鸭新型微核糖核酸病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒的制作方法

1.本发明属于禽病学检测领域，具体涉及一种鸭新型微核糖核酸病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。


背景技术：

2.环介导等温扩增技术(loop
‑
mediated isothermal amplification，lamp)是应用4
‑
6条特异性引物，通过bstdna聚合酶，在水浴锅中对靶基因进行的一种恒温扩增技术，该技术具有扩增特异性强、灵敏度高、操作快速简便、检测简单等特点，摆脱了对pcr仪、实时荧光定量pcr仪等昂贵仪器的依赖，在基层单位的检测更加方便。相对于现有的其他核酸扩增技术，lamp具有许多独特的优点：
①
lamp技术扩增的特异性非常高，使用的特异性引物可以识别目的序列上特异性的区域，对目的序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响。
②
lamp技术可以在等温条件下实现扩增，减少了对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高。仅需要普通水浴锅调节温度(60℃～65℃)，大大降低了检测的费用，特别适合基层和现场使用。
③
lamp技术阳性扩增反应中会产生大量的类似花椰菜结构的产物和白色焦磷酸续沉淀，扩增产物的检测方法多样，可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加入荧光显色试剂，根据颜色的变化通过荧光照射装置进行紫外光照射检测进行分析。
3.微核糖核酸科(picornaviridae family)病毒是重要的人畜共患病原体,它会导致人和动物出现亚临床感染或从轻度发热到心脏、肝脏和中枢神经系统的严重疾病。微核糖核酸科病毒是一类二十面体对称、呈球形，直径约20
‑
30nm、无囊膜的单股正链rna病毒。微核糖核酸科病毒包含63个病毒属，常见的有口蹄疫病毒属(aphthovirus)、肠病毒属(enterovirus)、心病毒属(cardiovirus)、肝病毒属(hepatovirus)等。微核糖核酸科病毒基因长度一般为6.6kb
‑
9.8kb，基因组一般仅含有一个大的开放阅读框(open reading frame，orf)，3’端为poly a尾，5’端有vpg蛋白与之共价结合，基因组rna有感染性。近年来，随着病毒宏基因组学研究的不断深入，归属于微核糖核酸科megrivirus属的病原先后从火鸡、鸡、鸽子和鸭中发现。基因组学分析发现，鸭新型微核糖核酸病毒(duck megrivirus,dumv)的基因组结构特征和火鸡源megrivirus、鸡源megrivirus相似，且其聚蛋白含有典型微核糖核酸科病毒的特征性基序。遗传进化分析表明，鸭新型微核糖核酸病毒(dumv)与megrivirus属的火鸡、鸡、鸽子源新型微核糖核酸病毒处于同一遗传进化分支。
4.目前，还未见针对鸭新型微核糖核酸病毒(dumv)环介导等温扩增(lamp)反应方法的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鸭新型微核糖核酸病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，利用该引物组可以特异性的检测鸭新型微核糖核酸病毒，为基层和现场提供一种简便、快捷的检测鸭新型微核糖核酸病毒的方法。
6.本发明的目的通过如下技术方案实现：
7.一种鸭新型微核糖核酸病毒环介导等温扩增检测引物组，其由外引物(dumv
‑
f3和dumv
‑
b3)、内引物(dumv
‑
fip和dumv
‑
bip)、环引物(dumv
‑
lb)组成，上述引物序列如下：
8.dumv
‑
f3：5
’‑
agagatgtcattctggggtga
‑3’
，
9.dumv
‑
b3：5
’‑
gccatcttcaaacatgggaac
‑3’
，
10.dumv
‑
fip：5
’‑
11.cggggtgggagcttcatagacaataaggatggctggtgcaaag
‑3’
，
12.dumv
‑
bip：
[0013]5’‑
ttgtgcctctcattgtggcggtccgcaatccagtcaagac
‑3’
，
[0014]
dumv
‑
lb：5
’‑
agtggacagatggatctgtaggt
‑3’
。
[0015]
一种含所述引物组的鸭新型微核糖核酸病毒检测试剂盒。
[0016]
所述的鸭新型微核糖核酸病毒检测试剂盒的lamp反应体系25μl：12.5μl的2
×
反应缓冲液、1μl的dumv
‑
fip(40pmol)、1μl的dumv
‑
bip(40pmol)、2μl的dumv
‑
lb(10pmol)、0.5μl的dumv
‑
f3(10pmol)、0.5μl的dumv
‑
b3(10pmol)、1μl的bstdna聚合酶、1μl的荧光目视检测试剂，其余用超纯水(5.5μl)补足至25μl。反应条件为63℃反应50min。
[0017]
所述鸭新型微核糖核酸病毒环介导等温扩增检测引物组在制备鸭新型微核糖核酸病毒快速诊断试剂中的应用。
[0018]
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
[0019]
(1)操作简便、快速：本发明建立的lamp方法操作简便、无需复杂昂贵仪器，便于基层临床现场使用，方便快速。此外，建立的lamp方法快速高效，从提取样品到结果判定可在1h内完成。反应结果判定方法简单，在可见光下将阳性、阴性结果进行对比。肉眼可见阳性样品管反应液明显浑浊，阴性管样品管反应液颜色变化不大。经紫外线照射装置(254nm)照射可见，阳性样品发出翠绿色荧光，阴性样品则没有。必要时，可进行常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性样品可见有不连续梯状电泳条带。
[0020]
(2)灵敏度高：本发明建立的lamp方法检测鸭新型微核糖核酸病毒，最低检测限为90.24copy/μl。
[0021]
(3)特异性强：本发明建立的lamp方法对其他传染病(如dhav
‑
1、dhav
‑
3、aiv、apmv
‑
1、mdrv和n
‑
drv)检测均为阴性，仅对鸭新型微核糖核酸病毒出现阳性结果。
附图说明
[0022]
图1是本发明鸭新型微核糖核酸病毒lamp特异性实验(直接观察)结果图。其中，1为dumv；2为dhav
‑
1；3为dhav
‑
3；4为aiv；5为apmv
‑
1；6为mdrv；7为n
‑
drv。
[0023]
图2是本发明鸭新型微核糖核酸病毒lamp方法敏感性试验(琼脂糖电泳)结果图。m为dl 2000dna marker；1为9.024
×
104；2为9.024
×
103；3为9.024
×
102；4为9.024
×
101；5为9.024
×
100；6为阴性对照。
具体实施方式
[0024]
下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的
保护范围内。
[0025]
实施例1
[0026]
一、实验方法
[0027]
1试验毒株和菌株
[0028]
试验用病原新型微核糖核酸病毒(dumv)、鸭1型肝炎病毒(dhav
‑
1)、鸭3型肝炎病毒(dhav
‑
3)、鸭源禽流感病毒(aiv)、鸭源禽1型副粘病毒(apmv
‑
1)、番鸭呼肠孤病毒(mdrv)和新型鸭呼肠孤病毒(n
‑
drv)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
[0029]
2核酸提取和cdna的制备
[0030]
用商品化核酸提取试剂盒说明书提取相关病毒(dumv、dhav
‑
1、dhav
‑
3、aiv、apmv
‑
1、mdrv和n
‑
drv)核酸rna，并将其反转录为cdna备用(
‑
20℃)。
[0031]
3 lamp的引物设计
[0032]
根据genbank中登录的所有鸭新型微核糖核酸病毒基因序列特征，并将其和其他禽源微核糖核酸病毒成员进行分析比较。选择鸭新型微核糖核酸病毒保守区域片段，设计引物组，包括外引物1对(dumv
‑
f3和dumv
‑
b3)、内引物1对(dumv
‑
fip和dumv
‑
bip)和环引物一条(dumv
‑
lb)，具体序列见seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5。将设计好的相关引物，经ncbi数据库进行blast分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，符合试验预期。
[0033]
利用设计的外引物(dumv
‑
f3和dumv
‑
b3)(内引物dumv
‑
fip和dumv
‑
bip在外引物扩增区域以内，条带较短，常规pcr检测易和引物二聚体混淆)对相关病毒(dumv、dhav
‑
1、dhav
‑
3、aiv、apmv
‑
1、mdrv和n
‑
drv)进行常规rt
‑
pcr扩增检测。
[0034]
按照primescript
tm
one step rt
‑
pcr kit ver.2(dye plus)说明书进行rt
‑
pcr反应，反应体系参考说明书配制，反应体系为50μl：其中primescript 1step enzyme mix 2μl、2
×
step buffer(dye plus)反应液25μl、上/下游引物(10pmol dumv
‑
f3和10pmol dumv
‑
b3)各1μl、提取核酸rna 1μl，补充灭菌去离子水至终体积50μl。反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min。反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。结果dumv
‑
f3和dumv
‑
b3仅对鸭新型微核糖核酸病毒(dumv)扩增出现特异性目的条带；对其他病原均未见特异性条带扩增。上述结果表明设计的相关引物无交叉干扰，特异性强。
[0035]
4 lamp方法的优化
[0036]
按照环介导等温扩增法dna扩增试剂盒(slp204 laoopamp dna扩增反应试剂盒)配置lamp试验反应液，反应体系为25μl。每25μl反应体系中含有：12.5μl的2
×
反应缓冲液、1μl的dumv
‑
fip(40pmol)、1μl的dumv
‑
bip(40pmol)、2μl的dumv
‑
lb(10pmol)、0.5μl的dumv
‑
f3(10pmol)、0.5μl的dumv
‑
b3(10pmol)、1μl的bstdna聚合酶、1μl的荧光目视检测试剂，其余用超纯水(5.5μl)补足至25μl。
[0037]
对不同温度(60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃)、不同时间(20min、30min、40min、50min、60min)进行推荐优化。结果发现，优化后最佳反应条件为63℃反应50min。
[0038]
5 lamp检测方法的特异性试验
[0039]
取相关病毒(dumv、dhav
‑
1、dhav
‑
3、aiv、apmv
‑
1、mdrv和n
‑
drv)核酸rna反转录后的cdna，分别用优化后的lamp条件进行检测。结果表明，经紫外线照射装置(254nm)照射可
见，阳性样品(dumv)发出翠绿色荧光，阴性样品(dhav
‑
1、dhav
‑
3、aiv、apmv
‑
1、mdrv和n
‑
drv)均未见可见荧光(见图1)。
[0040]
6 lamp检测方法的敏感性试验
[0041]
6.1阳性标准品的构建
[0042]
针对dumv基因片段设计特异性引物(dumv
‑
f002和dumv
‑
r002)，用于制备标准品质粒。其上游引物dumv
‑
f002(引物序列为：5
’‑
agtgttcaaagtgccaggagt
‑3’
)和下游引物dumv
‑
r002(引物序列为：5
’‑
ccaccatcatccagttcata
‑3’
)进行pcr扩增含有靶序列的基因片段(目的片段大小为295bp)。
[0043]
按照takara taq
tm
hs perfect mix说明书进行pcr反应，反应体系参考说明书配制，反应体系为50μl：其中takara taq hs perfect mix(2x)反应液25μl、上/下游引物(10pmol dumv
‑
f002和10pmol dumv
‑
r002)各1μl、制备的cdna模板1μl，补充灭菌去离子水至终体积50μl。反应条件为：94℃预变性2min；94℃5s，53℃5s，72℃30s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min。反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照peasy
‑
t1 simple cloning kit克隆连接试剂盒说明书将鸭新型微核糖核酸病毒基因片段克隆到peasy
‑
t1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/ml)抗性的lb液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用pcr扩增时的引物(dumv
‑
f002和dumv
‑
r002)和条件对提取的质粒进行pcr鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在ncbi上进行blast分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量pcr的阳性标准品(t
‑
dumv)，分装后置于
‑
20℃保存备用。
[0044]
6.2敏感性测定
[0045]
对阳性标准品(t
‑
dumv)进行连续稀释，选取质粒浓度分别为9.024
×
104，9.024
×
103，9.024
×
102，9.024
×
101和9.024
×
100拷贝/μl)，按照优化后的lamp条件进行检测，获得其敏感性试验数据。
[0046]
反应结束后，将结果进行常规琼脂糖凝胶电泳可见图2，在9.024
×
104，9.024
×
103，9.024
×
102，9.024
×
101(即90.24copy/μl)均可见有不连续梯状电泳条带，9.024
×
100拷贝/μl未见不连续梯状电泳条带，表明本发明的最低检测限为90.24copy/μl。
[0047]
7现地检测应用
[0048]
对收集的82份鸭组织病料经研磨处理后，按照商品化试剂盒提取相应的核酸后反转录为cdna，按照优化后的lamp条件进行检测。结果可见，6份检测可见翠绿荧光(即为鸭新型微核糖核酸病毒感染阳性)，阳性率为7.32％(6/82)。将82份样品用鸭新型微核糖核酸病毒特异性的pcr检测引物(dumvf：agtggytaagcctcgttctga；dumvr：accataatractcgaccagcc)进行常规pcr检测，结果阳性样品6份，和本发明建立的lamp检测方法符合率为100％。
[0049]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。