一种脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的培养液及其制备方法和脱除胚胎中猪Ⅱ型圆环病毒的方法与流程

一种脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的培养液及其制备方法和脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的方法
技术领域
1.本发明属于畜牧养殖技术领域，具体涉及一种脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的培养液及其制备方法和脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的方法。


背景技术：

2.猪体外受精(in vitro fertilization,ivf)和体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, scnt)技术已经得到了较广泛的应用，然而以上两种技术都需要经体外成熟(in vitromaturation,ivm)培养得到的处于减数第二次分裂的高质量mii期卵母细胞。但是用于 ivm的卵母细胞主要来源于商业屠宰场的卵巢，而被屠宰的家畜携带病原体成为重要隐患。我们的监测数据显示，猪ⅱ型圆环病毒(pcv-2)在屠宰场来源的卵巢中感染率达 77.5％，是屠宰场来源卵巢中的主要病原体之一。而pcv-2作为对猪繁殖产生不利影响的一重要疫病，在胚胎收到感染后会显著的影响胚胎的质量，导致胚胎死亡。但是，pcv-2 的感染在卵母细胞成熟和体外产生(in vitroproduction,ivp)胚胎中的特点和影响并不清楚。
3.目前在ivp胚胎中，普遍使用的清除方法是根据国际胚胎移植协会(internationalembryo transfer society,iets)所推荐的胰酶清洗处理方法，其主要原理是通过胰酶进行洗涤，使粘附在透明带上的病毒脱落，同时通过多次的洗涤使培养液中的病毒粒子浓度得到的稀释，进而达到清除病毒的目的。有研究证明使用该方法能去除受病毒感染的成熟卵母细胞，但是在该试验中所使用的病毒为牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrheavirus, bvdv)，其为有囊膜包裹的rna病毒，但pcv-2为无囊膜包裹的dna病毒，两种病毒在结构和组成成分上存在着显著的差异，同时，该实验中的处理对象为受病毒感染的成熟卵母细胞且为人为添加病毒后所获得的，这与在自然状态下受病毒侵染的胚胎存在差异。除此之外，有研究在iest推荐的标准程序上将胰酶替换成透明质酸酶和输卵管分泌物，同时添加了dnase-rnase，经过该方法处理后，人为感染pcv-2病毒的阳性胚胎在pcr 检测后为阴性，成功的将病毒清除，但该试验所使用的方法仅能去除粘附在透明带表面的病毒，对于已经侵染至胚胎内部的病毒无法去除。而当使用pcv-2病毒进行人为感染胚胎后，再按照iest推荐的标准程序或者添加蛋白酶、透明质酸酶和dnase-rnase的方法均不能有效的去除胚胎中的pcv-2。因此目前为止还未建立有效的病毒清除方法，尤其是对于自然状态下已经侵染到胚胎内部的病毒。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了有效的脱除自然状态下侵染到胚胎内部的猪ⅱ型圆环病毒，而提供了一种脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒培养液及其制备方法以及一种脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒方法。
5.为解决脱除猪ⅱ型圆环病毒不彻底的技术问题，本发明提供的脱除胚胎中猪ⅱ型
圆环病毒的培养液是由金刚烷胺、硒代蛋氨酸和pzm-3组成。
6.进一步地限定，所述培养液以pzm-3为基准计，金刚烷胺的浓度为4μg/ml，硒代蛋氨酸的浓度为6μm。
7.为解决上述技术问题，本发明还提供了一种上述的培养的制备方法，所述制备方法是向pzm-3培养液中添加金刚烷胺和硒代蛋氨酸后混匀，经过过滤除菌，平衡处理，获得所述的脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的培养液。
8.进一步地限定，所述培养液培养液在气体环境为95％(体积)的空气和5％(体积) co2的、饱和湿度以及温度为39℃条件下平衡处理12h-16h。
9.进一步地限定，所述过滤除菌是用0.22μm孔径无菌液体滤器。
10.本发明提供的脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的方法是将猪胚胎细胞放置上述的培养液或者利用上述的制备养液方法得到的培养液中培养，完成脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒。
11.进一步地限定，所述培养是在气体环境为95％(体积)的空气和5％(体积)的co2、饱和湿度以及温度为39℃的条件下，培养6天-7天。
12.有益效果：本发明提供了一种脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的方法和培养液，脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的培养液以pzm-3为基准计包括浓度为4μg/ml的金刚烷胺和浓度为 6μm硒代蛋氨酸，可以降低囊胚内的猪ⅱ型圆环病毒核酸的拷贝数，在不影响囊胚的发育前提下，不仅能抑制发育中的胚胎内病毒核酸复制，同时还能抑制病毒衣壳蛋白的合成。
附图说明
13.图1为猪ⅱ型圆环病毒dna的pcr检测结果，其中m是5000dnamarker，1-13是样本编号，c是阳性对照；
14.图2为显微镜下成熟卵母细胞图；
15.图3为金刚烷胺和硒代蛋氨酸添加对囊胚率的影响结果图，其中a是是8μg/ml的金刚烷胺处理后的囊胚率，图b是4μg/ml的金刚烷胺处理后的囊胚率，图c是6μm硒代蛋氨酸处理后胚胎的囊胚率，图d是4μg/ml的金刚烷胺和6μm硒代蛋氨酸处理后的囊胚率， p《0.05；
16.图4为孤雌囊胚中猪ⅱ型圆环病毒的cap蛋白表达水平结果图，其中图a是在猪ⅱ型圆环病毒阳性处理组和对照组和猪ⅱ型圆环病毒阴性对照组的囊胚时期的胚胎中cap蛋白表达水平，图b是对图a免疫荧光强度的统计分析，p《0.05。
具体实施方式
17.实施例1.
18.本实施例中制备脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的培养液的方法是通过下述步骤完成的：
19.步骤1.制备pzm-3：在一无菌烧杯中加入100ml去离子水，然后按照表1加入各组分搅拌至完全溶解，调整ph为7.3
±
0.2，用0.22μm孔径无菌液体滤器过滤后得到pzm-3 母液，取9.7ml的pzm-3母液，加入0.2ml必需氨基酸，0.1ml非必需氨基酸和0.03gbsa，得到pzm-3培养液，作为对照组的pzm-3培养液。
20.步骤2.从步骤1得到的pzm-3培养液中吸取5ml pzm-3培养液，加入0.02g金刚烷胺
和0.00588g硒代蛋氨酸后混匀，用0.22μm孔径无菌液体滤器过滤除菌，在气体环境为95％的空气和5％、饱和湿度以及温度为39℃的培养箱内，平衡处理12h，获得抑制猪ⅱ型圆环病毒感染的胚胎培养液。
21.表1胚胎培养母液的成分
[0022][0023]
实施例2.
[0024]
本实施例中脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的方法是按下述步骤进行的：
[0025]
将猪胚胎细胞放置实施例1所述的制备方法得到的培养液中，在5％co2和39℃条件下培养7天，完成脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒。
[0026]
描述试验验证发明效果：
[0027]
1.实验材料：母猪卵巢是从哈尔滨信诚食品有限公司屠宰场获取的。
[0028]
2.试验试剂：pmd-18t载体、提取病毒dna试剂盒、extaq试剂盒和sybr premixdimereraser试剂盒都购自宝日医生物技术(北京)有限公司；pcv-2cap蛋白的多克隆抗体购自abcam生物公司；驴抗兔抗体igg-488购自invitrogen生物公司；d-mannitol、丝裂霉素c、牛血清白蛋白(bsa)、hoechst33342、pva(聚乙烯酶)、bsa、sodium pyrurate、酚红、nacl、mgso4·
7h2o、nahco3、mat成品、egf、lh、fsh、cb、 kh2po4ca-(lactate)2·
5h2o、glucose、l-glutaurine、半胱氨酸、去离子水、丙酮酸钠、 kcl、三羟甲基氨基甲烷(tris)、hypotaurine、gentamicin、gentamicin sulfate salt、乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、透明质酸、tween、tritonx-100、penicillin g、dpbs金刚烷胺都是购自sigma生物公司；75％酒精购自山东利尔康消毒科技有限公司；抗荧光淬灭封片液购自碧云天生物公司；石蜡油购自thermo生物公司；青霉素钠购自哈药集团有限公司兽药厂；硫酸链霉素购自长春腾宇兽药有限公司；硒硫氨酸购自上海麦克林生化科技有限公司；0.25％胰蛋白酶、dpbs和m199(medium 199)都是购自gibco生物公司；必需氨基酸和非必需氨基酸(neaa)购自invitrogen生物公司。
[0029]
3.主要仪器设备：
[0030]
台式高速离心机pico17购自德国贺利氏公司；冰箱购自韩国samsung公司；核酸蛋白测定仪购自德国eppendorf公司；瞬时离心机mini-smart购自北京昊诺斯公司；电泳仪bg-power600i和水平电泳槽bg-sub midi都是购自北京百晶公司；二氧化碳培养箱 forma 3111购自thermo fisher公司；美国天平spn402f购自奥豪斯公司；磁力搅拌仪 ems-9a购自天津欧诺公司；荧光显微镜80i购自日本尼康公司；投入式恒温水槽 ntt-2100购自日本eyela公司；实时荧光定量pcr仪abi7500购自罗氏公司；融合仪 btx2001购自美国btx公司；
体式显微镜szx7-1093购自奥林巴斯公司；涡旋混合仪 xw-80a购自上海精科公司；电动移液器购自orange公司公司；高压蒸汽灭菌锅购自日本hirayama公司；移液枪购自德国eppendorf公司；万分之一天平ab104购自瑞士梅特勒公司；紫外、可见分光光度计购自thermo fisher公司；凝胶成像系统购自美国阿尔法公司。
[0031]
4.试剂配制：
[0032]
hepes缓冲液配制：在一干净无菌的烧杯中加入1l去离子水并用笔标记液面位置。称取0.3g pva于98℃以下加热搅拌2-4h至溶解，随后将溶解后的热溶液在冰上降温。同时在另一无菌烧杯中加入1l去离子水，用大平皿按表7依次称取nacl、hepes、d-sorbitol 山梨醇，再用称量纸称取kcl、nahco3、penicillin g、kh2po4、mgcl2·
6h2o，之后再加入丙酮酸钠、sodium pyrurate和gentamicin sulfate salt至第二个烧杯搅拌溶解。待第一个烧杯冷却后补充去离子水至标记的刻线，加入cacl2·
2h2o。两个烧杯中加入的药品都彻底溶解后混合在一起，用1l超纯水润洗烧杯和称量用的大平皿再加入酚红，调整ph至 7.3
±
0.1，最后用0.22μm孔径的大液体滤器过滤，随后再用封口膜密封保存在4℃冰箱中备用。具体成分的含量如表2所示。
[0033]
表2 hepes缓冲液的组成成分
[0034][0035]
融合液(fm)的配制：在无菌的烧杯中加入100ml超纯水，称取5.46g d-mannitol， 0.015g cacl2·
2h2o，0.002g mgcl2·
6h2o和0.013g hepes，待完全溶解后调整ph至7.2
±
2，用0.22μm的无菌滤器过滤后密封保存在4℃备用。
[0036]
透明质酸酶配制：用hepes溶液溶解透明质酸酶粉末至终浓度0.001g/ml，-20℃保存备用。
[0037]
免疫荧光相关液体的配制：
[0038]
dpbs：按照说明书将dpbs粉末溶于超纯水中，过滤至无菌蓝口瓶，4℃保存，存贮时间不超过3天。
[0039]
清洗液：吸取100μl的tween和10μl的tritonx-100溶解于100ml的dpbs，过滤后4℃保存，现用现配。
[0040]
透膜液：吸取100μl的tritonx-100溶于10ml的dpbs，过滤后4℃保存，现用现配。
[0041]
封闭液：称取0.1g的bsa在10ml的清洗液中静置溶解，过滤后4℃保存，现用现配。
[0042]
固定液：称取4g的多聚甲醛溶于100mldpbs，加入naoh可加速溶解，过滤后-20℃储存。
[0043]
hoechest：按照说明书取超纯水溶解hoechest33342至浓度为10μg/ml备用。
[0044]
卵母细胞成熟培养液(mat)的配制：在1lm199溶液中加入0.1001g sodium pyruvate 和0.07g penicillin g，溶解后得到mat母液。取0.007g半胱氨酸溶于5mlmat母液得到半胱氨酸溶液。然后按照表8所示，依次加入表中各成分，液体混合均匀后用0.22μm 孔径的滤器过滤，滤出液即为mat，配制完成的mat需要放在co2培养箱中平衡4h以上。具体成分的含量如表3所示。
[0045]
表3卵母细胞成熟培养液的成分
[0046][0047]
操作液(man)配制：在一干净无菌的烧杯中加入1l去离子水，然后按照表9依次加入各组分搅拌溶解，待完全溶解后调整ph为7.3
±
0.1，再用0.22μm孔径无菌液体滤器过滤后得到man母液。取50mlman母液，加入0.1g bsa静置溶解后用0.22μm孔径无菌液体滤器过滤后得到胚胎操作液(man)，存放在37℃中待用。具体成分的含量如表4所示。
[0048]
表4胚胎操作液的成分
[0049][0050]
含有双抗生理盐水的配制：在37℃的生理水中每500ml加入1.2g(200万单位)注射用青霉素钠和1g(100万单位)注射用硫酸链霉素钠，待抗生素粉末溶解后备用。
[0051]
实验用的猪卵母细胞的获取方法如下：
[0052]
步骤一、卵丘卵母细胞复合体(cocs)的制备：
[0053]
1.卵巢的处理：从黑龙江省哈尔滨市信诚食品有限公司的屠宰场采集12个卵巢样品，每一个卵巢单独处理，在37℃含有双抗的0.9％生理盐水中暂存，采集的猪卵巢于2h内运回实验室，盐水温度夏季为32～33℃，冬季为35℃。运回实验室后卵巢温度维持35～36℃为宜，运回的卵巢经过测温确认温度正常后，将其倒入漏筛沥干血水，再用含有双抗的 37℃生理盐水冲洗去除血水，洗净后的卵巢装于保温壶中备用。
[0054]
2.获取生发泡(gv)期卵母细胞：使用针头规格为10g的10ml注射器，挑选直径为2-8mm的卵泡进行卵母细胞的抽取，每个卵巢单独进行抽取，抽取卵巢的液体置于 1.5ml尖底离心管中，且在半小时内抽完。卵母细胞抽取完成后将离心管置37℃温箱中自然沉降
120v、30μs的矩形脉冲电压处理进行猪卵母细胞孤雌发育。
[0065]
采用描述实验验证猪ⅱ型圆环病毒的培养液对囊胚率和胚胎发育的影响
[0066]
1.制备pzm-3的方法：在一无菌烧杯中加入100ml去离子水，然后按照表6加入各组分搅拌至完全溶解，调整ph为7.3
±
0.2，用0.22μm孔径无菌液体滤器过滤后得到pzm-3 母液，取9.7ml的pzm-3母液，加入0.2ml必需氨基酸，0.1ml非必需氨基酸和0.03gbsa，得到pzm-3培养液，作为对照组的pzm-3培养液。
[0067]
2.从步骤1得到的pzm-3培养液中吸取5mlpzm-3培养液，加入0.02g金刚烷胺和 0.00588g硒代蛋氨酸，获得抑制猪ⅱ型圆环病毒感染的胚胎培养液。
[0068]
表6胚胎培养母液的成分
[0069][0070][0071]
猪ⅱ型圆环病毒的培养液对囊胚率和胚胎发育的影响
[0072]
参照实施例1步骤1的制备pzm-3培养液的方法获得pzm-3培养液，作为对照组的培养液，参照实施例1的制备脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的培养液的方法，获得脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的培养液作为处理组1的培养液，然后制成处理组2的金刚烷胺终浓度为8μg/ml的pzm-3培养液，制成处理组3的金刚烷胺的终浓度为4μg/ml的pzm-3培养液，制成处理组4的硒代蛋氨酸的终浓度为6μm的pzm-3培养液，五组培养液静置溶解后分别用0.22μm孔径无菌液体滤器过滤得到五组pzm-3胚胎培养液，然后每500μl 加入到4孔板中，并覆盖石蜡油，同时用各自剩余的培养液制作一个pzm-3的洗滴。配制完成的pzm-3胚胎培养液和pzm-3洗滴须放在5％co2和95％空气且饱和湿度的 39℃co2培养箱中平衡12h-16h。
[0073]
将上述猪卵母细胞的获取方法获得所有阳性样本的分离出的卵母细胞和阴性样本分离出的卵母细胞，每个样本分成五组进行体外成熟培养，每组三个重复，每个重复含有 50-100个卵母细胞，培养后得到猪卵母细胞孤雌发育后的囊胚，分别放到对照组培养液、处理组1培养液、处理组2培养液、处理组3培养液和处理组4培养液中培养，检测添加的药物对胚胎发育的影响。
[0074]
通过评价添加两种药物对胚胎发育影响的分析发现：control(对照组)，treatment(处理组)，blastocyst rate(囊胚率)，结果如图3中的a所示，在胚胎培养液中添加金刚烷胺的浓度为8μg/ml时会降低胚胎的发育效率；图3中的b所示，在胚胎培养液中金刚烷胺的浓度为4μg/ml时，处理组和对照组的囊胚率无明显差异；图3中的c所示，在胚胎培养液中添加的硒代蛋氨酸浓度为6μm时，对胚胎发育无影响；图3中的d所示，在胚胎培养液中添加的金刚烷胺浓度为4μg/ml和硒代蛋氨酸浓度为6μm时，对胚胎的发育无影响。
[0075]
脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的方法：
[0076]
步骤(一)、制备pzm-3培养液的方法
[0077]
参照实施例1步骤1的制备pzm-3培养液的方法获得pzm-3培养液，作为对照组的培养液，参照实施例2的制备脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的培养液的方法，获得脱除胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的培养液作为处理组的培养液。
[0078]
步骤(二)、将上述方法步骤三得到的阳性样本猪卵母细胞孤雌发育后的囊胚和阴性样本猪卵母细胞孤雌发育后的囊胚，分别转移到已在co2培养箱中平衡12h-16h的对照组pzm-3培养液和处理组pzm-3培养液中，并且在各自的液滴中清洗4次，再每50枚胚胎为一组转移到预温好的含有500μl对照组pzm-3培养液和处理组pzm-3培养液的四孔板中，在含有气体环境为95％的空气和5％co2、饱和湿度以及温度为39℃的二氧化碳培养箱中培养。
[0079]
步骤(三)、检测猪ⅱ型圆环病毒的方法
[0080]
(1)收集胚胎：待阳性样本的胚胎发育到第6-7天时进行样本收集。对于要进行qpcr 检测的胚胎样本，将发育到6天时期的囊胚吸出放到1.5ml的离心管中并立即进行液氮冻干处理，注意吸取胚胎时尽量的少带培养液，并记录胚胎个数。对于qpcr检测的培养液样本，在所有的胚胎样本收集完成后，选取一培养相同数目胚胎的孔，各自吸取200μl 的胚胎培养液，然后立即进行液氮冻干处理。
[0081]
(2)采用实时荧光定量pcr检测猪胚胎中猪ⅱ型圆环病毒的脱毒情况，方式如下：
[0082]
采用提取病毒dna的试剂盒提取胚胎中猪ⅱ型圆环病毒dna，以取猪ⅱ型圆环病毒dna为模板，按照表7配置实时荧光定量pcr反应体系，引物对：qf如seq id no.3 所示，即5'-gctgaacttttgaaagtgagccggg-3'，qr如seq id no.4所示，即 5'-tcacacagtctcagtagatca-3'，每份dna样品配置三份相同体系，以做同类对比，并每次实验都设置一份不加dna的对照组以做参照。将所有样品体系点入96孔板，使用sybr premix dimereraser和abi7500实时荧光定量pcr系统进行扩增反应，反应程序为：95℃预变性30s；随后将95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s的扩增程序重复40个循环，根据标准曲线计算病毒拷贝数。
[0083]
表7绝对定量pcr反应体系
[0084][0085]
反应结束后记录各检测样品的pcr扩增曲线ct值，按照实时荧光定量pcr检测 pcv-2结果的阳性判定标准判定待检样本中是否存在pcv-2：通过建立的pcv-2实时荧光定量pcr反应的标准曲线方程：copies＝(81.606-ct mean)/7.5805(copies为拷贝数， ct mean为ct的平均值)，计算出检测样品中pcv-2的基因片段拷贝浓度，从而对猪胚胎中pcv-2含量进行定量检测。实时荧光定量pcr检测结果显示，根据各处理的反应ct 值利用pcv-2标准曲线方程对猪胚胎中病毒含量进行精确定量，进而计算降低的病毒拷贝数。结果如表8所示，在pcv-2阳性的囊胚(blastocyst)中的病毒拷贝数(copies)显著降低。这表明在添加金
刚烷胺和硒代蛋氨酸后，病毒在胚胎发育过程中的复制受到了显著的抑制。
[0086]
表8在囊胚阶段金刚烷胺和硒代蛋氨酸对病毒复制的作用
[0087][0088]
注：表中的每个数值都是经过至少6次重复所取得的均值和标准差，不同的字母(a、b) 代表的显著的差异(p《0.05)。
[0089]
3.检测猪ⅱ型圆环病毒cap蛋白的方法
[0090]
用免疫荧光的方法孤雌囊胚中猪ⅱ型圆环病毒的cap蛋白表达水平，猪ⅱ型圆环病毒阳性处理组(treatment)，阳性对照组(control)和猪ⅱ型圆环病毒阴性对照组(negative control)的囊胚时期的胚胎中cap蛋白表达水平，方法如下：
[0091]
(1)去透明带：首先将需要使用的胚胎用酸性操作液(卵母细胞操作液man作为稀释液配制成1％盐酸)去除透明带；
[0092]
(2)固定：向24孔板中加入500μl固定液，在室温条件将去除透明带的样本常温下固定30-60min或者4℃时固定8h，24孔板每孔的样本数量不超过30个；
[0093]
(3)透膜：在室温条件下将固定的样本在500μl透膜液中透膜20min；
[0094]
(4)封闭：室温条件下在500μl封闭液中封闭1h；
[0095]
(5)一抗孵育：在96孔板中的一个孔加入以1:1000稀释的抗pcv-2cap蛋白的多克隆抗体50μl，然后将一抗稀释液与样本一同在4℃条件下过夜孵育，但不要超过14h；
[0096]
(6)清洗：孵育后将样品在清洗液中清洗5次，每次10min；
[0097]
(7)二抗孵育：在避光条件下进行二抗的孵育，在96孔板中的一个孔加入以1:500 稀释的驴抗兔抗体igg-48850μl，然后在37℃下避光孵育1h；
[0098]
(8)清洗：将样品在清洗液中清洗5次，每次10min；
[0099]
(9)hoechest染核：最后使用hoechest对样本进行细胞核染色，将样本与4mg/ml 的hoechest避光孵育5-10min；
[0100]
(10)清洗：在清洗液中清洗5次，每次10min；
[0101]
(11)封片：在封片前将干净的载玻片和在酒精溶液中浸泡过夜的盖玻片用纱布清洗擦干，然后在载玻片中央上滴加8μl荧光猝灭剂，随后加入胚胎，将盖玻片轻轻放在样本上，最后用指甲油封住盖玻片周围孔隙，待晾干后，用显微镜进行荧光的观察。
[0102]
结果如图4所示表明，intensity(荧光强度)，经过处理组的pzm-3培养液处理之后的孤雌囊胚中cap蛋白免疫荧光强度显著降低，说明在胚胎培养液中添加0.02g金刚烷胺和0.00588g硒代蛋氨酸后能抑制病毒衣壳蛋白的合成。