一种枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株及其应用

本发明属于微生物分离培养技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株对墨兰根腐病的防治应用。

背景技术：

墨兰（cymbidiumsinense）是兰科兰属地生植物，主要分布于中国、印度、缅甸、越南、泰国、日本琉球群岛等地。墨兰根腐病是人工栽培及产业化生产的主要病害之一。该病发生普遍，是兰花上的重要病害，影响兰花长势和观赏。该病主要为害肉质根。发病初期根上出现浅褐色、水渍状病斑，扩展后呈褐色腐烂，根一段一段腐烂至全根腐烂，再蔓延到其他根上。墨兰根腐病病原菌为尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)由于根系受害，轻时叶尖干枯，叶片黄绿，长势差，重时全株死亡，造成严重的经济损失。

由于日益严峻的3r问题以及兰花作为室内观赏花卉的特性，使得化学防治已不再适用于兰花根腐病的防控，因此生物防治被认为是绿色生态可行的防治方法，筛选分离出一种防治兰花根腐病，同时对环境、人类无害的生物菌株是有必要的。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)；第二目的在于提供所述的枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)的应用。

除非另有说明外，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株分类命名为(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日：2020年01月13日，保藏编号：19347，，所述枯草芽孢杆菌沙漠亚种属于细菌界，厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目、芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。

本发明所述的枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)cpba-w01，于2020年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，简称：cgmcc。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080)。其保藏编号为cgmccno：19347。

所述菌株对墨兰根腐病的抑病效果较好，能够抑制病原菌的生长，而不影响墨兰的品质。

所述菌株采用对峙培养法的第3天即可观察到墨兰根腐病病原菌受到抑制，在对峙培养的第5天观察到抑制现象更明显，抑菌带达到9mm。

所述菌株采用滤纸片培养法的第3天即可观察到墨兰根腐病病原菌受到抑制，在对峙培养的第5天观察到抑制现象更明显，抑菌圈达到8mm。

所述菌株是通过下述具体步骤获得的：

a、标本采集：从四川省攀枝花市苏铁自然保护区采集的攀枝花苏铁珊瑚状菌根；

b、菌株的分离培养：采用常规组织法分离攀枝花苏铁珊瑚状菌根内生细菌：用蒸馏水洗净珊瑚状菌根表面土壤后吸干水分，将珊瑚根组织切成0.5cm×0.5cm的组织块，先用75%酒精消毒1min，然后用0.1%升汞溶液消毒5min，最后用无菌水漂洗3次。用无菌滤纸吸干多余水分后放置在lb培养基上，28℃培养48h。待菌落形成后，用无菌接种环挑出典型的单一菌落，在新的lb培养基，用划线法将菌株纯化；

c、菌种保存：将实验获得的生防备用菌株的纯菌落接种于试管斜面，28℃培养5d长满菌落后4℃冰箱保存。保存培养基为lb培养基。

lb固体培养基成分以g/l计为：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂20g、蒸馏水1l，ph7.2~7.5。

步骤a所述的标本采集地为四川省攀枝花市苏铁自然保护区。

步骤a所述的标本采自苏铁自然保护区攀枝花苏铁珊瑚状菌根。

步骤b所述无菌操作台中步骤为，酒精灯下操作，并在酒精灯火焰上灼烧接种针，接种环，在酒精等下操作所有分离步骤。

步骤b所述的灭菌，是将接种针、接种环、无菌水、镊子、空培养基等试验所需材料置于高压蒸汽式灭菌器中，在121℃下灭菌处理30min。

步骤b所述的分离培养条件的优选；28℃黑暗中静置培养48h。

步骤c所述的纯化培养及保存的条件优选；28℃黑暗静置培养5d后4℃保存。

一种用所述的枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)cpba-w01防治墨兰根腐病的方法，包括生防菌株的筛选及生防效果的测定，具体包括以下步骤：

a、生防菌株的筛选：利用十字交叉法对拮抗菌进行初筛。具体操作如下：以墨兰根腐病菌(fusariumoxysporum)为指示菌，在改良pda培养基平板中心接种病原菌的6mm琼脂块，然后将分离培养得到的细菌单菌落等距离接种在距离病原菌2.5cm处，每皿接种4个菌株，设置5个重复，28℃恒温培养3~5d后，观察抑菌圈大小，挑选出拮抗效果最优的菌株；

b、生防效果的测定：为了筛出抑菌活性较强的菌株，采用平板对峙生长法对初筛获得的菌株进行复筛：以墨兰根腐病菌(fusariumoxysporum)为指示菌，首先用6mm打孔器打取活化的病原菌琼脂块，置于平板上，然后采用点接法接种拮抗菌，两菌相距2.5cm，对照组只接种病原菌琼脂块，设置3个重复，28℃培养箱中培养3~5d，观察病原菌生长情况，测量抑菌带，计算抑菌率，最终筛选出拮抗效果最好的拮抗菌。抑菌率计算公式：抑菌率（%）=（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/对照病原菌菌落直径×100%。

改良pda固态培养基成分以g/l计为：马铃薯160～240g、葡萄糖10～20g、琼脂15～20g、胰蛋白胨5g、酵母粉2g、氯化钠5g、蒸馏水1l，ph自然。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)在生物防治墨兰根腐病中的应用。

本发明的有益效果包括以下几个方面。

1、本发明所述菌株对防治墨兰根腐病的效果好，对天麻的品质没有影响。

2、本发明所述菌株在对峙培养的第3天即可观察到墨兰根腐病病原菌受到抑制，在对峙培养的第5天观察到抑制现象更明显。

3、本发明所述菌株易于获得，培养时间短，有利于大规模生产和推广应用。

附图说明

图1为实施例1中枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)cpba-w01在lb培养基上，28℃培养48h的菌株菌落形态正反面图；

图2为实施例1中采用平板对峙法的枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)cpba-w01对墨兰根腐病病原菌(fusariumoxysporum)拮抗效果正反面图；

图3墨兰根腐病病原菌(fusariumoxysporum)纯培养正反面图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株分类命名为bacillussubtilissubsp.inaquosorum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日：2020年01月13日，保藏编号：19347，，所述枯草芽孢杆菌沙漠亚种属于细菌界，厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目、芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。

本发明所述的枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株的应用为所述的枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株在生物防治墨兰根腐病中的应用。

所述的高枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)在生物防治墨兰根腐病包括菌株活化与扩繁、生防效果测定步骤，具体包括：

a、菌株活化与扩繁：将所述的枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)接种到活化及扩繁培养基上，于28℃下培养3~5d得到活化与扩繁菌株；

b、生防效果测定：将墨兰根腐病病原菌(fusariumoxysporum)接种到改良pda培养基上，然后将a步骤制备得到的活化与扩繁菌株也接种到培养基上，在28℃下培养3~5d，观察抑菌效果。

所述的活化及扩繁培养基为lb培养基。

所述的生防效果测定是采用平板对峙法和滤纸片法测定。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

枯草芽孢杆菌沙漠亚种(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)cpba-w01的获得、鉴定与保藏。

（1）枯草芽孢杆菌沙漠亚种(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)cpba-w01的获得与鉴定。

本发明所述的枯草芽孢杆菌沙漠亚种(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)，是从攀枝花苏铁珊瑚状菌根内分离得到。样品采自四川省攀枝花市苏铁自然保护区，在4℃冷藏保存备用。

采用常规组织法分离攀枝花苏铁珊瑚状菌根内生细菌：用蒸馏水洗净珊瑚状菌根表面土壤后，将珊瑚根组织切成0.5cm×0.5cm的组织块，先用75%酒精消毒1min，然后用0.1%升汞溶液消毒5min，最后用无菌水漂洗3次。用无菌滤纸吸干多余水分后放置在lb培养基上，28℃培养48h。待菌落形成后，用无菌接种环挑出典型的单一菌落，在新的lb培养基，用划线法将菌株纯化。

lb固体培养基成分以g/l计为：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂20g、蒸馏水1l，ph7.2~7.5。

对上述分离的菌株cpba-w01，通过形态学鉴定和分子生物学鉴定，实验结果记录如下：

a、形态特征：菌株cpba-w01的菌落近圆形至不规则性，乳白色至黄色，边缘不整齐，光泽度稍差，菌落不透明，表面湿润粘稠；

b、16srdna序列分析：对菌株进行16srdna序列测定，以菌株cpba-w01的总dna为模板，在引物对27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')/1492r(5'-acggctaccttgttacgact-3')的引导下通过pcr扩增该菌株的16srdna片段，pcr反应体系为：2×powertaqpcrmastermix：12.5µl，模板dna：1µl，上游引物(10μmol/l)：1µl，下游引物(10μmol/l)：1µl，ddh2o：9.5µl，总体积：25µl。pcr反应程序：95℃预变性5min后，进入以下循环94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸10min，最后在pcr仪4℃存放。

将pcr产物送至昆明硕擎生物科技有限公司纯化测序，序列拼接后提交至ezbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/)中比对，比对结果表明，菌株cpba-w01与枯草芽孢杆菌沙漠亚种(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)(amxn01000021)16srdna序列的相似性达到99.92%。通过序列比对和形态特征将菌株cpba-w01鉴定为枯草芽孢杆菌沙漠亚种（bacillussubtilissubsp.inaquosorum）。本发明所述的菌株cpba-w01序列如序列表所示。

（2）枯草芽孢杆菌沙漠亚种(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)cpba-w01的保藏。

通过上述鉴定结果，确认菌株为枯草芽孢杆菌沙漠亚种(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)，编号命名为cpba-w01，于2020年01月13日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,简称：cgmcc。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080)。其保藏编号为19347。

实施例2

枯草芽孢杆菌沙漠亚种(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)cpba-w01菌株的筛选。

（1）菌株的筛选。

利用十字交叉法对拮抗菌进行初筛。具体操作如下：以墨兰根腐病菌(fusariumoxysporum)为指示菌，在改良pda培养基平板中心接种病原菌的6mm琼脂块，然后将分离培养得到的细菌单菌落等距离接种在距离病原菌2.5cm处，每皿接种4个菌株，设置5个重复，28℃恒温培养3~5d后，观察抑菌圈大小，挑选出拮抗效果最优的菌株。

（2）结果观察。

采取十字交叉法对分离到的菌株进行筛选，结果表明，对天麻腐烂病有拮抗作用的菌株有3株。

实施例3

枯草芽孢杆菌沙漠亚种(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)cpba-w01菌株的生防效果的测定。

（1）生防效果的测定。

对峙培养法：以墨兰根腐病菌(fusariumoxysporum)为指示菌，首先用6mm打孔器打取活化的病原菌琼脂块，置于平板上，然后采用点接法接种拮抗菌，两菌相距2.5cm，对照组只接种病原菌琼脂块，设置3个重复，28℃培养箱中培养3~5d，观察病原菌生长情况，测量抑菌带，计算抑菌率，最终筛选出拮抗效果最好的拮抗菌。抑菌率计算公式：抑菌率（%）=（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/对照病原菌菌落直径×100%。

（2）结果观察。

采用平板对峙培养法对筛选得到的菌株进行生防效果测定，3种拮抗细菌对墨兰根腐病病原菌有拮抗活性，且不同拮抗细菌对病菌菌丝的抑制效果具有一定差异。其中cpba-w01菌株的拮抗活性最强，且抑菌圈边界清晰，对墨兰根腐病病原菌的抑菌带为9mm，且达到显著性水平。虽然培养时间延长，但抑菌圈始终保持透明，说明该拮抗菌拮抗性能稳定。

实施例4

由枯草芽孢杆菌沙漠亚种(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)cpba-w01菌株的生防效果的测定。

（1）生防效果的测定。

滤纸片培养法：以墨兰根腐病菌(fusariumoxysporum)为指示菌，首先用6mm打孔器打取活化的病原菌琼脂块，置于平板上，将6mm无菌滤纸片放入发酵液中充分浸泡后取出置于平板上，滤纸片与病原菌各相距2.5cm，每个皿中放4片滤纸，对照组只接种病原菌琼脂块，设置3个重复，28℃培养箱中培养3~5d，观察病原菌生长情况，测量抑菌带，计算抑菌率。

（2）结果观察。

采用滤纸片培养法对筛选得到的菌株进行生防效果测定，3种拮抗细菌对墨兰根腐病病原菌有拮抗活性，且不同拮抗细菌对病菌菌丝的抑制效果具有一定差异。其中cpba-w01菌株的拮抗活性最强，且抑菌圈边界清晰，对墨兰根腐病病原菌的抑菌带为8mm，且达到显著性水平。虽然培养时间延长，但抑菌圈始终保持透明，说明该拮抗菌拮抗性能稳定。

sequencelisting

<110>西南林业大学

<120>一种枯草芽孢杆菌沙漠亚种菌株及其应用

<130>2020

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<170>patentinversion3.3

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<211>1202

<212>dna

<213>菌株cpba-w01的16srdna序列

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