将会导致脆弱的细胞发生破裂。

采用现有复苏方法复苏单个核细胞，复苏后的细胞活率和活细胞的回收率都偏低。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏操作方法，能够显著提高低温冷冻的脐带血单个核细胞的活率和回收率。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法，包括：

s1、将复苏洗涤液放置在37℃的环境中；

s2、将低温冻存的脐带血单个核细胞置于37℃水浴锅中进行复温；

s3、将复温完成的脐带血单个核细胞转移至离心管；

s4、将复苏洗涤液分为第一复苏洗涤液和第二复苏洗涤液，其中第一复苏洗涤液与第二复苏洗涤液的容量比值为0.154-0.25；

s5、将第一复苏洗涤液匀速滴加到离心管中，滴加时间为160-170秒；

s6、将第二复苏洗涤液匀速滴加到离心管中，滴加时间为50-60秒，获得细胞悬液；

s7、通过离心法将细胞悬液分层；

s8、去除上清液。

进一步的，所述复苏洗涤液为0.9％氯化钠注射液。

进一步的，所述复苏洗涤液为5％人血白蛋白与10％右旋糖酐-40按1:1比例混合的溶液。

进一步的，在步骤s1之中，将复苏洗涤液放置在37℃的环境中至少6小时。

进一步的，在步骤s2之中，将低温冻存的脐带血单个核细胞置于37℃水浴锅中进行复温的复温时间为2-3分钟。

进一步的，在步骤s7之中，采用290-310g的离心参数对细胞悬液进行离心分层处理。

进一步的，在步骤s7之中，对细胞悬液进行离心分层处理的时间为9-11分钟。

进一步的，在步骤s3之中，在生物安全柜中将细胞从冻存管转移至离心管。

进一步的，生物安全柜中的环境温度为18-26℃。

本发明的有益效果在于：通过优化细胞复苏的操作方法，在不改变冻存液和洗涤液配方的情况下，有效提高了复苏细胞活率及回收率，大大改善了复苏效果。

附图说明

下面结合附图详述本发明的具体流程：

图1为本发明的复苏操作流程示意图；

图2为本发明的各实施例的平均活细胞回收率与对比例的平均活细胞回收率示意图；

图3为本发明的各实施例的平均细胞活率与对比例的平均细胞活率示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明，本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

实施例

请参阅图1，一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法，包括：

s1、将复苏洗涤液放置在37℃的环境中不少于6小时，以保证其温度为37℃，所述复苏洗涤液可以为0.9％氯化钠注射液，若是5％人血白蛋白与10％右旋糖酐-40按1:1比例混合的溶液效果更佳；

s2、将低温冻存的脐带血单个核细胞置于37℃水浴锅中进行复温，复温时间为2-3分钟；

s3、将冻存管转移至环境温度为18-26℃的生物安全柜中，在生物安全柜中将复温完成的脐带血单个核细胞从冻存管转移至离心管；

s4、将复苏洗涤液分为第一复苏洗涤液和第二复苏洗涤液，其中第一复苏洗涤液与第二复苏洗涤液的容量比值为0.154-0.25，具体的，复苏洗涤液的容量为30ml，第一复苏洗涤液的容量为4-6ml，第二复苏洗涤液的容量为24-26ml；

s5、将4-6ml的第一复苏洗涤液匀速滴加到离心管中，滴加时间为160-170秒，此步骤中，滴加速度过快会导致细胞损伤，滴加速度过慢会导致dmso对细胞的产生毒性；

s6、将26-24ml的第二复苏洗涤液匀速滴加到离心管中，滴加时间为50-60秒，获得细胞悬液；

s7、通过离心法将细胞悬液分层，具体的，采用290-310g的离心参数对细胞悬液进行离心分层处理，处理时间为9-11分钟；

s8、去除上清液，以降低dmso对细胞产生的损伤和降低回输后对人体的副作用。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：通过优化细胞复苏的操作方法，在不改变冻存液和洗涤液配方的情况下，有效提高了复苏细胞活率及回收率，大大改善了复苏效果。

实施例1

采集一份100ml脐带血，经ficoll密度梯度离心法分离并收集脐带血单个核细胞，收集后添加冻存保护液(血浆+5％dmso，冻存前活细胞密度为1.79×10⁷个/ml，细胞活率为95.1％)，再将冻存液重悬的细胞加入1.8ml冻存管中，每支1ml，细胞经程序降温后转入液氮罐保存；

一个月后，从液氮罐中取出冻存的脐带血单个核细胞，置于37℃水浴锅中快速复温至细胞溶液由固态变为液态，复温时间为2分钟；

复苏操作前先取1瓶0.9％氯化钠注射液放置在37℃的环境中不少于6小时；

将冻存管转移至37℃恒温的生物安全柜内，吸出细胞至一个50ml离心管中，取一个5ml移液管吸取5ml复温的0.9％氯化钠注射液，缓慢匀速滴加至含细胞的离心管中，总时间为2分40秒；

取一个25ml移液管吸取25ml复温的0.9％氯化钠注射液，缓慢匀速的加入含细胞的离心管中，总时间为54秒，从而得到细胞悬液；

将细胞悬液以300g的离心力进行离心处理，处理时间为10分钟；

离心处理完毕后，去除上清液，对沉淀在离心管底的细胞团使用复温的0.9％氯化钠注射液重悬，并定容至30ml，取0.5ml检测细胞数量及细胞活率。

实施例2

采集一份90ml脐带血，经ficoll密度梯度离心法分离并收集脐带血单个核细胞，收集后添加冻存保护液(血浆+5％dmso，冻存前活细胞密度为1.91×10⁷个/ml，细胞活率为92.3％)，再将冻存液重悬的细胞加入1.8ml冻存管中，每支1ml，细胞经程序降温后转入液氮罐保存；

一个月后，从液氮罐中取出冻存的脐带血单个核细胞，置于37℃水浴锅中快速复温至细胞溶液由固态变为液态，复温时间为2分15秒；

复苏操作前先取1瓶0.9％氯化钠注射液放置在37℃的环境中不少于6小时；

将冻存管转移至37℃恒温的生物安全柜内，吸出细胞至一个50ml离心管中，取一个5ml移液管吸取5ml复温的0.9％氯化钠注射液，缓慢匀速滴加至含细胞的离心管中，总时间为2分50秒；

取一个25ml移液管吸取25ml复温的0.9％氯化钠注射液，缓慢匀速的加入含细胞的离心管中，总时间为50秒，从而得到细胞悬液；

将细胞悬液以300g的离心力进行离心处理，处理时间为10分钟；

离心处理完毕后，去除上清液，对沉淀在离心管底的细胞团使用复温的0.9％氯化钠注射液重悬，并定容至30ml，取0.5ml检测细胞数量及细胞活率。

实施例3

采集一份120ml脐带血，经ficoll密度梯度离心法分离并收集脐带血单个核细胞，收集后添加冻存保护液(血浆+5％dmso，冻存前活细胞密度为1.92×10⁷个/ml，细胞活率为94.3％)，再将冻存液重悬的细胞加入1.8ml冻存管中，每支1ml，细胞经程序降温后转入液氮罐保存；

一个月后，从液氮罐中取出冻存的脐带血单个核细胞，置于37℃水浴锅中快速复温至细胞溶液由固态变为液态，复温时间为3分钟；

复苏操作前先取1瓶0.9％氯化钠注射液放置在37℃的环境中不少于6小时；

将冻存管转移至37℃恒温的生物安全柜内，吸出细胞至一个50ml离心管中，取一个5ml移液管吸取5ml复温的0.9％氯化钠注射液，缓慢匀速滴加至含细胞的离心管中，总时间为2分50秒；

取一个25ml移液管吸取25ml复温的0.9％氯化钠注射液，缓慢匀速的加入含细胞的离心管中，总时间为60秒，从而得到细胞悬液；

将细胞悬液以300g的离心力进行离心处理，处理时间为10分钟；

离心处理完毕后，去除上清液，对沉淀在离心管底的细胞团使用复温的0.9％氯化钠注射液重悬，并定容至30ml，取0.5ml检测细胞数量及细胞活率。

对比例1

采用实施例1中低温冻存的细胞，具体复苏方法为：

一个月后，从液氮罐中取出冻存的脐带血单个核细胞，置于37℃水浴锅中快速复温至细胞溶液由固态变为液态，复温时间为2分钟；

复苏操作前先取1瓶0.9％氯化钠注射液放置在4℃环境中不少于6小时；

将冻存管转移至生物安全柜内，吸出细胞至一个50ml离心管中，离心管中预先加入30ml预冷的0.9％氯化钠注射液；

将细胞悬液以300g的离心力进行离心处理，处理时间为10分钟；

离心处理完毕后，去除离心上清液，对沉淀在离心管底部的细胞团使用预冷的0.9％氯化钠注射液重悬，并定容至30ml，取0.5ml检测细胞数量及细胞活率。

对比例2

采用实施例2中低温冻存的细胞，具体复苏方法为：

一个月后，从液氮罐中取出冻存的脐带血单个核细胞，置于37℃水浴锅中快速复温至细胞溶液由固态变为液态，时间为2分15秒；

复苏操作前先取1瓶0.9％氯化钠注射液放置在4℃环境中不少于6小时；

将冻存管转移至生物安全柜内，吸出细胞至一个50ml离心管中，离心管中预先加入30ml预冷的0.9％氯化钠注射液；

将细胞悬液以300g的离心力进行离心处理，处理时间为10分钟；

离心处理完毕后，去除离心上清液，对沉淀在离心管底部的细胞团使用预冷的0.9％氯化钠注射液重悬，并定容至30ml，取0.5ml检测细胞数量及细胞活率。

对比例3

采用实施例3中低温冻存的细胞，具体复苏方法为：

一个月后，从液氮罐中取出冻存的脐带血单个核细胞，置于37℃水浴锅中快速复温至细胞溶液由固态变为液态，时间为3分钟；

复苏操作前先取1瓶0.9％氯化钠注射液放置在4℃环境中不少于6小时；

将冻存管转移至生物安全柜内，吸出细胞至一个50ml离心管中，离心管中预先加入30ml预冷的0.9％氯化钠注射液；

将细胞悬液以300g的离心力进行离心处理，处理时间为10分钟；

离心处理完毕后，去除离心上清液，沉淀在离心管底部的细胞团使用预冷的0.9％氯化钠注射液重悬，并定容至30ml，取0.5ml检测细胞数量及细胞活率。

实施例1-3与对比例1-3均使用ao/pi(吖啶橙/碘化丙啶)荧光染色法测量细胞数量及活率，其原理是：ao染料可以通过完整的细胞膜，结合所有细胞的细胞核，呈现绿色荧光，pi只能通过不完整的细胞膜，结合死细胞的细胞核，呈现红色荧光，对红细胞不染色，可以排除红细胞等干扰。

其中，活细胞回收率计算方法为：

活细胞回收率＝复苏后活细胞数量/冻存前活细胞数量。

表1

请参阅表1、图2和图3，通过表1、图2和图3的结果可以看出，实施例与对比例的复苏后活细胞回收率差异显著，p<0.05，实施例与对比例的活率差异极显著，p<0.001，说明本复苏方法可以显著提高复苏后脐带血单个核细胞回收率及细胞活率。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。