一种基于滚环扩增的外泌体内多种miRNA同时扩增检测的方法与流程

一种基于滚环扩增的外泌体内多种mirna同时扩增检测的方法
技术领域
[0001]
本发明涉及microrna检测的技术领域，尤其涉及一种基于滚环扩增的外泌体内多种mirna同时扩增检测的方法。


背景技术：

[0002]
外泌体是细胞分泌的一系列与细胞膜成分近似的囊泡，尺寸约为30-150纳米。由于外泌体含有细胞的部分信息，在细胞间通信、生物活性调节等方面起着至关重要的作用，尤其是在肿瘤的形成和发展中扮演着关键的角色，所以对外泌体的研究吸引了肿瘤标志物研究者们大量的注意力。而在外泌体的研究中，主要的一个方向是对其内含物的研究。microrna(mirna)作为癌症相关的很多生理过程中一种重要的调节因子被人们发现以来，大量的证据指出mirna是癌症诊断、治疗的有效的标志物。而由于mirna链非常短，在尺寸有限的外泌体中含量又少，故传统检测方法很难达到理想的精度。所以针对外泌体内的各种mirna的提取与检测成为一个难题，急需一种方便快捷，灵敏度高的检测方法。提高探针灵敏度降低检测限固然是一种思路，而将mirna提取后先扩增提高待测物的量再进行检测也是一种解决方案。
[0003]
作为传统的核酸扩增技术pcr的替代方法，rca(滚环扩增)由于其可以在恒温环境下进行dna的快速扩增而在生物检测等方面得到广泛应用。滚环扩增方法只需要两种酶，在几个小时内就可以形成一条重复循环序列的超长链dna，若需要得到与设计目标序列相同的单核酸链，只需要在设计反应环时加入可识别区域并利用相应的dna剪切酶将重复的循环序列剪裁成分立的单链。以最简单的rca方法为例，首先设计构建一条包含与目标链互补序列的核酸链，并且将5’与3’端附近一小段序列合在一起可与引物互补。这样，在加入引物后这一核酸链可与引物发生杂交反应而使5’与3’端靠近形成一个带缺口的环，在t4 dna连接酶的作用下可将缺口处“缝合”而形成一个完整的环状dna作为扩增反应的模板，这一反应称为成环反应。此时再加入游离碱基(dntps)和dna聚合酶(如phi29等)，可以沿5’到3’方向由引物的一端进行延伸使游离的碱基聚合形成与环互补的一条dna链。复制完一整圈后，新形成的位点可取代之前与环杂交位点进行下一圈的复制，如此循环往复最终形成一条与环状模板链互补的循环重复序列dna。这种方法操作方便，过程简单，易于实现，特别是对于非绝对定量检测的实验，rca扩增成为非常重要的一种辅助方法以实现超高灵敏度的核酸检测。
[0004]
表面增加拉曼散射(sers)作为一种新兴的光学检测手段，已经成功应用于化学分析、环境监测、生物医学等领域。尤其是在生物医学方面的应用，近年来吸引了大批研究者。主要是因为sers光谱在检测时具有很多优点，如灵敏度高、稳定性好、光谱带窄、生物损伤低等。本发明利用这些特点，采用了sers检测的方法来进行外泌体内mirna的多元检测。


技术实现要素：

[0005]
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种基于滚环扩增的外泌体内多种mirna同时扩增检测的方法，该方法能够能同时对外泌体多种肿瘤相关的mirna进行扩增并检测，极大提升外泌体内mirna的检测效率及灵敏度，为肿瘤的早期检测提供了更可靠的技术支持。
[0006]
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了一种基于滚环扩增的外泌体内多种mirna同时扩增检测的方法，包括以下步骤，
[0007]
步骤一：利用裂解液将外泌体裂解，得到外泌体内含microrna；
[0008]
步骤二：加入扩增用的混合模板dna成环为模板链后完成rca扩增；
[0009]
步骤三：制备sers分子信标；
[0010]
步骤四：在扩增产物溶液中加入sers分子信标并用拉曼光谱仪检测sers光谱，计算特征峰的强度差。
[0011]
进一步的，在本发明中：所述裂解液为ripa中性裂解液，裂解后能过得到的外泌体内所有的microrna。
[0012]
进一步的，在本发明中：所述混合模板dna为设计的dna单链，序列为待测的microrna互补序列连续重复两次首尾相接，并在其中的一次完整序列的中间断开形成缺口，所述混合模板dna能够特异性识别对应的microrna。
[0013]
进一步的，在本发明中：所述待测microrna相应的模板至少为三种。
[0014]
进一步的，在本发明中：所述成环为模板链包括在溶液体系中含有目标mirna时利用t4连接酶催化的成环反应。
[0015]
进一步的，在本发明中：所述rca扩增包括将环状模板dna链加入到游离的碱基与phi29聚合酶等混合溶液后的扩增反应。
[0016]
进一步的，在本发明中：所述sers分子信标为各种待测的microrna的相应分子信标等比例混合溶液。
[0017]
进一步的，在本发明中：所述sers分子信标的dna结构为一条两端有5个碱基互补并含有目标microrna互补序列的dna单链，且5’端修饰拉曼分子，3’端修饰巯基。
[0018]
进一步的，在本发明中：所述sers分子信标由设计的分子信标dna序列加入金纳米粒子后形成。
[0019]
有益效果：本发明与现有技术相比，其有益效果是：
[0020]
(1)利用扩增方法将外泌体内极其微量的mirna进行提前扩增，方便后续的检测，实现较高的检测灵敏度；
[0021]
(2)使用的扩增方法为滚环扩增，可以在常温下快速完成，避免了pcr等技术复杂的反应环境及反应流程；
[0022]
(3)利用滚环扩增反应便捷的优势使多种mirna同时进行扩增并可同时检测，实现高通量的检测，极大提高了mirna的检测效率；
[0023]
(4)利用探针的sers信号来进行检测，有效避免了常规的荧光方法荧光分子容易淬灭、信号峰宽等缺点；
[0024]
(5)利用分子信标的信号强度差来间接检测目标mirna的量，可进行半定量多元检测并能分析外泌体中不同的mirna含量比例，对癌症的早期排查有着重要意义。
附图说明
[0025]
图1为本发明提出的基于滚环扩增的外泌体内多种mirna同时扩增检测的整体示意图；
[0026]
图2为实施例1中huv外泌体的三种mirna检测的sres信号强度差；
[0027]
图3为实施例2中mcf7外泌体的三种mirna检测的sres信号强度差。
具体实施方式
[0028]
下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：
[0029]
本发明可以用许多不同的形式实现，而不应当认为限于这里所述的实施例。相反，提供这些实施例以便使本公开透彻且完整，并且将向本领域技术人员充分表达本发明的范围。
[0030]
如图1所示，本发明提出了一种基于滚环扩增的外泌体内多种mirna同时扩增检测的方法，包括以下步骤，
[0031]
步骤一：利用ripa裂解液将外泌体裂解，得到外泌体内含microrna；
[0032]
步骤二：加入扩增用的混合模板dna成环为模板链后完成rca扩增；
[0033]
步骤三：制备sers分子信标；
[0034]
步骤四：在扩增产物溶液中加入sers分子信标并用拉曼光谱仪检测sers光谱，计算特征峰的强度差。
[0035]
具体的，所述裂解液为ripa中性裂解液，裂解后能过得到的外泌体内所有的microrna。
[0036]
所述混合模板dna为设计的dna单链，序列为待测的microrna互补序列连续重复两次首尾相接，并在其中的一次完整序列的中间断开形成缺口，所述混合模板dna能够特异性识别对应的microrna，本实施例中为多种待测microrna对应的模板dna等比例混合溶液。
[0037]
待测microrna相应的模板至少为三种。
[0038]
成环为模板链的过程为在溶液体系中含有目标mirna时利用t4连接酶催化的成环反应。
[0039]
rca扩增包括将环状模板dna链加入到游离的碱基与phi29聚合酶等混合溶液后的扩增反应。
[0040]
sers分子信标为各种待测的microrna的相应分子信标等比例混合溶液。
[0041]
进一步的，sers分子信标的dna结构为一条两端有5个碱基互补并含有目标microrna互补序列的dna单链，且5’端修饰拉曼分子，3’端修饰巯基。
[0042]
sers分子信标由设计的分子信标dna序列加入金纳米粒子后形成。
[0043]
加入金纳米粒子后，由于巯基与金属相互作用可以使dna通过巯基牢固结合到金纳米粒子上。由于两端的互补序列自杂交后形成发卡型结构，自然状态下拉曼分子与金纳米粒子靠近导致其拉曼信号增强。在遇到待测的mirna后分子信标与其发生杂交反应使发卡结构打开，从而拉曼分子远离金纳米粒子，拉曼信号减弱，此时检测到信号差的与目标mirna序列的量相关。
[0044]
实施例1
[0045]
提取正常人细胞huv的外泌体，选择mirna21、mirna122和mirna155为待测mirna利
用本发明的方法进行基于滚环扩增的外泌体内多种mirna同时扩增检测的实验。
[0046]
具体的，首先提取huv细胞的外泌体：
[0047]
利用超速离心法提取huv细胞培养液中的外泌体。首先将约20毫升huv细胞的不含胎牛血清培养液以2000g的离心力在4℃环境下离心10分钟去除可能含有的细胞或凋亡细胞。然后将离心后的上层清液再以10000g的离心力在4℃环境下离心30分钟以去掉细胞碎片。最后将上层清液以150000g的离心力在4℃环境下离心70分钟，去掉上层培养液用pbs溶解沉淀再以150000g的离心力在4℃环境下离心70分钟。去掉上清液后将外泌体沉淀溶解在500微升的pbs中，-70℃保存。
[0048]
进行外泌体的裂解：
[0049]
取2微升步骤一中所得外泌体悬浮液稀释在18微升pbs中，加入20微升的ripa裂解液在4℃环境下反应20分钟。
[0050]
加入扩增用的混合模板dna实现成环反应：
[0051]
将设计好的mirna21、mirna122和mirna155模板dna稀释到1μm并等比例混合形成混合模板溶液。0.5μl的t4连接酶与2μl t4缓冲液加入到9.5μl的去离子水中，再加入5μl的混合模板溶液与5μl的上步骤二的裂解产物形成20μl的成环反应体系，在常温下反应1小时。
[0052]
mirna21模板dna的序列为：
[0053]
ctg ata agc tat ttc aac atc agt ctg ata agc tat ttc aac atc agt
[0054]
mirna122模板dna的序列为：
[0055]
gtc aca ctc cac aaa cac cat tgt cac act cca caa aca cca tt
[0056]
mirna155模板dna的序列为：
[0057]
att agc att aat tac ccc tat cac gat tag cat taa tta ccc cta tca cg
[0058]
完成rca扩增反应：
[0059]
先将步骤三中的反应产物加热到60℃静置10分钟使t4连接酶失活。然后将2.5μl的10μm游离碱基溶液、0.2μl的phi29聚合酶与5μl的phi29聚合酶缓冲液加入到37.3μl的去离子水中，最后加入5μl的60℃处理后的步骤三得到的溶液形成50μl的反应体系，在常温下反应1.5小时。
[0060]
制备sers分子信标：
[0061]
将设计好的分子信标dna序列(2μl 1μm)加入5ml金纳米粒子溶液中在摇床中摇晃1小时，离心浓缩5倍。取2μl在玻璃片上干燥并检测sers信号得到自然状态下探针的信号强度。三种分子信标dna序列如下，
[0062]
mirna21分子信标的序列为：
[0063]5’
cy5-ctctttcaacatcagtctgataagctaaagag-sh 3’[0064]
mirna122分子信标的序列为：
[0065]5’
6-fam-caa aca cca ttg tca cac tcc a-sh 3’[0066]
mirna155分子信标的序列为：
[0067]5’
cy3-ctc tta ccc cta tca cga tta gca tta aaa gag-sh 3’[0068]
其中选取cy5的1366cm-1处峰作为特征峰检测mirna21，选取fam的1317cm-1处峰作为特征峰检测mirna122，选取cy3的1078cm-1处峰作为特征峰检测mirna155。
[0069]
检测扩增产物的sers信号：
[0070]
将三种sers分子信标等比例混合。将混合的分子信标溶液加入到步骤四的溶液中反应0.5小时。将反应完成的溶液取2μl在玻璃片上干燥并在拉曼光谱仪下检测sers信号。
[0071]
本实施例中检测的sers信号为cy5、6-fam和cy3的sers信号，与三种探针的自然状态下相比其强度差代表了huv外泌体中mirna21、mirna122和mirna155的扩增后的量。参照下图2的示意，图2中显示了正常细胞huv外泌体中三种mirna扩增后加入sers探针检测到的信号与初始信号，实施例1可以表明，本发明提出的扩增检测方法能同时扩增检测到外泌体内的多种mirna。
[0072]
实施例2
[0073]
提取乳腺癌细胞mcf7的外泌体，选择mirna21、mirna122和mirna155为待测mirna。利用本发明的方法进行基于滚环扩增的外泌体内多种mirna同时扩增检测的实验。
[0074]
将实施例1中的huv细胞换成乳腺癌细胞mcf7后进行实验，其余步骤与实施例1相同。参照图3的示意，图3显示了用本发明的方法检测的mcf7细胞外泌体内含三种mirna的量，与实施例1相似的是，可根据其与自然状态下的初始信号中三个sers探针信号强度之差反应三种mirna在外泌体内含量之比例，从而实现对外泌体内多种mirna的半定量分析。采用这种方法可进行高能量的生物分析，提高mirna的检测分析效率与灵敏度，为进一步的癌症早期诊断提供必要的信息帮助。
[0075]
应说明的是，以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，其描述并不能理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些均应落入本发明的保护范围。