敲除CD38基因的细胞系、其构建方法及应用与流程

敲除cd38基因的细胞系、其构建方法及应用
技术领域
1.本发明与免疫学和工程细胞等技术领域有关。具体地，本发明构建了敲除cd38的细胞系，该细胞系可用于评估cd38
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cd3双特异性抗体的效价强度。


背景技术：

2.多发性骨髓瘤是一种常见的恶性血液肿瘤，引起广泛的骨质破坏、复发性感染、贫血、高钙血症、肾机能不全，以及一系列不良反应。多发性骨髓瘤由分泌抗体的浆细胞的致瘤性转化引起。其特征是贯穿骨髓的多病灶恶性病变。尽管遗传分析揭示了该病的复杂性和异质性，但是大部分癌细胞高表达cd38。这与正常淋巴细胞和骨髓细胞中cd38的低表达明显不同。
3.cd38是一个ii型跨膜糖蛋白，发挥多种功能，比如，cd38作为参与启动活化和增殖信号的受体，作为粘附分子，也可作为胞外酶。由于多发性骨髓瘤浆细胞上cd38的高水平一致表达，以及cd38作为受体和胞外酶而发挥作用，cd38代表了一个用于治疗骨髓瘤的有希望的治疗靶点。cd38抗体发挥作用的机制是多效性的。治疗性cd38 mab(dora或者morre)发挥依赖于fc的免疫效应机制，例如，补体依赖性细胞毒性反应(cdc)、抗体依赖性细胞毒性反应(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)以及通过二级交联的凋亡。胞外酶功能的抑制和直接凋亡也可能促进抗体杀死多发性骨髓瘤细胞的效能。双特异性抗体(cd38
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cd3)将细胞毒性t细胞向表达肿瘤相关抗原的癌细胞的招募是一种极具潜力的用于治疗恶性血液病的治疗方式。
4.promega开发了一个基于细胞的t细胞活化生物检测方法，该方法利用稳定表达由nfat应答元件(nfat-re)驱动的荧光素酶报告基因的jurkat t作为效应细胞。nfat转录因子家族在免疫应答中发挥重要作用。内源性表达肿瘤抗原的肿瘤细胞系作为抗原提呈细胞。将这两种细胞系共培养，并添加cd3双特异性抗体(bsab)，jurkat效应细胞的tcr/cd3被激活。通过nfat-re激活而上调荧光素酶活性。该分析特别适用于bsab的相对效能的确定，并且呈现良好的线性关系。该分析方法也很简单且稳健。由于jurkat t细胞也表达cd38蛋白，当利用工程改造的jurkat报告基因细胞作为效应细胞来构建适用于cd3
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cd38双特异性抗体的报告基因分析方法时，jurkat t细胞上表达的cd38也将刺激报告基因细胞的活化，并增加非特异性信号，从而干扰分析结果。因此，利用敲除cd38的jurkat t来确定cd3
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cd38双特异性抗体活性是很重要的。本研究利用crispr-cas9系统来敲除jurkat t中的cd38。
5.crispr-cas系统稳健且多能的刺激真核细胞中靶向的双链dna断裂(dsbs)，在dsbs处，引起的细胞修复机制非同源末端连接(nhej)可被用来产生易错修复。来自酿脓链球菌的cas9核酸酶能被一种嵌合单链向导rna(sgrna或称为grna)导向任何其后有一个50-ngg前间区序列邻近基序(pam)的基因位点。sgrna中的一个20nt向导序列通过watson-crick碱基配对机制将cas9导向基因组靶点，并能被轻易地设计来靶向一个预期的基因组位点。通过共表达s.pyogenes cas9(spcas9)核酸酶和向导rna，crispr-cas系统能适用于
哺乳动物细胞。与以前的方法相比，crispr-cas9技术更特异并且更容易被设计来敲除基因。通过改变grna序列，可以靶向任何生物(从海藻到人类)的几乎任何序列。但是crispr-cas9技术存在脱靶效应问题，因此如何控制脱靶效应提高技术特异性成为该技术成功应用的关键。


技术实现要素：

6.针对以上技术问题，本发明公开了一种敲除cd38基因的细胞系、其制备方法及其应用，该方法能稳定敲除人急性t淋巴细胞白血病细胞jurkat中cd38基因的表达。
7.具体地，本发明涉及以下方面：
8.1.grna，其选自seq id no：1，seq id no：2，seq id no：3，seq id no：4或seq id no：5所示的序列，或者在seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4或seq id no：5所示的序列的任5’末端添加或删除对应cd38基因的碱基，使得grna的总长度在17-24个碱基范围内，或者在grna总长度在17-24个碱基的情况下，对从3’端起第17位碱基上游的碱基进行置换，优选进行1个碱基的置换。
9.2.载体，所述载体包含项目1所述的grna，优选如seq id no：4所示的sgrna；更优选地，所述载体选自质粒、慢病毒、腺病毒、或其组合，更优选cas9载体。
10.3.宿主细胞，其包含项目1所述的grna，或项目2所述的载体，优选所述宿主细胞为表达cd38的宿主细胞，更优选为jurkat细胞，nci-h929细胞，u266b1细胞，或arh-77细胞。
11.4.制备敲除cd38基因的细胞系的方法，包括将项目2所述载体转染表达cd38的宿主细胞(优选jurkat细胞，nci-h929细胞，u266b1细胞，或arh-77细胞)。
12.5.敲除cd38基因的细胞(优选jurkat细胞，nci-h929细胞，u266b1细胞，或arh-77细胞)，其特征在于利用项目4所述的方法制备。
13.6.项目5所述的敲除cd38基因的细胞，其是保藏编号为cctcc no：c2020160的人白血病t细胞系jurkat-4-3-f11或保藏编号为cctcc no：c202073的人白血病t细胞系jurkat-4-3-d6。
14.7.用于评估双特异性抗体活性的改造细胞，所述双特异性抗体针对抗原a和抗原b，所述改造细胞的亲本细胞同时包含抗原a和抗原b的编码基因，所述改造细胞的特征在于敲除了亲本细胞中抗原a或抗原b的编码基因。
15.8.项目7所述的改造细胞，其中所述亲本细胞是jurkat细胞、nk细胞、nci-h929细胞、u266b1细胞或arh-77细胞。
16.9.项目7或8所述的改造细胞，其中所述抗原a和抗原b选自以下各项组成的组：
17.(1)所述抗原a为cd38抗原，所述抗原b为cd3抗原；
18.(2)所述抗原a是muc1抗原，所述抗原b是cd3抗原；
19.(3)所述抗原a是claudin-6抗原，所述抗原b是cd3抗原；
20.(4)所述抗原a为cd30抗原，所述抗原b为cd16a抗原；
21.其中所述改造的细胞敲除了编码抗原a的基因；优选地，所述改造细胞为敲除cd38基因的jurkat细胞；优选地，所述改造细胞为项目5所述敲除cd38基因的细胞。
22.10.项目7-9任一项所述的改造细胞用于评估双特异性抗体功能(例如效价强度、生物学活性、受体占据率等)中的应用。
23.11.项目10所述的应用，其中所述双特异性抗体为靶向cd38和cd3、muc1和cd3、claudin-6和cd3或cd30和cd16a的双特异性抗体等。
24.12.评估双特异性抗体活性的方法，所述双特异性抗体针对抗原a和抗原b，包括以下步骤：
25.(1)构建敲除了亲本细胞中抗原a或抗原b的编码基因的改造细胞，
26.(2)利用步骤(1)中获得的改造细胞评估双特异性抗体的活性。
27.13.项目12所述的方法，其中所述敲除通过crispr-cas系统进行。
28.14.项目12-13任一项所述的方法，其中所述亲本细胞是jurkat细胞、nk细胞、nci-h929细胞、u266b1细胞或arh-77细胞。
29.15.项目12-14任一项所述的方法，其中所述抗原a和抗原b选自以下各项组成的组：
30.(1)所述抗原a为cd38抗原，所述抗原b为cd3抗原；
31.(2)所述抗原a是muc1抗原，所述抗原b是cd3抗原；
32.(3)所述抗原a是claudin-6抗原，所述抗原b是cd3抗原；
33.(4)所述抗原a为cd30抗原，所述抗原b为cd16a抗原；
34.其中所述改造的细胞敲除了编码抗原a的基因；优选地，所述步骤(1)中获得的改造细胞为敲除cd38基因的jurkat细胞或项目5所述敲除cd38基因的细胞，所述双特异性抗体为靶向cd38
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cd3的双特异性抗体。
35.在一些实施方案中，所述亲本细胞为jurkat细胞，所述抗原a为cd38抗原，所述抗原b为cd3抗原；所述改造细胞敲除了编辑抗原a的基因。
36.在一些实施方案中，所述评估为体外评估。
37.在一些实施方案中，所述改造细胞含有报告基因，优选地为nfat应答元件(nfat-re)驱动的荧光素酶报告基因。
38.在一些实施方案中，所述步骤(2)包括：将所述改造细胞、靶细胞和待评估的双特异性抗体混合，通过检测报告基因表达来评估双特异性抗体活性或功能。
39.例如，本发明提供了一种敲除cd38基因的jurkat细胞系，其选自：人白血病t细胞系jurkat-4-3-f11、人白血病t细胞系jurkat-4-3-d6、或其组合。所述人白血病t细胞系jurkat-4-3-f11的微生物保藏编号是cctcc no：c2020160，保藏日期为2020年8月28日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心；所述人白血病t细胞系jurkat-4-3-d6的微生物保藏编号是cctcc no：c202073，保藏日期为2020年8月28日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。所述人白血病t细胞系jurkat-4-3-f11和jurkat-4-3-d6均属于人急性t淋巴细胞白血病细胞jurkat细胞系，培养基均为1640，培养物的培养条件、检测存活性条件均为温度37℃，5％co2，抗生素潮霉素b浓度100μg/ml，抗生素g418浓度500μg/ml。该培养物对人、动物或者植物无害，不会导致环境污染。
40.在一个实施方案中，本发明还公开了一种敲除cd38基因的jurkat细胞系的建立方法，将含有grna的重组载体转染jurkat细胞，经筛选得到所述cd38基因敲低的细胞系；其中所述sgrna如seq id no：1-5所示，优选为seq id no：4所示。较佳地，其包括以下步骤：
41.步骤s1，cd38 grna序列的设计和评估；
42.步骤s2，构建cas9-grna质粒；
43.步骤s3，用电转的方法将cas9-grna质粒转染进jurkat细胞；
44.步骤s4，添加嘌呤霉素(0.3μg/ml)，筛选cd38表达敲除的细胞pool；
45.步骤s5，从cd38表达敲除的细胞群中筛选cd38表达敲除的单细胞克隆；
46.采用该技术方案，可以高效特异地建立目的基因表达沉默的稳定细胞系。
47.作为本发明的进一步改造，步骤s1中，所述cd38 grna为cd38 grna1、cd38 grna2、cd38 grna3、cd38 grna4或cd38 grna5，所述cd38 grna1的序列如seq id no：1所示，所述cd38 grna2的序列如seq id no：2所示，所述cd38 grna3的序列如seq id no：3所示，所述cd38 grna4的序列如seq id no：4所示，所述cd38 grna5的序列如seq id no：5所示。采用该技术方案的cd38 grna序列基因内脱靶位点少，且对cd38功能具有重要影响作用。
48.作为本发明的进一步改造，步骤s3中用电转的方法将cas9-grna质粒转染进jurkat细胞，使用celetrix电转仪，20m细胞，1080v，30ms，1pulse。
49.本发明还公开了如上所述的敲除cd38基因的jurkat细胞系的应用，其在评估靶向cd38双特异性抗体效价强度、生物学活性和受体占据率中的应用。
50.本发明公开了一种sgrna，所述sgrna序列如seq id no：1-5(优选seq id no：4)所示。所述sgrna用于敲除cd38基因。
51.本发明还公开了用于敲除cd38基因的载体，所述载体含有如seq id no：1-5所示的sgrna；较佳地，所述载体选自质粒、慢病毒、腺病毒、或其组合。
52.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
53.采用本发明的技术方案，选择特异性高、脱靶率低的grna序列(例如seqidno：1-5，优选seq id no：4)，达到特异性敲除cd38基因并建立稳定细胞系的目的。
附图说明
54.图1. 5个cas9-grna质粒的直接测序结果。图1a～图e分别为cd38 grna1、grna2、grna3、grna4和grna5质粒直接测序结果，其中黑色区域表示grna的序列。
55.图2.不同jurkat细胞pool中cd38的表达。图2a为jurkat细胞pool 4和jurkat细胞pool 7中cd38表达水平检测结果，图2b分别为jurkat细胞pool 9和jurkat细胞pool 10中cd38表达水平检测结果，图2c分别为jurkat细胞pool 11和jurkat细胞pool 12中cd38表达水平检测结果，图2d为jurkat细胞pool 13中cd38表达水平检测结果，图2e为jurkat细胞pool的cd38平均荧光强度(mfi)。
56.图3.不同jurkat单克隆细胞中cd38的表达水平。图3a分别为jurkat单克隆细胞4-3-c7和4-3-d6中cd38表达水平检测结果，图3b分别为jurkat单克隆细胞4-3-f11和4-4-c6中cd38表达水平检测结果，图3c分别为jurkat单克隆细胞7-1-d5和7-2-f2中cd38表达水平检测结果，图3d为jurkat单克隆细胞4-3-c7、4-3-d6、4-3-f11、4-4-c6、7-1-d5以及7-2-f2的cd38平均荧光强度(mfi)。
57.图4.jurkat-4-3-f11和jurkat-4-3-d6单克隆细胞稳定性研究结果。
58.图5.使用利用敲除cd38的细胞系jurkat-4-3-f11(a)和jurkat-4-3-d6(b)对靶向cd38
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cd3的双特异性抗体(bsab)进行生物学活性评估的结果。
59.图6.评估靶向cd38
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cd3的双特异性抗体(bsab)生物学活性的分析方法操作流程。
60.图7.使用cd38阳性jurkat对照细胞和敲除cd38的jurkat细胞进行报告基因分析(无靶细胞nci-h929)的结果。图7a为jurkat对照细胞和jurkat-4-3-f11细胞在无靶细胞nc i-h929的体系中的报告基因检测结果；图7b为jurkat对照细胞和jurkat-4-3-d6细胞在无靶细胞nc i-h929的体系中的报告基因检测结果。
61.图8.使用敲除cd38的稳定jurkat-4-3-f11细胞系进行双特异性抗体的受体占据率分析的结果。图8a和图8b为cd38
×
cd3的双特异性抗体(bsab)对cd38靶点的受体占据率；图8c和图8d为cd38
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cd3双特异性抗体(bsab)对cd3靶点的受体占据率。
62.图9.jurkat t细胞表达的cd38干扰cd38
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cd3双特异性抗体(bsab)对t细胞的激活。
具体实施方式
63.以下结合附图对本发明的方法和应用进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
64.实施例1.敲除cd38基因的jurkat细胞系的建立
65.建立一种敲除cd38基因的jurkat细胞系，包括以下步骤：
66.步骤s1：cd38 grna序列的设计和评估：
67.通过筛选和评估，得到基因内脱靶位点较少、对cd38功能具有重要作用的5段grna序列，分别为：
68.cd38 grna 1：tgtacttgacgcatcgcgcc，位于cd38基因的n-端编码区，如seq id no：1所示。
69.cd38 grna 2：caccgggctgaactcgcagt，位于cd38基因的n-端编码区，如seq id no：2所示。
70.cd38 grna 3：cttgacgcatcgcgccagga，位于cd38基因的n-端编码区，如seq id no：3所示。
71.cd38 grna 4：tcgcggtggtcgtcccgagg，位于cd38基因的n-端编码区，如seq id no：4所示。
72.cd38 grna 5：cgagcaccacgacgaggatc，位于cd38基因的n-端编码区，如seq id no：5所示。
73.根据crispr/cas9技术发明人之一张峰教授所提供的软件(http：//crispr.mit.edu/)，对cd38基因组序列中起始密码子atg附近的序列进行分析。可找到若干个grna序列，选择评分较高、基因内脱靶位点较少的grna序列，其中5段grna序列及其所对应的基因编码范围见表1。如表1所示，此5段grna序列评分均在90以上、基因内脱靶位点较少、对cd38功能具有重要作用。
74.表1
[0075][0076]
步骤s2，构建cas9-grna质粒，包括以下步骤：
[0077]
(1)根据5段cd38 grna的序列，合成三对互补的单链dna寡聚体。
[0078]
(2)将合成的单链dna寡聚体转变成双链dna寡聚体，反应条件：37℃，30分钟；95℃，5分钟；以5℃/分钟的速度将温度降至25℃。
[0079]
(3)连接反应：用t4 dna连接酶将双链dna寡聚体与经bbsi酶切的cas9(addgene，#48139)质粒进行连接。
[0080]
(4)转化感受态大肠杆菌，将细菌涂布于含氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养过夜。每个平板上随机挑取5个菌落，接种到lb培养基中，37℃，200rpm培养5小时。
[0081]
(5)各取50μl单克隆菌液送商业公司测序，如图1所示，黑色框圈着的序列为各grna序列，结果显示各grna序列成功正确插入cas9载体中，cas9-grna质粒构建成功。
[0082]
(6)扩增含正确sgrna序列的质粒。
[0083]
步骤s3，用电转的方法将cas9-grna质粒转染进jurkat细胞(promega，cs187109)，包含以下步骤：
[0084]
每个转染组各准备20m jurkat细胞，使用celetrix电转仪，1080v，30ms，1pulse。
[0085]
步骤s4，添加嘌呤霉素，筛选cd38表达敲除的细胞pool，包含以下步骤：
[0086]
转染72小时后，用含0.3μg/ml嘌呤霉素的培养基培养细胞，筛选嘌呤霉素抗性细胞群。根据细胞死亡情况，每1～3天换一次培养基，直到细胞不再死亡为止，并将细胞群分为若干份培养，大约需要20～25天，并通过流式分析的方法鉴定各细胞群中cd38的表达水平。结果如图2所示，在各细胞pool中均出现cd38被敲除的细胞，尤其是cas9-grna 4质粒转染组获得的细胞pool 4和pool 7，相比较于其他细胞pool，细胞pool 4和pool 7中cd38的表达几乎全部被敲除。以下为流式分析步骤：
[0087]
收集大约1
×
106细胞，用1
×
pbs(ph7.4)洗细胞一次，300g室温离心5分钟。添加5μl fitc抗人cd38抗体(biolegend，303504)并在冰上避光孵育15-20分钟。用1
×
pbs(ph7.4)洗细胞两次，每次300g室温离心5分钟。用0.5ml 1
×
pbs(ph7.4)重悬细胞。流式上机分析。
[0088]
步骤s5，从cd38表达敲除的细胞群中筛选cd38表达敲除的单细胞克隆，包含以下步骤：
[0089]
将含cd38敲除细胞最多的细胞群按每孔0.5个细胞的方法转至96孔板，并在同一天对各96孔板各孔进行拍照，6～7天后对各96孔板各孔再次进行拍照，以筛选出单克隆细胞，共获得18个单克隆细胞。对单克隆细胞进行扩大培养，并通过流式分析的方法鉴定各细胞克隆中cd38的表达水平。结果如图3所示，其中6个单细胞克隆的cd38被敲除，这6个单克隆细胞4-3-c7、4-3-d6、4-3-f11、4-4-c6、7-1-d5以及7-2-f2均来自细胞pool4和pool7。
[0090]
实施例2.敲除cd38的细胞的稳定性研究
[0091]
对成功敲除cd38的细胞克隆进行冻存，然后再复苏并传代，进行稳定性研究，包含以下步骤：
[0092]
各成功敲除cd38的单克隆细胞每次按固定细胞密度进行传代，每隔一天传代一次，每次传代前和传代后分别对各单克隆细胞进行计数，记录细胞活力和细胞密度。
[0093]
结果如图4所示，jurkat-4-3-f11细胞和jurkat-4-3-d6细胞在传代至第23代过程中均能够维持高细胞活力、高密度和稳定的扩增效率。
[0094]
实施例3.敲除cd38的稳定jurkat细胞系在双特异性抗体生物学活性分析研究中的应用
[0095]
按照图6的操作流程，进行敲除cd38的稳定jurkat细胞系在双特异性抗体生物学活性分析研究中的应用，包含以下步骤：
[0096]
用assav buffer(1％fbs-rpmi1640培养基)准备nci-h929细胞(cctcc，gdc300)悬液，使其细胞密度为2
×
106个/ml。同样地，准备敲除cd38的jurkat-4-3-f11细胞和jurkat-4-3-d6细胞悬液，使其细胞密度均为3
×
106个/ml。根据实验设计，按每孔20μl细胞悬液，将各细胞添加至96孔白板。准备cd38
×
cd3双特异性抗体(bsab，其由融合肽1，重链和轻链组成；其中融合肽1依次由seq id no：6，seq id no：7，seq id no：8，seq id no：9，seq id no：10和seq id no：11组成；重链依次由seq id no：12，seq id no：13，seq id no：14，seq id no：15和seq id no：16组成；轻链依次由seq id no：17和seq id no：18组成，其中所述重链和轻链配对，所述重链和融合肽1配对)梯度稀释液。按每孔20μl将抗体梯度稀释液(抗体起始浓度300000ng/ml，4倍梯度稀释)添加至96孔白板。将96孔白板置于细胞培养箱(37℃，5％co2)孵育6小时。添加60ul bio-lite荧光素酶检测液至培养板，然后室温孵育15分钟。最后将培养板置于多功能读数仪中读取化学发光值。
[0097]
cd38
×
cd3双特异性抗体的融合肽1：
[0098]
qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfstyamnwvrqapgkglewvarirskynnyatyyadsvkdrftisrddskntlylqmnslraedtavyycarhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvss(seq id no：6)
[0099]
ggggsggggsggggs(seq id no：7)
[0100]
qtvvtqepsltvspggtvtltcrsstgavttsnyanwvqqkpgqaprgliggtnkrapgvparfsgsllggkaaltlsgvqpedeaeyycalwysnlwvfgggtkveik(seq id no：8)
[0101]
grgrgsdkthtcp(seq id no：9)
[0102]
pcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsheapevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktk(seq id no：10)
[0103]
gqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：11)
[0104]
cd38
×
cd3双特异性抗体的重链：
[0105]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyafswvrqapgqglewmgrvipflgiansaqkfqgrvtitadkststaymdlsslrsedtavyycarddiaalgpfdywgqgtlvtvss(seq id no：12)
[0106]
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc(seq id no：13)
[0107]
dkthtcp(seq id no：14)
[0108]
pcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsheapevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktk(seq id no：15)
[0109]
gqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflys
kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：16)
[0110]
cd38
×
cd3双特异性抗体的轻链：
[0111]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgisswlawyqqkpekapksliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqynsyprtfgqgtkveik(seq id no：17)
[0112]
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no：18)
[0113]
结果如图5a所示，使用敲除cd38的稳定jurkat-4-3-f11细胞作为效应细胞检测cd38
×
cd3双特异性抗体生物学活性所得ec
50
值为2446ng/ml；如图5b所示，使用敲除cd38的稳定jurkat-4-3-d6细胞作为效应细胞检测cd38
×
cd3双特异性抗体生物学活性所得ec
50
值为1917ng/ml，根据计算所得的ec
50
值可以分别用于后续计算cd38
×
cd3双特异性抗体的生物学活性。因此，敲除cd38的稳定jurkat-4-3-f11细胞和jurkat-4-3-d6细胞均能很好的应用于靶向cd38
×
cd3双特异性抗体生物学活性的分析研究。
[0114]
实施例4.敲除cd38的jurkat-4-3-f11细胞和jurkat-4-3-d6细胞在双特异性抗体生物学活性分析研究中的对分析结果干扰的影响
[0115]
下面分析敲除cd38的jurkat-4-3-f11细胞和jurkat-4-3-d6细胞在双特异性抗体生物学活性分析研究中的对分析结果干扰的情况，包含以下步骤：
[0116]
用assay buffer(1％fbs-rpmi1640培养基)准备表达cd38的jurkat对照细胞悬液和敲除cd38的jurkat-4-3-f11细胞悬液和jurkat-4-3-d6细胞悬液，使其细胞密度均为3
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106个/ml。根据实验设计，按每孔20μl细胞悬液，将各细胞添加至96孔白板。准备抗体梯度稀释液(抗体起始浓度300000ng/ml，4倍梯度稀释)。按每孔20ul将cd38
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cd3双特异性抗体(实施例3的bsab)梯度稀释液添加至96孔白板。同时每孔添加20μl assay buffer以代替nci-h929细胞悬液。将96孔白板置于细胞培养箱(37℃，5％co2)孵育6小时。添加60μl bio-lite荧光素酶检测液至培养板，然后室温孵育15分钟。最后将培养板置于多功能读数仪中读取化学发光值。
[0117]
结果如图7a和图7b所示，jurkatt对照细胞组有荧光信号，而jurkat-4-3-d6和jurkat-4-3-f11细胞组没有荧光信号。由于jurkatt对照细胞也表达cd38，这会干扰cd38
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cd3双特异性抗体对t细胞的激活，即在不加靶细胞nci-h929仅添加作为效应细胞的jurkat对照细胞的反应体系中cd38
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cd3双特异性抗体仍然能一定程度地激活t细胞，而使用新构建的敲除cd38的jurkat-4-3-f11细胞和jurkat-4-3-d6细胞作为效应细胞的反应体系(不添加靶细胞nci-h929)中cd38
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cd3双特异性抗体不能激活t细胞。
[0118]
实施例5.敲除cd38的jurkat-4-3-f11细胞在双特异性抗体受体占据率分析研究中的应用
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下面进行敲除cd38的jurkat-4-3-f11细胞在双特异性抗体受体占据率分析研究中的应用。具体包含以下步骤：
[0120]
细胞计数后用含1％fbs的pbs(1％fbs-pbs)洗涤细胞2次，以每孔1
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105个细胞加入到上样板。配制cd38
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cd3双特异性抗体(实施例3的bsab)浓度梯度(抗体起始浓度300000ng/ml，4倍梯度稀释)(同时设置靶向人cd38的单克隆抗体(abcam，ab235118)孔和靶向人cd3的单克隆抗体(abcam，ab8090)孔，各孔加入稀释好的抗体，整个体系为100μl，空白对照孔则加入1％fbs-pbs至100μl，4℃孵育1h。各孔用1％fbs-pbs洗涤3次，加入流式抗体
pe抗人igg fc(biolegend，b217739)，室温避光孵育30min。1％fbs-pbs洗涤2次，每孔加150μl 1％fbs-pbs重悬细胞，流式上机检测并计算出ro值，计算公式如下：ro(％)＝(br-nc)/(tr-nc)
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100％。br：即bound receptor，指cd38
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cd3双特异性抗体与细胞结合产生的平均荧光强度(mfi)；tr：即total receptor，指cd38单克隆抗体与daudi细胞(cctcc，gdc097)结合达平台期所对应的mfi的2倍值，或cd3单克隆抗体与jurkat-4-3-f11细胞结合达平台期所对应的mfi的2倍值。nc：即阴性对照，指细胞与荧光二抗pe抗人igg fc(biolegend，b217739)孵育后产生的mfi。
[0121]
结果如图8所示。daudi细胞不表达cd3但高表达cd38，可用于检测cd38
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cd3双特异性抗体对cd38端靶点的受体占据率。jurkat对照细胞同时表达cd3及cd38，导致cd38
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cd3双特异性抗体既可通过cd3端也可通过cd38端与细胞结合，用该细胞检测cd38
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cd3双特异性抗体在cd3或cd38任何一端的受体占据率时都会受到另一端的干扰，因此不适合用该细胞检测cd38
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cd3双特异性抗体的受体占据率。jurkat-4-3-f11细胞不表达cd38但高表达cd3，可用于检测cd38
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cd3双特异性抗体对cd3端靶点的受体占据，且不受cd38
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cd3双特异性抗体在cd38端亲和力的影响。jurkat-4-3-d6细胞的结果与jurkat-4-3-f11细胞类似。
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实施例6.jurkat t细胞表达的cd38干扰cd38
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cd3双特异性抗体对t细胞的激活
[0123]
jurkat t细胞表达的cd38干扰cd38
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cd3双特异性抗体对t细胞的激活。用cd38抗体封闭后这种干扰会被消除，具体包含以下步骤：
[0124]
用assay buffer(1％fbs-rpmi1640培养基)准备nci-h929细胞(cctcc，gdc300)悬液，使其细胞密度为2
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106个/ml。同样地，准备表达cd38的jurkat t细胞悬液，使其细胞密度均为3
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106个/ml。根据实验设计，按每孔20μl细胞悬液，将各细胞添加至96孔白板。准备cd38
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cd3双特异性抗体梯度稀释液(抗体起始浓度300000ng/ml，4倍梯度稀释)。按每孔20μl将抗体梯度稀释液添加至96孔白板。将96孔白板置于细胞培养箱(37℃，5％co2)孵育6小时。添加60μl bio-lite荧光素酶检测液至培养板，然后室温孵育15分钟。最后将培养板置于多功能读数仪中读取化学发光值。同时设置以下不同处理组：
[0125]
(1)同时用cd38抗体(abcam，ab235118)封闭jurkat t细胞上表达的cd38；
[0126]
(2)用cd38抗体(abcam，ab235118)封闭jurkat t细胞上表达的cd38，不添加cd38
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cd3双特异性抗体；
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(3)仅添加jurkat t细胞和cd38
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cd3双特异性抗体；
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(4)仅添加用cd38抗体(abcam，ab235118)封闭的jurkat t细胞和cd38
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cd3双特异性抗体；
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结果如图9所示，jurkat t细胞表达的cd38干扰cd38
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cd3双特异性抗体对t细胞的激活，用cd38抗体封闭jurkat t细胞上表达的cd38后这种干扰消失。