一种同步制备禽血血红素与抗氧化血肽的方法与流程

本发明涉及一种禽血血红素与抗氧化血肽的制备方法，尤其涉及冻融、高能电子束破坏血红蛋白分子提高酶解效果以及两种蛋白酶分步酶解同步制备血红素与血肽的方法。

背景技术：

禽血中含有丰富的血浆蛋白与血红蛋白，是一种优质蛋白质资源。血红素与珠蛋白通过四键相结合构成血红蛋白，其中两个是血红素上两个丙酸基与珠蛋白的结合键，另两个是通过铁与珠蛋白中组氨咪唑环的氮环或配位键结合。血红素提取制备主要采用冰醋酸法、酸性丙酮法，当ph值时低于3.5时，二价铁离子与组氨酸配位键离解，导致血红素分子断开，这是酸性试剂分离血红素的原理，但存在有机物污染的风险。应用蛋白酶酶解提取分离血红素，具有效果高、反应条件温和、环境影响小等优点。采用超声波、均质等方法破坏血红细胞形态，使血红素更加彻底地分离，提高血红素得率，然而这些方法不适合大批量的动物血液处理。通过酶解食源性蛋白质获得的多肽，可以具备与天然或合成类抗氧化剂同样甚至更好的抗氧化活性。研究表明，活性肽具备抑制脂质过氧化、螯合金属离子、清除活性氧能力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种同步制备禽血血红素与抗氧化血肽的方法，该方法显著提高血红素含量，同时获得的血肽相对分子质量主要分布在1000da以下，占比达到96.56％，具有抗氧化性。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种同步制备禽血血红素与抗氧化血肽的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)抗凝：家禽屠宰过程中收集禽血(收集的新鲜血液，禽血包括鸡血、鸭血或鹅血等)，禽血中添加edta-2na(乙二胺四乙酸二钠)，edta-2na的加入量为禽血质量的1-3‰(w/w)，搅拌均匀防止血液凝固；

2)离心：离心转速4000-5000rpm，离心10-20min，沉淀物即为禽血血红蛋白；

3)冻融：禽血血红蛋白于-18℃至-80℃条件下冷冻(冷冻时间0.5-6小时)，后于4-10℃条件下解冻(解冻时间12-36小时)，如此冻融1-3次；得到冻融后的血红蛋白；

4)辐照：冻融后的血红蛋白采用高能直线电子加速器(10mev，20kw)辐照，辐照剂量为10-30kgy，辐照温度为4-10℃，得到辐照后血红蛋白；

5)酶解：辐照后血红蛋白的质量浓度为3-5％(w/w)，辐照后血红蛋白中添加hcl溶液调整ph值至2.5-4.0，添加酸性蛋白酶(酶活≥50units/mg)，酸性蛋白酶的质量浓度1.0-2.0％(w/w)，酶解温度50-55℃，酶解2-4h；添加naoh溶液调整酶解液ph值6.5-7.5，添加中性蛋白酶(酶活≥100units/mg)，中性蛋白酶的质量浓度0.5-1.5％(w/w)，酶解1-3h，升温至70-80℃，保持30-60min灭酶；

6)离心：转速6000-8000rpm，离心20-30min，收集沉淀物与水解液，即分别为禽血血红素与抗氧化血肽。

分析：以氯化血红素(质量纯度>99.99％)为标准品，经液相质谱联用仪分析(lc-30ad、qtrap4500)，本发明的禽血血红素样品(即血红素)与氯化血红素保留时间一致，本发明的禽血血红素浓度为72.53％-78.64％；以细胞色素c(mw12384)、抑肽酶(mw6500)、杆菌酶(mw1450)、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(mw451)、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(mw189)为标准品，经高效液相色谱分析(waters1525)，本发明的抗氧化血肽(即血肽)相对分子质量主要分布在1000da以下，占比为93.42-96.56％；本发明的抗氧化血肽样品abts+自由基、dpph自由基清除率分别为70.28-85.63％、45.20-54.83％，表明血肽具有显著的抗氧化性。

所述的家禽为鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、孔雀或天鹅等人工豢养的鸟类动物。

冻融即冷冻-解冻过程，在冻融期间，冰晶的形成与生长会导致生物细胞破裂，从而有利于提高酶解效果。辐照技术是通过高能射线或水辐解产生的活性自由基作用于生物分子，使生物分子发生降解、交联和分子构象的改变。以禽血血红蛋白为目标物，结合冻融破坏作用与高剂量辐照降解效应，通过酸性蛋白酶、中性蛋白酶二次酶解过程，提高血红素含量，同时获得低分子血肽，这是本发明的创新点。

本发明的有益效果是：本发明以禽血为原料同步制备禽血血红素与抗氧化血肽，在酶解前采用冻融、辐照破坏血红蛋白细胞，有利于提高酶解效果，提高血红素含量，同时获得低分子血肽。该方法显著提高血红素含量，同时获得的血肽相对分子质量主要分布在1000da以下，占比达到96.56％，具有抗氧化性。

附图说明

图1是本发明水解度随血红蛋白浓度变化趋势图。

图2是本发明水解度随蛋白酶浓度变化趋势图。

图3是本发明水解度随酶解时间变化趋势图。

图4是本发明血红素含量随冻融次数变化趋势图。

图5是本发明血红素含量随辐照剂量变化趋势图。

图6是本发明血红素色谱图；图中，a:血红素标准品-氯化血红素；b:血红素样品。

图7是本发明血肽高效液相色谱图。

图8是本发明血肽抗氧化活性分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

一种同步制备禽血血红素与抗氧化血肽的方法，包括如下步骤：

1)抗凝：家禽(如鸡)屠宰过程中收集禽血(收集的新鲜血液，鸡血)，禽血中添加edta-2na(乙二胺四乙酸二钠)，edta-2na的加入量为禽血1‰(w/w)，搅拌均匀防止血液凝固；

2)离心：离心转速4000rpm，离心10min，沉淀物即为禽血血红蛋白；

3)冻融：禽血血红蛋白于-80℃条件下冷冻(冷冻时间0.5-6小时)，后于4-10℃条件下解冻(解冻时间12-36小时)，如此冻融1次；得到冻融后的血红蛋白；

4)辐照：冻融后的血红蛋白采用高能直线电子加速器(10mev，20kw)辐照，辐照剂量为10kgy，辐照温度为4℃，得到辐照后血红蛋白；

5)酶解：辐照后血红蛋白的质量浓度为3％(w/w)，辐照后血红蛋白中添加hcl溶液调整ph值至2.5，添加酸性蛋白酶(酶活≥50units/mg)，酸性蛋白酶的质量浓度1.0％(w/w)，酶解温度50℃，酶解2h；添加naoh溶液调整酶解液ph值6.5，添加中性蛋白酶(酶活≥100units/mg)，中性蛋白酶的质量浓度0.5％(w/w)，酶解1h，升温至70℃，保持30min灭酶；

6)离心：转速6000rpm，离心20min，收集沉淀物与水解液，即分别为禽血血红素与抗氧化血肽。

分析：以氯化血红素(纯度>99.99％)为标准品，经液相质谱联用仪分析(lc-30ad、qtrap4500)，本发明的禽血血红素样品(即血红素)与氯化血红素保留时间一致，本发明的禽血血红素浓度为72.53％-78.64％；以细胞色素c(mw12384)、抑肽酶(mw6500)、杆菌酶(mw1450)、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(mw451)、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(mw189)为标准品，经高效液相色谱分析(waters1525)，本发明的抗氧化血肽(即血肽)相对分子质量主要分布在1000da以下，占比为93.42-96.56％；本发明的抗氧化血肽样品abts+自由基、dpph自由基清除率分别为70.28-85.63％、45.20-54.83％，表明血肽具有显著的抗氧化性。

实施例2：

一种同步制备禽血血红素与抗氧化血肽的方法，包括如下步骤：

1)抗凝：家禽(如鸭)屠宰过程中收集禽血(收集的新鲜血液，鸭血)，禽血中添加edta-2na(乙二胺四乙酸二钠)，edta-2na的加入量为禽血2‰(w/w)，搅拌均匀防止血液凝固；

2)离心：离心转速4500rpm，离心15min，沉淀物即为禽血血红蛋白；

3)冻融：禽血血红蛋白于-30℃条件下冷冻(冷冻时间0.5-6小时)，后于4-10℃条件下解冻(解冻时间12-36小时)，如此冻融2次；得到冻融后的血红蛋白；

4)辐照：冻融后的血红蛋白采用高能直线电子加速器(10mev，20kw)辐照，辐照剂量为20kgy，辐照温度为7℃，得到辐照后血红蛋白；

5)酶解：辐照后血红蛋白的质量浓度为4％(w/w)，辐照后血红蛋白中添加hcl溶液调整ph值至3.0，添加酸性蛋白酶(酶活≥50units/mg)，酸性蛋白酶的质量浓度1.5％(w/w)，酶解温度52℃，酶解3h；添加naoh溶液调整酶解液ph值7.0，添加中性蛋白酶(酶活≥100units/mg)，中性蛋白酶的质量浓度1.0％(w/w)，酶解2h，升温至75℃，保持70min灭酶；

6)离心：转速7000rpm，离心25min，收集沉淀物与水解液，即分别为禽血血红素与抗氧化血肽。

分析：以氯化血红素(纯度>99.99％)为标准品，经液相质谱联用仪分析(lc-30ad、qtrap4500)，本发明的禽血血红素样品(即血红素)与氯化血红素保留时间一致，本发明的禽血血红素浓度为72.53％-78.64％；以细胞色素c(mw12384)、抑肽酶(mw6500)、杆菌酶(mw1450)、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(mw451)、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(mw189)为标准品，经高效液相色谱分析(waters1525)，本发明的抗氧化血肽(即血肽)相对分子质量主要分布在1000da以下，占比为93.42-96.56％；本发明的抗氧化血肽样品abts+自由基、dpph自由基清除率分别为70.28-85.63％、45.20-54.83％，表明血肽具有显著的抗氧化性。

实施例3：

一种同步制备禽血血红素与抗氧化血肽的方法，包括如下步骤：

1)抗凝：家禽(如：鹅)屠宰过程中收集禽血(收集的新鲜血液，鹅血)，禽血中添加edta-2na(乙二胺四乙酸二钠)，edta-2na的加入量为禽血3‰(w/w)，搅拌均匀防止血液凝固；

2)离心：离心转速5000rpm，离心20min，沉淀物即为禽血血红蛋白；

3)冻融：禽血血红蛋白于-18℃条件下冷冻(冷冻时间0.5-6小时)，后于4-10℃条件下解冻(解冻时间12-36小时)，如此冻融3次；得到冻融后的血红蛋白；

4)辐照：冻融后的血红蛋白采用高能直线电子加速器(10mev，20kw)辐照，辐照剂量为30kgy，辐照温度为10℃，得到辐照后血红蛋白；

5)酶解：辐照后血红蛋白的质量浓度为5％(w/w)，辐照后血红蛋白中添加hcl溶液调整ph值至4.0，添加酸性蛋白酶(酶活≥50units/mg)，酸性蛋白酶的质量浓度2.0％(w/w)，酶解温度55℃，酶解4h；添加naoh溶液调整酶解液ph值7.5，添加中性蛋白酶(酶活≥100units/mg)，中性蛋白酶的质量浓度1.5％(w/w)，酶解3h，升温至80℃，保持60min灭酶；

6)离心：转速8000rpm，离心30min，收集沉淀物与水解液，即分别为禽血血红素与抗氧化血肽。

分析：以氯化血红素(质量纯度>99.99％)为标准品，经液相质谱联用仪分析(lc-30ad、qtrap4500)，本发明的禽血血红素样品(即血红素)与氯化血红素保留时间一致，本发明的禽血血红素的质量浓度为72.53％-78.64％；以细胞色素c(mw12384)、抑肽酶(mw6500)、杆菌酶(mw1450)、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(mw451)、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(mw189)为标准品，经高效液相色谱分析(waters1525)，本发明的抗氧化血肽(即血肽)相对分子质量主要分布在1000da以下，占比为93.42-96.56％；本发明的抗氧化血肽样品abts+自由基、dpph自由基清除率分别为70.28-85.63％、45.20-54.83％，表明血肽具有显著的抗氧化性。

表1血红素标准品与血红素样品峰面积

表2血肽相对分子质量分布

图1、图2、图3表明血红蛋白水解度随血红蛋白浓度、蛋白酶浓度、酶解时间增加呈上升趋势，水解度增加表明酶解沉淀物中血红素含量增加以及酶解液中小分子肽含量增多。

图4表明冻融次数可以提高血红素含量。

图5表明辐照剂量10-30kgy可以显著提高血红素含量。

图6色谱图表明本专利制备的血红素、血红素标准品保留时间分别为6.68min，6.70min，保留时间相一致，由此可以判定样品中血红素以氯化血红素形式存在。根据血红素标准品、血红素产品质量浓度与峰面积(表1)分析计算，确定样品中血红素含量为72.53-78.64％。

图7血肽高效液相色谱图、相对分子质量分布(表2)表明本发明制备的血肽样品相对分子质量主要分布在1000da以下，500-1000da的肽含量为23.97％，180-500da的肽含量为66.07％，低于180da的肽含量为6.52％，合计占比96.56％。

图8表明血肽抗氧化活性分析血肽样品{样品1(实施例1)、样品2(实施例2)、样品3(实施例3)，抗氧化血肽的质量浓度为3mg/ml}abts+自由基、dpph自由基清除率分别为70.28％、78.54％、85.63％与45.20％、47.45％、54.83％，说明本发明制备的血肽具有显著的抗氧化活性。

本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。