一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法与流程

1.本发明是一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法，属于细胞技术领域。


背景技术：

2.长久以来，以手术、放疗和化疗为代表的传统治疗手段在恶性肿瘤治疗中取得较好的疗效。但是这些治疗手段对于不同肿瘤存在局限性，且伴有明显的副作用。因此，寻找一种对患者损伤较少又能有效控制肿瘤生长和转移的治疗方法，是临床肿瘤治疗的迫切需求。随着随着肿瘤生物学、免疫学以及分子生物学等相关学科的迅速发展和交叉渗透，肿瘤免疫治疗的研究突飞猛进，以免疫学原理为基础、以细胞生物学技术为方法而建立起来的肿瘤免疫细胞治疗，已经从实验室研究逐渐向有效、安全的临床应用过渡。
3.自然杀伤细胞(natural killer cell，又称nk细胞)，是机体天然免疫的主要细胞，nk细胞形态上属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，是除t 细胞、b细胞之外的第三大类淋巴细胞，约占血液中所有免疫细胞(白细胞数量)的15％。nk细胞在识别靶细胞上具有非特异性，通过靶细胞表面的细胞间粘附分子
‑
1(icam
‑
1)的作用参与nk细胞的识别过程。另外，nk 细胞通过分泌穿孔素、nk细胞毒因子和tnf等对靶细胞进行杀伤作用。由于nk细胞的杀伤活性无mhc限制，不依赖抗体，被称为自然杀伤活性。近年来，关于nk细胞及其抗肿瘤功能的研究已经成为免疫学和肿瘤学研究的热点内容之一。nk细胞抗肿瘤已经在美国和日本等国家进行了大量的临床试验，显示了良好的应用前景。
4.自然杀伤细胞(natural killer cell,nk细胞)作为固有免疫细胞,它的激活和杀伤作用无mhc限制也不需预先致敏。因此其不仅局限于自体使用，异体nk免疫细胞治疗越来越受人们的关注。
5.nk细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。目前应用于免疫细胞治疗的nk细胞主要来源自供者外周血、异体脐带血和nk细胞系。
6.传统的nk细胞系为是来源自恶性非霍奇金淋巴瘤患者外周血的nk92 细胞，其在低浓度il
‑
2存在下即可维持有效增殖，而100iu/ml il
‑
2的浓度下课使其具有较强的细胞毒效应。nk
‑
92与nk细胞一样，识别靶细胞无 mhc限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞，还可以产生一系列的细胞因子，进而对机体的获得性免疫进行调节。目前以诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，ips cells)为来源经体外诱导为nk细胞，利用ipsc体外无限增殖的特性产生源源不断的nk细胞。以此作为异体nk免疫细胞治疗优秀的细胞来源。但无论是nk92细胞系还是以 ipsc诱导分化为nk细胞来源，均有较大的安全性风险。首先nk92细胞系来源自肿瘤细胞在体外可以无限增殖，有较大的癌变风险。因此在使用前需要进行辐照灭活，限制其在受者体内长期存续的时间，影响治疗效果。而使用ipsc诱导分化为nk细胞来源，其ipsc细胞本身就具备无限增殖的能力，具有癌变风险。其次ipsc经基因操作，有可能增加其致瘤性。因此，以细胞系作为异体使用的nk细胞来源虽然大
规模生产成本较低，且质量稳定，但是具有较大的安全性风险。
7.以成人外周血作为nk细胞的来源，其供者可以为受者本人或其他的健康成人供者，该技术方向实现成本较低且更为灵活。但是在肿瘤治疗中，受者本人一般为肿瘤患者，以其为细胞来源存在细胞生物学活性低和细胞数量少的风险。虽然nk细胞的使用不受mhc限制，但是仍然存在一定的免疫原性，在异体使用中可能引起免疫排斥反应，无论是自体还是异体成人供者为nk细胞来源，都具有一定的传染病风险，在生产过程中需要完整的隔离操作杜绝交叉污染，因此以成人外周血为nk细胞来源，虽然技术要求较低，生产更为灵活，但是因为其细胞来源的不一致，终产品的质量不稳定且质量控制成本较高，而且每一个供者的细胞需要作为独立的产品批次进行生产和隔离，无形中加大了生产的成本，但是脐带血的生物学来源为新生儿本人，其生物学特性不一致。其次，每单位脐带血受限制于采集时的血液体积，每个供者的脐带血总细胞数量是有限的。因此，以脐带血作为nk细胞来源应用于免疫细胞治疗的关键是实现细胞的大规模生产。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
9.为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法，该方法利用与脐带血供者相同来源的脐带间充质干细胞与脐带血中的有核细胞进行共培养，为脐带血中的有核细胞提供一个促进增殖和分化的微环境，实现脐带血中的有核细胞向nk细胞及其前体细胞在体外的大规模扩增，降低后续nk细胞大规模生产中对脐带血原料的需求应用于后续nk细胞治疗产品的产业化。
10.进一步地，一种脐带间充质干细胞共培养自然杀伤细胞的方法，包括以下步骤：
11.(1)脐带血有核细胞的分离与冻存；
12.(2)同一供者的脐带间充质制备与冻存；
13.(3)脐带血有核细胞与脐带间充质干细胞的共培养体外扩增；
14.(4)扩增后的脐带血有核细胞nk细胞分选；
15.(5)纯化nk细胞的体外大规模扩增与冻存。
16.进一步地，所述脐带血有核细胞的分离与冻存包括以下步骤：
17.(1)从医院获取正常分娩的新生儿脐带和脐带血，脐带血的采集用含血液保存液的200ml一次性采血袋；
18.(2)采集的保证无菌的环境和操作，采集前确认新生儿的生物学母亲和生物学父亲供者无传染病风险，包括但不限于以下传染病：乙肝、丙肝、梅毒、hiv，其采集过程中无细菌，真菌，支原体污染；
19.(3)将采集的将脐血混匀后转移到250ml离心瓶内，加入1/4量的6％羟乙基淀粉氯化钠注射液，充分混匀后悬挂于超净台内，放置45min；
20.(4)吸取上层全部富含有核细胞的悬液并取样计数有核细胞数量和活率，于4℃1500rpm/min离心8min，按照计数结果去除多余的离心上清调整细胞悬液体积；
21.(5)调整细胞密度至1*10^6cells/ml，如细胞离心上清的体积不足则补充按照6％羟乙基淀粉氯化钠注射液对应的体积；
22.(6)重悬后的细胞按照细胞悬液：dmso＝9:1的体积比加入dmso后按照每批次生产1.2*10^7cells进行分装至5ml冻存管内；
23.(7)将完成分装的细胞依次置于4℃30min,
‑
20℃2h和
‑
80℃12h完成程序降温，后续的细胞置于气相液氮罐中长期保存。
24.进一步地，所述同一供者的脐带间充质制备与冻存包括以下步骤：
25.(1)取脐带血相同供者新生儿来源无菌条件下采集的足月婴儿脐带 10
‑
20cm,生理盐水冲洗至表面无血液成分残留，去除表面羊膜、两条脐动脉血管和一条脐静脉血管后剪碎，组织块加入含有1％双抗的间充质干细胞无血清完全培养基后加入细胞培养瓶内与37℃、饱和湿度和5％co2环境下培养；
26.(2)所述的间充质干细胞无血清完全培养基为完成配制的stemrd mgro
‑
500mesengro人间充质干细胞无血清培养基；
27.(3)培养的前3周期间每隔5天更换一半新鲜的含有双抗的无血清完全培养基，待细胞融合度达70％
‑
80％时，0.25％的胰蛋白酶消化细胞后用100μm 细胞滤器过滤细胞并用生理盐水刷洗后离心回收细胞；
28.(4)回收的人脐带间充质干细胞重悬于不含双抗的无血清完全培养基加入t175细胞培养瓶中于37℃、饱和湿度和5％co2环境下培养；
29.(5)待每代次细胞融合度达90％时，0.25％的胰蛋白酶消化细胞并用生理盐水刷洗后1100rpm离心5分钟回收细胞，该批次细胞按照1瓶传3瓶的比例悬浮于无血清完全培养基接种于t175后连续扩增1
‑
5代，期间细胞培养于 37℃、饱和湿度、5％co2的环境中；
30.(6)传代扩增至p5代细胞融合度达90％时，0.25％的胰蛋白酶消化细胞并用生理盐水刷洗后1100rpm离心5分钟回收细胞，回收的细胞用dmem重悬计数后1100rpm离心5分钟收集细胞沉淀，按照计数结果调整细胞密度至 1*10^7cells/ml用间充质干细胞冻存液重悬浮；
31.(7)所述的间充质干细胞冻存液配方为dmem基础培养基：胎牛血清： dmso＝6:3:1，重悬后的细胞悬液按照1.2*10^8cells的总数分装于5ml冻存管内；
32.(8)将完成分装的细胞依次置于4℃30min,
‑
20℃2h和
‑
80℃12h完成程序降温，后续的细胞置于气相液氮罐中长期保存。
33.进一步地，所述脐带血有核细胞与脐带间充质干细胞的共培养体外扩增包括以下步骤：
34.(1)分别复苏同一来源供者的脐带血有核细胞和脐带间充质干细胞，将对应的细胞冻存管在37℃水浴融化后，迅速加入到10倍体积的dmem基础培养基稀释并离心1500rpm 5min，去除离心上清后重悬浮于共培养完全培养基；
35.(2)所述的共培养完全培养基配方是以stemrd mgro
‑
500 mesengro人间充质干细胞无血清培养基和gibco aim
‑
v medium cts无血清培养基的按1:2 混合后为基础培养基，添加300ng/ml flt
‑
3l、300ng/ml scf、10ng/ml il
‑
3、 5ng/ml il
‑
7、50iu/ml tnf
‑
α、100ng/ml gm
‑
csf、5ng/ml tpo、100ng/ml il
‑
6、 40ng/ml il
‑
2；
36.(3)共培养接种的初始培养体积为100ml，直接将复苏的脐带血有核细胞与p5代脐带间充质干细胞按照1:10的数量比一同悬浮培育，其中脐带血有核细胞的密度控制为大于1*10^6cells/ml；
37.(4)将细胞注入2l细胞培养袋内培养，培养条件为37℃、饱和湿度、 5％co2的环境中,培养过程中每间隔2天取样计数；
38.(5)完成取样计数后补充新鲜共培养完全培养基至细胞密度略于1*10^6 cells/ml至1.5*10^6cells/ml之间；
39.(6)根据细胞密度最终补充至2l培养基体积后再培养2天，收获所有的细胞悬液按照1500rpm离心5min收集所有细胞并取样计数。
40.进一步地，所述扩增后的脐带血有核细胞nk细胞分选包括以下步骤：
41.(1)将收获的共培养有核细胞用pbs根据计数结果调整细胞密度至 4*10^6cells/ml,缓慢添加到ficoll人外周血淋巴细胞分离液上层，ficoll 的体积与细胞悬液体积比为1:1；
42.(2)进行密度梯度离心，离心条件为300g,20min，20℃,离心加速度和减速度设置为离心机允许的最小值；
43.(3)离心完成后弃去上层清液吸取中间白膜层细胞，回收的细胞悬液使用4倍体积的pbs洗涤混匀后离心，离心条件为1100rpm，5min，室温；
44.(4)收集细胞沉淀用pbs重悬调整细胞密度至1*10^7cells/80ul，按 10^7cells/20ul加入cd3微球。混匀后4℃孵育15min。按照10^7/2ml加入 pbs。1100rpm离心10分装，沉淀重悬至500ul后用automacs过柱分离得到 cd3
‑
细胞；
45.(5)用pbs洗涤细胞3次，用同样的方法加入cd56微球，混匀后4℃孵育15min。按照10^7/2ml加入pbs，1100rpm离心10min，沉淀重悬至500ul 后用automacs过柱分离得到cd3
‑
cd56+细胞。
46.进一步地，所述纯化nk细胞的体外大规模扩增与冻存包括以下步骤：
47.(1)t225培养瓶在接种纯化nk细胞前使用20ml单抗4℃包被24h,所述的单抗为cd25单抗35ng/ml、cd16单抗5ug/ml、cd56单抗5ug/ml溶解于 pbs内，接种纯化的nk细胞前弃去包被液并用pbs刷洗；
48.(2)纯化的nk细胞初始培养体积为50ml，将纯化后的nk细胞控制密度大于2*10^6cells/ml悬浮于gibco aim
‑
v medium cts无血清培养基；
49.(3)完成细胞接种24h后，向培养瓶内补充50ml nk刺激培养基和10ml 20％人血白蛋白；
50.(4)所述的nk细胞激活培养基以gibco aim
‑
v medium cts无血清培养基为基础，加入15ng/ml il
‑
18、20ng/ml il
‑
15、10ng/ml il
‑
7、100iu/ml gm
‑
csf、20ng/ml il
‑
12；
51.(5)细胞培养的第3天，向培养瓶内补充50ml nk刺激培养基和5ml 20％人血白蛋白；
52.(6)细胞培养的第5天，向培养瓶内补充100ml nk刺激培养基和10ml 20％人血白蛋白；
53.(7)细胞培养的第7天，将培养瓶内的所有细胞吹散取样计数后，分装至2l细胞培养袋内并用补充至总体积600ml；
54.(8)所述的nk细胞扩增培养基为gibco aim
‑
v medium cts无血清培养基加入1000iu/ml il
‑
2；
55.(9)纯化nk细胞培养的第9天添加nk细胞扩增培养基至总体积1200ml；
56.(10)纯化nk细胞培养的第11天添加nk细胞扩增培养基至总体积 2000ml；
57.(11)纯化nk细胞培养的第7天、第9天、第11天和第14天分别对细胞悬液进行取样计数，使用nk细胞扩增培养基，补液后的细胞密度控制大于 1.5*10^6cells/ml；
58.(12)补液至2l体积培养3天后，收集所有细胞悬液离心洗涤收获全部的悬浮细胞，收获的细胞计数后1100rpm离心5min；
59.(13)收集细胞沉淀，按照计数结果用nk细胞冻存液重悬调整细胞密度至2.5*10^7cells/ml，并分装于25ml冻存袋内，每袋装有4*10^8cells；
60.(14)所述的nk冻存液体积比为20％人血白蛋白：dmso＝9:1；
61.(15)完成冻存分装的细胞采用thermo程序降温仪进行细胞冻存，后续的细胞置于气相液氮罐中长期保存；
62.(16)制备得到的nk细胞在液氮罐内储存待用于后续的治疗使用；
63.进一步地，所述制备方法可根据生产条件按照相同的比例扩大调整每批次细胞的生产规模。
64.本发明的有益效果：脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源，也是一种非常重要的人类生物资源。应用脐带血为nk细胞来源有以下优势：(1)脐带血中含有的cd34+造血干细胞在体外可以进行诱导和分化大量扩增作为大规模的nk及其前体细胞来源；(2)脐带血来源自新生儿，未接触外部环境，人源病毒和微生物传染风险较低；(3)脐带血作为医疗废弃物，通过各地的脐带血库可以形成稳定的细胞来源；(4)脐带血中的细胞更为原始免疫原性更低，排斥风险更低。
附图说明
65.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
66.图1为本发明脐带血有核细胞与脐带间充质干细胞共培养细胞扩增倍数示意图；
67.图2为本发明纯化的nk细胞经体外扩增的倍数示意图；
具体实施方式
68.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
69.实施例1：脐带血有核细胞与脐带间充质干细胞共培养细胞扩增曲线，按照本发明的具体实施方式，分离培养5株来自不同新生儿供者的脐带血有核细胞和脐带间充质干细胞至p5代，细胞完成制备后暂时冻存于液氮罐内。根据本发明的技术方案，每批次37℃水浴复苏脐带血有核细胞 1.2*10^7cells和p5代脐带间充质干细胞1.2*10^8cells。根据细胞计数结果接种于100ml共培养完全培养基内，接种的密度为脐带血有核细胞 1.0*10^6cells/ml和p5代脐带间充质干细胞1.0*10^7cells/ml。后续培养于2l细胞培养袋内培养，培养条件为37℃、饱和湿度、5％co2的环境中,培养过程中每间隔2天取样计数。完成取样计数后补充新鲜共培养完全培养基至细胞密度略于1*10^6cells/ml至1.5*10^6cells/ml之
间。根据细胞密度最终补充至2l培养基体积后再培养2天，收获所有的细胞悬液按照1500rpm离心5min收集所有细胞并取样计数。
70.结果：该5组共培养的细胞，根据每次的细胞计数结果，可以计算得到细胞的扩增倍数如图1
71.结论：脐带血有核细胞与脐带间充质干细胞共培养，培养袋的内的细胞进行了大量的扩增。
72.实施例2：脐带血有核细胞与脐带间充质干细胞共培养后集落分化统计，将5组分离获得的脐带血有核细胞与实施例一中经共培养扩增获得的有核细胞回收洗涤后用dmem洗涤调整细胞密度为1*10^6cells/ml，取100ul 与900ul stemcell methocult人造血干细胞甲基纤维素培养基混匀后接种于24孔板内，每组3个复孔。24孔板于37℃、饱和湿度和5％co2环境下培养14至16天，进行克隆计数。
73.结果：经过16天的培养，显微镜下计数24孔板内的造血细胞集落数统计如下：
[0074][0075][0076]
表1脐带血有核细胞与脐带间充质干细胞共培养后集落分化统计
[0077]
结论：经过与脐带间充质干细胞共培养后，脐带血有核细胞的增殖能力和分化能力有极大的增强。
[0078]
实施例3：脐带血有核细胞cd3
‑
cd56+分选后流式细胞表型统计，按照本发明实施例一获得的有核细胞根据本发明的技术方案进行cd3
‑
cd56+ macs磁珠分选，利用流式细胞术检测后，分别统计分选前和分选后的nk 细胞表型cd3
‑
cd16+cd56+的细胞纯度。
[0079] 分选前分选后组别120.45％98.77％组别219.56％97.53％组别315.34％94.35％组别412.56％97.12％组别514.37％96.51％
[0080]
表:2为macs cd3
‑
cd56+分选前后的nk细胞纯度对比
[0081]
结论：macs磁珠分选能够有效的纯化nk细胞及其前体细胞。
[0082]
实施例4：nk细胞体外大规模扩增增殖曲线，将实施例三中获得的纯化nk细胞按照本发明的技术方案接种于已经包被的t225培养瓶内，接种的第二天添加细胞因子刺激。后续根据细胞的生长情况和密度进行补液至 2l体积，培养3天后计数收获细胞。
[0083]
结果：该5组共培养的细胞，根据每次的细胞计数结果，可以计算得到细胞的扩增倍数如图2。
[0084]
结论：脐带血来源的有核细胞经过与脐带间充质干细胞共培养体外扩增后，可用多种细胞因子刺激在体外大规模扩增。
[0085]
实施例5：nk细胞体外大规模扩增后流式表型统计，回收实施例四制备的nk细胞，利用流式细胞术检测后，分别统计不同组的nk细胞纯度。
[0086] 分选前组别198.85％组别295.53％组别396.22％组别499％组别596.82％
[0087]
表3为经体外扩增的脐带血来源nk细胞的纯度
[0088]
结论：本发明所述的工艺能够在体外制备高纯度的nk细胞。
[0089]
实施例6：制备得到的nk细胞杀伤能力检测，取传代细胞株k562细胞进行计数，制成1
×
10^5cells/ml细胞悬液，加入96孔板，每孔50μl。将实施例四根据本发明技术方案培养的将培养的nk细胞分别按照效：靶为 1:1、10:1、20:1、40:1加入96孔板中，同时设效应细胞和靶细胞自然释放孔，培养基自然释放孔，靶细胞最大释放孔，体积矫正对照，每孔体积100 μl，均设3个复孔，250g离心4min，置于37℃，5％co2、95％饱和湿度的培养箱中孵育4h。总计检测5组nk细胞的杀伤能力。.在反应结束前45min 靶细胞最大释放孔每孔加入10μl裂解液。反应结束后，每孔吸取50μl上清和50μl ldh酶反应液置于另一新的96孔板，室温避光反应30min，加入反应终止液50μl，酶标仪测其od值。计算自然杀伤活性。公式为：自然杀伤活性％＝(测定管od值
‑
靶细胞自然释放管od值
‑
效应细胞自然释放管od值)/(靶细胞最大释放管od值
‑
靶细胞自然释放管od值)
×
100％。
[0090]
结果：
[0091]
效靶比1:110:120:140:1组别115.37％47.56％61.33％91.21％组别211.49％48.40％59.72％85.45％组别318.14％41.78％69.84％87.49％组别410.07％39.84％62.48％89.32％组别59.98％45.58％70.80％92.75％
[0092]
表4为各组不同供者来源的脐带血nk细胞体外杀伤能力
[0093]
结论：根据本发明的技术方案能够制备具有对k562癌症细胞株有杀伤作用的nk细胞，可以用作后续癌症细胞治疗。
[0094]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或
基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0095]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。