一种DNA重亚硫酸盐转化及纯化的方法与流程

本发明属于核酸甲基化转化及纯化技术领域，具体涉及一种dna重亚硫酸盐转化及纯化的方法。

背景技术：

表观遗传学是近几年众多生物学研究中发展最为迅速的一门科学，是经典遗传学的补充和进一步的发展。dna甲基化(dnamethylation)是一种重要的表观遗传学修饰，与动植物许多生命过程如生长、发育和分化相关。dna甲基化是指dna在甲基化转移酶(dnmt)催化下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至dna链中特定碱基上的化学修饰过程。dna甲基化一般发生在cpg位点。目前研究dna甲基化的方法有很多种，但是都需要经过dna重亚硫酸盐转化后，再运用各种检测手段进行相关研究。dna在重亚硫酸盐转化过程中会使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不会被转化。因此，可以结合ngs、msp、hrm等方法来检测分析dna序列哪些位点发生甲基化。重亚硫酸盐处理dna的转化效率、回收率、模板质量等直接影响检测效果。

传统的亚硫酸盐转化方法为保证dna的完整性，转化条件较为温和，所需时间较长(需要20个小时左右)。随着技术的改进，目前商品化的亚硫酸盐转化试剂盒可实现dna的快速转化，有效缩短了转化的时间，但是显著提高了dna片段化和降解水平，导致长片段的甲基化位点检测率下降，限制了对基因甲基化水平的研究和检测的应用，因此迫切需要能够高效、快速实现dna亚硫酸盐转化及纯化的方法。

技术实现要素：

鉴于此，有必要提供一种能够高效、快速实现dna重亚硫酸盐转化及纯化的方法。

为解决上述问题，本发明采用下述技术方案：

一种dna重亚硫酸盐转化及纯化的方法，包括下述步骤：

在第一离心管中加入20uldna溶液和20ul变性液，于42℃混匀瞬离10min；

在所述第一离心管中加入160ul转化试剂，并于75℃下保温1hour，再冷却至20℃，得到转化产物；

在容量为1.5ml的第二离心管中加入500ul的结合液，再加入200ul所述转化产物，涡旋振荡15s后瞬离，得到混合溶液；

将所述混合液转移至dna纯化柱中，6000g离心1min；

弃滤液，将制备管置回到所述第一离心管中，加入500ul纯化漂洗液a，12000g离心1min；

弃滤液，将所述制备管置回到所述第一离心管中，加入500ul纯化漂洗液b，室温放置15min后，12000g离心1min；

弃滤液，将所述制备管置回到所述第一离心管中，加入500ul纯化漂洗液a，12000g离心1min；

弃滤液，将所述制备管置回到所述第二离心管中，12000g离心2min；

将dna制备管置于容量为1.5ml的第三离心管中，于56℃金属浴干燥5min；

在所述制备管的膜中央加入20ul洗脱液，室温静置2min，12000g离心2min，标记好洗脱dna备用；

进行qpcr检测rassf1基因甲基化情况。

在其中一些实施例中，所述dna溶液由rt4细胞提取。

在其中一些实施例中，所述变性液为0.1～1m的naoh溶液。

在其中一些实施例中，所述转化试剂为重亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氨、亚硫酸氢铵、亚硫酸氢镁中至少一种。

在其中一些实施例中，所述的结合液为1～8m的盐酸胍、10mm～50mm的磷酸氢二钠、100mm～500mm的磷酸二氢钠、0.1～0.5％(v/v)的冰醋酸中的任意一种。

在其中一些实施例中，所述的漂洗液a为tris、乙醇和水组成，其中，tris浓度为10mm，乙醇的浓度为(体积分数)80％。

在其中一些实施例中，所述的漂洗液b由氢氧化钠、乙醇和水组成，其中：氢氧化钠的浓度为0.5mol/l，乙醇的浓度为(体积分数)80％。

在其中一些实施例中，所述的洗脱液为：tris和edta组成，其中，tris的浓度为10mm，edta的浓度为1mm。

相较于现有技术，本申请提供的dna重亚硫酸盐转化及纯化的方法，该方法能在恒温的条件下、在40～60分钟内，快速实现dna的重亚硫酸盐转化，无需添加dna保护剂。另外采用柱膜法对转化的dna进行纯化，能够得到高转化率、高质量及高纯度的dna，用于后续分子生物学研究，尤其是临床分子诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1本发明实施例和qiagen商品化试剂盒来转化及纯化rt4细胞dna的实时荧光pcr检测图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

本实施例提供的dna重亚硫酸盐转化及纯化的方法，包括下述步骤：

步骤s110：在第一离心管中加入20uldna溶液和20ul变性液，于42℃混匀瞬离10min。

具体地，dna溶液由rt4细胞提取。

进一步地，所述变性液为0.1～1m的naoh溶液。步骤s120：在所述第一离心管中加入160ul转化试剂，并于75℃下保温1hour，再冷却至20℃，得到转化产物。

进一步地，所述转化试剂为重亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氨、亚硫酸氢铵、亚硫酸氢镁中至少一种。

步骤s130：在容量为1.5ml的第二离心管中加入500ul的结合液，再加入200ul所述转化产物，涡旋振荡15s后瞬离，得到混合溶液。

进一步地，所述的结合液为1～8m的盐酸胍、10mm～50mm的磷酸氢二钠、100mm～500mm的磷酸二氢钠、0.1～0.5％(v/v)的冰醋酸中的任意一种。步骤s140：将所述混合液转移至dna纯化柱中，6000g离心1min。步骤s150：弃滤液，将制备管置回到所述第一离心管中，加入500ul纯化漂洗液a，12000g离心1min。

进一步地，所述的漂洗液a为tris、乙醇和水组成，其中，tris浓度为10mm，乙醇的浓度为(体积分数)80％。步骤s160：弃滤液，将所述制备管置回到所述第一离心管中，加入500ul纯化漂洗液b，室温放置15min后，12000g离心1min。

进一步地，所述的漂洗液b由氢氧化钠、乙醇和水组成，其中：氢氧化钠的浓度为0.5mol/l，乙醇的浓度为(体积分数)80％。步骤s170：弃滤液，将所述制备管置回到所述第一离心管中，加入500ul纯化漂洗液a，12000g离心1min。

步骤s180：弃滤液，将所述制备管置回到所述第二离心管中，12000g离心2min。

步骤s190：将dna制备管置于容量为1.5ml的第三离心管中，于56℃金属浴干燥5min。

步骤s210：在所述制备管的膜中央加入20ul洗脱液，室温静置2min，12000g离心2min，标记好洗脱dna备用。

进一步地，所述的洗脱液为：tris和edta组成，其中，tris的浓度为10mm，edta的浓度为1mm。

步骤s220：进行qpcr检测rassf1基因甲基化情况。

请参阅图1，为本发明上述实施例和和qiagen商品化试剂盒来转化及纯化rt4细胞dna的实时荧光pcr检测图，从图1中可以看出dna纯度较高。

本申请提供的dna重亚硫酸盐转化及纯化的方法，该方法能在恒温的条件下、在40～60分钟内，快速实现dna的重亚硫酸盐转化，无需添加dna保护剂。另外采用柱膜法对转化的dna进行纯化，能够得到高转化率、高质量及高纯度的dna，用于后续分子生物学研究，尤其是临床分子诊断。

此外，本发明提供的dna重亚硫酸盐转化及纯化的方法，转化时间短，仪器设备简单，不需要价格昂贵的pcr仪，可用恒温金属浴进行相关的转化实验、操作简便。

另外，本发明提供的dna重亚硫酸盐转化及纯化的方法，整个纯化过程不需要carrierrna，且能在常温条件进行纯化操作，无需任何高温孵育，具有操作简便，高转化效率和高纯度的特点。

以上仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。