PCP4作为神经母细胞瘤的肿瘤分化标志物的应用

pcp4作为神经母细胞瘤的肿瘤分化标志物的应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤分子检测技术领域，涉及一种神经母细胞瘤相关的肿瘤细胞标志物及其应用。本发明公开了一种神经母细胞瘤分化程度相关的肿瘤细胞标志物pcp4，pcp4的表达水平随神经母细胞瘤肿瘤细胞分化程度增高而升高，可进一步制备用于神经母细胞瘤的诊断试剂盒。


背景技术：

2.现有技术公开了小儿肿瘤是威胁儿童健康的重要问题，目前已成为了继外伤之后导致儿童死亡的第二大原因，其中，神经母细胞瘤(neuroblastoma，nb) 是小儿最常见的腹部恶性肿瘤，占所有儿童肿瘤的8～10％，占婴儿总癌症发病率的28％，为婴儿阶段发病率最高的恶性肿瘤，位居迄今为止治疗最为棘手的小儿常见恶性实体肿瘤之首。
3.研究显示，神经母细胞瘤具有高度的临床异质性，低危组患者通过手术切除甚至是仅通过观察便能获益；中危组患者通过手术切除及中剂量化疗也能得到良好的预后；然而，高位组患者则具有较大的临床异质性，目前尚缺乏特异性敏感性的标志物进行识别；此外，nb具有独特的细胞分化特点，既往文献报道nb具有瘤内异质性和不同分化程度，分化越低，恶性程度越高。
4.pcp4(gene id:5121)，是一种钙调蛋白调节蛋白，够通过iq模体与钙调蛋白(cam)的c域结合，并通过酸性序列调节其ca
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结合特性，从而调控cam信号通路及其广泛的下游靶标。有文献报道pcp4在神经元分化中起着正向调控作用，具有促进神经元细胞分化的功能。在肿瘤方面，有研究报道pcp4是与肿瘤生长呈负相关的细胞因子，在多种肿瘤中表达呈下降趋势，包括前列腺癌、膀胱癌及甲状腺肿瘤等。然而目前虽然已有文献报道cam通路与nb肿瘤细胞的分化相关，但关于pcp4在nb中的研究尚无报道。
5.基于现有技术的现状，本技术的发明人拟提供一种神经母细胞瘤相关的肿瘤细胞标志物及其应用，尤其是神经母细胞瘤分化程度相关的肿瘤细胞标志物pcp4，pcp4的表达水平随神经母细胞瘤肿瘤细胞分化程度增高而升高，可进一步制备用于神经母细胞瘤的诊断试剂盒。


技术实现要素：

6.本发明的目的是基于现有技术的现状，提出一种新的神经母细胞瘤相关肿瘤标志物，所述肿瘤标志物为pcp4，其可作为评估nb肿瘤细胞分化程度的肿瘤标志物。
7.本发明的第二个目的是提供上述组织肿瘤标志物的抗体。
8.本发明的第三个目的是提供上述组织肿瘤标记物的抗体在神经母细胞瘤中的应用。
9.本发明的进一步目的在于提供一种检测神经母细胞瘤的试剂盒。
10.在发明人前期的研究中发现pcp4的表达水平随神经母细胞瘤肿瘤细胞分化程度增高而升高，有望成为评估nb肿瘤细胞分化程度的肿瘤标志物。因此，探究pcp4检测在nb临
床诊断及预后评估中的应用显得尤为重要。
11.本发明提供了一种与神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物，该标志物为 pcp4，可进一步用于制备神经母细胞瘤诊断试剂盒。
12.本发明提供了pcp4在制备诊断或者治疗神经母细胞瘤的药剂中的应用。
13.较好的，pcp4是神经母细胞瘤分化程度的诊断标志物。
14.或者，pcp4是筛选治疗神经母细胞瘤药物的标志物。
15.所述的治疗神经母细胞瘤药物是抑制pcp4表达水平增加的物质。
16.本发明提供了一种用于神经母细胞瘤的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有 pcp4检测试剂。
17.所述的诊断试剂盒用于辅助判断神经母细胞瘤的分化程度；所述的pcp4 检测试剂是识别或者定量pcp4核酸或者蛋白的物质。
18.本发明提供了一种检测pcp4的方法，包括以下步骤：
19.获得待检测神经母细胞瘤肿瘤组织样本；
20.分离提取待检测神经母细胞瘤肿瘤组织样本的核酸或者蛋白成分；
21.使用上述的诊断试剂盒定量或者定性pcp4。
22.较好的，使用pcp4抗体检测免疫组化染色nb组织样本。
23.更具体的，本发明以标准操作程序(sop)采集符合标准的组织样本，系统收集完整的临床资料等，采用免疫组化染色方法进行验证。
24.本发明的实验方法主要包括以下几个部分：
25.研究样本的选择：
26.(1)经病理学明确诊断的神经母细胞瘤病例；
27.(2)经2个以上病理医生确认过后分为分化组及未分化/低分化组；
28.(3)患者神经母细胞瘤肿瘤组织样本收集；
29.利用pcp4抗体，免疫组化染色nb组织样本：
30.(1)准备神经母细胞瘤肿瘤组织切片；
31.(2)脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100％酒精-100％酒精-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,格局气温调整放置时间，如，天气热可减少放置时间,相反,天气较冷,则适当延长脱蜡时间,一般为 12-15min；
32.(3)抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3％h2o2浸泡10min，除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉h2o2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min(中火)，沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来；
33.(4)血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于pbs中5min，洗2次，擦干组织周围的pbs液，即加血清，使非特异性的位点封闭，然后放入37℃温箱中半小时，血清稀释10倍(900μlpbs： 100μl血清封闭液)；
34.(5)加一抗(pcp4抗体)：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗后于4℃冰箱中保存过夜；
35.(6)加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入pbs中洗3次，每次5min，擦干组织周围的
pbs后加上二抗,然后置于37℃温箱中半小时；
36.(7)加sabc:将片子从温箱中取出,放入pbs中洗3次，每次5min，擦干组织周围的pbs后加上sabc,然后置于37℃温箱中半小时。sabc稀释100 倍(990μlpbs：10μlsabc)；
37.(8)加显色剂：从温箱中取出片子,放入pbs中洗3次，每次5min，擦干组织周围的pbs后加上显色剂，(显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂 a，摇匀，然后加1滴显色剂b，摇匀，再加1滴显色剂c，摇匀)a：dab b： h2o2 c：磷酸缓冲液；
38.(9)复染：清水冲洗显色后的片子后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min；
39.(10)脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-100％酒精-100％酒精-二甲苯-二甲苯，每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，置通风柜中；
40.(11)封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，放平一侧后，放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
41.利用h-score评分系统进行统计分析：
42.镜下观察免疫组化染色切片，并统计细胞染色情况。强度表达按阳性细胞着色强度由弱至强分别记分，细胞核无黄色颗粒样沉淀为0分、淡黄色为1 分、棕黄色为2分、深棕黄色为3分；显微镜下记网格内完整上皮细胞总数及阳性细胞数。h-score＝强度
×
阳性细胞/上皮细胞总数
×
100％。使用wilcoxon 秩和检验对h-score评分进行统计学分析。
43.本发明提供了一种肿瘤细胞标志物pcp4作为神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物的应用。实验表明，pcp4的表达水平随神经母细胞瘤肿瘤细胞分化程度增高而升高，可以作为一种用于神经母细胞瘤的诊断试剂盒。本发明的 pcp4作为神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物，能够准确获知pcp4的表达量，可以辅助判断神经母细胞瘤分化程度。本发明首次公布了nb相关肿瘤标志物 pcp4具有作为诊断检测及预后评估的潜在价值，具有深远的临床意义和应用前景。
附图说明
44.图1为神经母细胞瘤肿瘤组织pcp4免疫组化染色结果示意图，其中左图为分化组肿瘤组织切片，右图为未分化/低分化组肿瘤组织切片。
45.图2为两组神经母细胞瘤pcp4免疫组化染色的h-score评分箱线图，其中 un：未分化，pdn：低分化，dn：分化。p-value《0.01。
46.图3显示了pcp4的表达情况与肿瘤细胞的分化程度以及增殖能力相关。
47.图4显示了pcp4高表达的患儿比pcp4低表达的患儿具有更好的预后(p＝ 0.019)。
48.图5，免疫荧光染色显示pcp4表达情况与细胞增殖能力的关系，
49.其中显示了pcp4的表达情况随细胞增殖能力升高(表达mki67)而降低。
50.图6，通过细胞增殖实验结果显示，pcp4表达的下调能增强nb肿瘤细胞系增殖能力。
具体实施方式
51.实施例1：基于单细胞测序数据探索pcp4与神经母细胞瘤分化程度的关系
52.1)利用单细胞转录组测序技术，对nb肿瘤组织进行测序，并绘制肿瘤图谱；
53.2)通过对肿瘤细胞进行拟时序分析，将肿瘤分为分化程度较低组(root cells)和分化程度较高组(end cells)两种类型；
54.3)通过mrna表达情况探索，从中发现mki67表达于分化程度较低的细胞类型中，表明这群细胞增殖能力的升高；而pcp4则表达于分化程度较高的细胞中，说明pcp4的表达情况与肿瘤细胞的分化程度以及增殖能力相关。
55.实施例2：基于geo数据库中的mrna数据进行神经母细胞瘤的生存分析
56.1)通过geo数据库，下载数据集gse49710中的498个nb患者的mrna表达情况；
57.2)通过pcp4 mrna表达情况将492个患者(6例缺失pcp4表达数据)分为高表达组及低表达组，并结合生存数据进行生存分析；
58.3)结果显示pcp4高表达的患儿比pcp4低表达的患儿相比具有更好的预后 (p＝0.019)
59.实施例3:免疫荧光染色显示pcp4表达情况与细胞增殖能力的关系
60.通过对肿瘤组织的免疫荧光染色显示，pcp4与mki67表达互斥，表明pcp4 的表达情况随细胞增殖能力升高(表达mki67)而降低。
61.实施例4:pcp4基因对nb肿瘤细胞系的影响探索
62.利用慢病毒转染shrna技术，构建pcp4表达敲低的sk-n-be2c细胞系以及导入空载质粒的对照组sk-n-be2c细胞系，通过细胞增殖实验，结果显示，pcp4 表达的下调能够增强nb肿瘤细胞系增殖能力。
63.以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。