对斜纹夜蛾高致病力的虫生真菌菌株及其应用

本发明涉及植物保护领域，具体涉及生物防治领域，尤其涉及斜纹夜蛾的生物防治中。
背景技术：
：根据公共信息(粮农组织，2015年)，从2000年到2015年，中国农药的使用总量增加了39.35％。目前，中国已成为世界上最大的农药生产国和消费国之一。分别是世界平均水平的1.5和4.0倍，现代农业中农药的广泛使用导致世界范围内河流和溪流的农业面源污染，威胁到饮用水资源和水生生态系统(jargentz,s.,mugni,h.,bonetto,c.,schulz,r.,2005.assessmentofinsecticidecontaminationinrunoffandstreamwaterofsmallagriculturalstreamsinthemainsoybeanareaofargentina.chemosphere61,817-826.)杀虫剂对鱼类，藻类和水生无脊椎动物的毒性也已有报道(li,h.,cheng,f.,wei,y.,lydy,m.j.,you,j.,2017.globaloccurrenceofpyrethroidinsecticidesinsedimentandtheassociatedtoxicologicaleffectsonbenthicinvertebrates:anoverview.j.hazardmater.324b,258-271)。随着化学农药长期大量的使用，带来的“3r”问题即害虫抗药性(resistance)、农药残留(residue)和害虫再猖厥(resurgence)以及环境污染问题越来越严重。因此，要改变使用化学农药为主的传统防治方式，贯彻“预防为主，综合防治”的植保方针，坚持农业防治为主、生物防治为基础，并结合其他防治措施对害虫进行综合治理的可持续建康发展具有极其重要的意义(杨运华,杜开书,石明旺.虫生真菌的生物防治研究进展[j].河南科技学院学报,2011,39(1):34-37)。虫生真菌以种类多、安全有效、应用期长、不伤害天敌、不易产生抗性及能快速大量生产等优点著称，在生物防治中有着无可比拟的反复侵染性和生产便利性。文献记载的虫生真菌有100多个属，800个种，已知的虫生真菌主要包括虫草属真菌、捕食性真菌和寄生线虫真菌，并不断有一些新种被发现。我国已报道的约405种，其中寄生昆虫的真菌215种(李月，姜春杰，赵宇鹰，等虫生真菌在林业害虫生物防治中的应用[j].植物保护，2016，10(20):10-24)。虫生真菌为农作物害虫的重要致病菌而广泛分布于自然界，据调查，野外越冬昆虫疾病中约60％都是由真菌引起，虫生真菌确实是虫口自然控制的重要因子和害虫防治的重要材料，在各种农林生态系统中有着重要的地位，对于维持生态系统的平衡起着不可或缺的作用，是ipm系统的重要组成部分(秦丽.绿僵菌和白僵菌防蝗菌株的分子鉴定及室内致病力测定[d].安徽农业大学,2013)斜纹夜蛾(spodopteralitura)属鳞翅目、夜蛾科，是一种间歇性发生的世界性害虫，在我国各地均有发生，华北地区年发生4～5代，长江流域5～6代，云南、广东、福建、台湾等地则全年均可发生，无越冬现象。幼虫危害猖獗，食性杂，可危害十字花科、茄科、葫芦科、豆科等99科290种以上的蔬菜和农作物(周晓梅，黄炳球.斜纹夜蛾抗药性及其防治对策的研究进展[j].昆虫知识，2002，39(2):98-102.)。由于斜纹夜蛾发生世代较多，寄主范围广泛，长期以来，人们使用各种化学药剂进行防治。农药的大量频繁使用，使该虫害对有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类及bt制剂等都产生了抗性(吴存兵.江淮地区斜纹夜蛾对杀虫剂的抗药性测定[j].安徽农业科学(20):5281-5282.)，导致生产上防治困难。此外，频繁地使用化学农药破坏了生态环境并威胁人类健康，斜纹夜蛾的生物防治越来越受到人们的关注。所以，寻求环境友好型防治策略极为迫切的今天，生物防治在害虫的防治工作中具有广阔的应用前景。另外，生物防治在生产过程中能够保障产品的质量安全，能有效的减少化学药剂的使用量。迄今为止，关于生物防治措施防治斜纹夜蛾害虫的研究已有不少报道。白僵菌(beauveria)因其较广的寄主范围、较强的致病性和适应性等特点，逐渐成为农林害虫生物防治中应用最为广泛的虫生真菌之一(季香云，杨长举.白僵菌的致病性与应用[j].中国生物防治学报，2003，19(2):82-85.)。首个以球孢白僵菌(beauveriabassiana)为主要有效成分的生物制剂二十世纪在美国注册登记(fengmg，popraweskitj,khachatouriansgg,etal.production,formulationandapplicationoftheentomopatho-genicfungusbeauveriabassianaforinsectcontrol:currentstatus[j].biocontrolscienceandtechnology，1994，4(1):3-34.)，而后各类白僵菌生物制剂不断涌现，目前全球以球孢白僵菌为有效成分的制剂占全部真菌杀虫剂的33.9％，我国已登记的11种真菌杀虫剂中有6种为球孢白僵菌产品(刘健,陈洪章,李佐虎.白僵菌杀虫剂生产工艺研究状况与展望[j].中国生物防治学报,2003,19(2):86-90.)。自2016年国家财政部、国土资源部、环境保护部联合发布《关于推进山水林田湖生态保护修复工作的通知》以来，农林病虫害的环保型防治管理日益受到重视。白僵菌制剂是一种无毒无味、无环境污染，对害虫具有持续感染力的生物农药，符合生态环保要求，常用于农林病虫害防治。目前，白僵菌已经广泛运用于二斑叶螨(tetranychusurticae)、烟粉虱(bemisiatabaci)、蓟马(frankliniellaocciden-talis)、亚洲玉米螟(ostriniafurnacalis)、思茅松毛虫(dendrolimuskikuchii)等农林害虫防治(阙生全,喻爱林,刘亚军,etal.白僵菌应用研究进展[j].中国森林病虫,2019,38(02):32-38.)。野生型白僵菌本身存在较大的异质性和较高的遗传多样性，对于不同的地理和寄主来源的菌株，其毒力和生物学特性存在较大差异。因此筛选出高毒力的菌株是利用球孢白僵菌生物防治害虫的重要基础。同时球孢白僵菌在实际应用中存在着杀虫效果慢，受环境影响大，效果不稳定的问题。甲维盐对昆虫具有超高效、低毒(制剂近无毒)、低残留、无公害等生物农药的特点。利用球孢白僵菌与甲维盐协同使用防治斜纹夜蛾，克服球孢白僵菌见效缓慢的问题，同时达到延缓害虫抗药性的作用，从而达到良好的杀虫效果。技术实现要素：本发明的目的在于湖南省永州市主产烟区烟田间斜纹夜蛾的生物防治这一农业生产的重要需求而研发，提供一株对斜纹夜蛾高毒力的球孢白僵菌菌株scauyz-16。该菌株对斜纹夜蛾有较优良的杀虫效果，其采自于湖南省永州市江华县涛圩镇烟田田间。为了获得斜纹夜蛾生物防治效果的优良菌株，对前期收集到的114株菌株，本发明人采用浸蘸法测定了其对斜纹夜蛾2龄若虫的毒力，由此来获得斜纹夜蛾致病的优良菌株。其中，实验发现不同属或者同种菌株对斜纹夜蛾的致病力都存在差异，因而有着不同程度的致病效果。根据本发明的实验结果，结合优良菌株筛选的指标综合考虑，其中致病力是衡量真菌菌株生物防治潜力的重要指标，而菌落或菌丝的生长速率则是评价优良昆虫病原真菌的另一个重要评价指标，菌株scauyz-16在108孢子/ml下对斜纹夜蛾二龄幼虫毒力达到70.71％，且其致病力相比其他供试菌株要更加稳定的菌株，具有较大潜力用于斜纹夜蛾的生物防治，因此菌株scauyz-16为斜纹夜蛾若虫致病的优良菌株，完成本发明。因此，本发明提供球孢白僵菌(beauveriabassiana)scauyz-16，其在pda平板上，26℃，培养10天，菌落直径65.45mm，产孢量1.438×108孢子/ml，孢子萌发率超过95％。如图1所示，菌落中间绒状，边缘粉末状，表面白色，背面橘黄色，有少量皱褶。孢子卵圆形和近球形。通过分子生物学进一步核实鉴定，其属于球孢白僵菌(beauveriabassiana)，已于2020年11月19日在广东省微生物菌种保藏中心进行保藏，其保藏编号是gdmccno：61300。相应地，本发明提供上述的球孢白僵菌在防治斜纹夜蛾中的应用。在应用时，所述球孢白僵菌以分生孢子的形式使用，优选以悬浮液或孢子粉的形式存在。应用时所述球孢白僵菌的终浓度为1×106～1×1010分生孢子/ml，优选为1×107～1×109分生孢子/ml。进一步地，在预测斜纹夜蛾将要发生时或发生初期施用的所述菌剂。本发明通过合理的实验方案，结合优良菌株筛选的指标综合考虑，筛选到对斜纹夜蛾具有优异的致病力的菌株scauyz16，108孢子/ml下对斜纹夜蛾二龄幼虫毒力达到70.71％，且其致病力相比其他供试菌株要更加稳定的菌株，具有较大潜力用于斜纹夜蛾的生物防治。利用所述菌株进行生物防治，可明显减低化学农药单剂的使用剂量、减少环境污染，有效解决现有农药易产生抗性、药效不明显等问题，具有较好的应用前景和推广价值。其中，本发明的球孢白僵菌(beauveriabassiana)scauyz-16，已于2020年11月19日在广东省微生物菌种保藏中心(地址：中国广东广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)进行了保藏，保藏编号是gdmccno：61300。附图说明图1scauyz-16菌落形态图。图2scauyz-16孢子形态图。图3分子鉴定中pcr扩增产物电泳图。图4系统发育树。具体实施方式下面通过本发明的研发过程和具体实施方式进行介绍，但不构成对本发明的限制。其中，斜纹夜蛾虫卵购于科云生物有限公司，采用人工饲料饲养于生物防治教育部工程研究中心的人工气候箱中继代繁殖形成斜纹夜种群。饲养条件为温度(27±1)℃，光周期l14:d10，相对湿度(75±5)％。实施例一、土壤样品的采集及真菌的分离与纯化采集土壤样品，采样时取表土下10～15cm处土壤100g左右，用塑料袋封装后带回实验室处理。土壤样品过筛去掉石粒和杂物，然后取净土10g悬浮于90ml0.1％的吐温80溶液中，摇匀，静置15min，取其上清液2ml稀释于8ml0.05％吐温80中，配制为土壤悬浮液。将0.1ml土壤悬浮液接种于孟加拉红琼脂培养基平板上，用三角玻璃刮子将悬浮液推匀于平板表面下，25℃培养3～7d，然后用接种环切取单菌落，接种于pda板上继续培养。共采集分离各种属菌株114株，对各菌株切取菌丝块移植于pda斜面，继续培养，4℃下保藏于冰箱中，供后续研究之用。其中从生长特性来初步判断，其中属于球孢白僵菌共9株，它们的具体采集地如下表；表19株球孢白僵菌的采集信息实施例二、高毒力菌株的筛选1、孢子悬浮液的配制取培养10-14天左右的所采集的虫生真菌在超净工作台内加入含0.5％吐温-80的蒸馏水刮除菌落，洗出平皿内的孢子，转移到灭菌的三角瓶中，使用恒温磁力搅拌器中速搅拌20min，使其均匀分散，配制成母液。按照10倍稀释法将菌液稀释100倍，显微镜下用血球计数板计数分生孢子数，5板重复。然后将分生孢子浓度稀释至1×108孢子/ml备用。2、分离纯化的菌株对斜纹夜蛾的毒力测定对经分离纯化的114株菌株进行毒力测定，采用浸蘸法，用毛笔将幼虫挑入浓度为1.00×108个孢子/ml的孢悬液中浸泡约5s，然后移入含饲料的培养皿中观察。用已灭菌的0.5％的吐温-80水作对照，每一个处理20头幼虫，每个处理3次重复。完成接种后，所有培养皿(直径为12cm)用保鲜膜封口并刺孔通气后置于生化培养箱中饲养，连续7d逐日定时观察记录，并及时将虫尸移出，虫尸置于26℃下保湿培养且根据斜纹夜蛾2龄幼虫尸体体表长出物特征确认有效致死，感病的虫尸即为僵虫实验结果显示，同一处理浓度，114株虫生真菌的致病力存在差异。当孢子悬浮液浓度为1×108孢子/ml时(表1中列出部分菌株作为示例)，处理7d，各菌株的致死率表现出显著差异，菌株的致死率由0至71.71％不等，其中菌株scauyz16、scaujh19、scauxt15，致死率达50％以上，菌株scauyz16的致死率最高为70.71％，菌株scauxx29、scausm010、scausm047、scaucz1的致死率在36.26％～43.15％，菌株scausm28等剩余菌株的致死率均低于26.50％，部分菌株对斜纹夜蛾二龄幼虫的致死率微弱未在表1中未列出。分离纯化的114株虫生真菌分别为不同的种属，其中包括球孢白僵菌、绿僵菌、虫草爪哇菌、淡紫拟青霉、青霉菌等，结果显示，不同的种属之间的菌株，其毒力效果存在着不同的差异，其中致死效果最好的菌株为球孢白僵菌scauyz16、scaujh19，致死率达到70.71％、57.84％，且高于其他菌株。表2显示，同一浓度下，9株球孢白僵菌的致病力存在差异，在孢子悬浮液浓度为1×108孢子/ml时，处理7d，八株菌株对斜纹夜蛾二龄幼虫的校正死亡率在17.31％-70.71％，其中菌株scauls1、scauls30、scauls112、scauls17、scaudx37、scauhn2，处理7d的校正死亡率不超过32％，其中菌株ls30校正死亡率最低只有17.31％，其余菌株校正死亡率均在25％左右。菌株scauyz16校正死亡率最高，达70.71％，其次是菌株scaujh19也达57.84％，且显著高于其他菌株，结合表1可知，相同浓度，不同菌株之间，毒力效果存在着差异，同时表明菌株scauyz16、scaujh19相较于其他菌株有较强的致病力。结果表明，菌株scauyz16、scaujh19对斜纹夜蛾二龄幼虫均有较好的致死效果，致病效果要明显优于其他菌株，属于潜在优良生防菌。因此，对该菌株开展进一步的研究。表1分离纯化的各菌株1×108孢子/ml的孢子悬浮液对斜纹夜蛾二龄幼虫的致死率注：经tukey检验，同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著(p＜0.05)。表21×108孢子/ml的孢子悬浮液对斜纹夜蛾二龄幼虫的校正死亡率注：经tukey检验，同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著(p＜0.05)。实施例三、菌株scauyz-16的毒力进一步分析1、对高毒力的菌株进行浓度梯度分析将筛选出的毒力效果好的菌株scauyz-16，取其孢子粉，配制成浓度为1.00×108个孢子/ml的孢悬液并按一定梯度稀释，最终稀释浓度为1.00×108个孢子/ml、1.00×107个孢子/ml、1.00×106个孢子/ml、1.00×105个孢子/ml、1.00×104个孢子/ml的孢子悬液，采用浸蘸法测定出不同浓度下球孢白僵菌菌株scauyz-16对斜纹夜蛾2龄幼虫的死亡率。根据浓度与死亡率的关系建立回归方程，确定lc50。斜纹夜蛾2龄幼虫的死亡率、校正死亡率计算公式如下：死亡率(％)＝×100校正死亡率(％)＝×100。不同浓度的球孢白僵菌孢子悬浮液侵染斜纹夜蛾二龄幼虫7d后的死亡率见表3。结果显示，孢子浓度低于1×106孢子/ml时，球孢白僵菌对斜纹夜蛾二龄幼虫的致死率低于5％，孢子浓度为1×107孢子/ml致死率为20％，孢子浓度为1×108孢子/ml致死率为53.33％，随着孢子浓度的升高，对斜纹夜蛾的致死率也随之升高。该菌株对斜纹夜蛾二龄幼虫的致病力回归分析见表。从表3可看出，致病力回归方程拟合程度显著水平均大于0.05，各菌株回归方程相关系数为0.877，表明不同浓度下菌株scauyz-16对斜纹夜蛾二龄幼虫侵染致死率所求的回归方程是合适的。菌株scauyz-16对斜纹夜蛾的lc50为8.09×107孢子/ml-1。表3不同浓度的孢子悬浮液对斜纹夜蛾二龄幼虫的校正死亡率表4菌株scauyz-16对斜纹夜蛾二龄幼虫致病力的回归方程菌株致病力方程lc50/ml-1`95％置信区间rscauyz16y＝-6.528+0.868x3.29×1071.91～6.560.949实施例四、菌株scauyz-16的鉴定1、菌株scauyz-16的生物学特征观察马铃薯葡萄糖培养基的制作：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1000ml水，将纯化的菌株接种至pda培养基上培养7-10d，观测菌落正面和背面的颜色、质地、大小、高度、表面饰纹、边缘、渗出物等并拍照。菌落生长速率的测定：将纯化的白僵菌株接种至pda平板上，放入26℃培养箱中培养7-10d备用，使用5mm的打孔器在培养好的培养基上打孔，然后接种至新的pda平板中，用封口膜封住，放入26℃恒温培养箱中培养，重复5次。采用十字交叉法测量菌落直径并记录，计算日均增长量。产孢量的测定：在超净工作台中用移液枪移取500μl配制好浓度为1×104孢子/ml的孢子悬浮液接种于90mm培养皿平板上，匀速转动培养皿，使液体均匀分布培养基表面后，用封口膜封口，放入26℃的培养箱中恒温培养，5次重复。培养15天后，用10mm的打孔器，取培养基中生长均匀的菌落5处，加入20ml0.5‰吐温-80溶液中，使用恒温磁力搅拌器中速搅拌20min，配成孢子悬浮液。用血球计数板测定含量。孢子萌发率的测定：取1ml浓度为1×105孢子/ml浓度孢子悬浮液分别加入10mlsdy培养基中，在26℃，220r/min条件下培养24h，5次重复。吸取适量菌液滴在载玻片上，置于显微镜下，观察并记录孢子的萌发情况，芽管长度大于或等于孢子直径的孢子视为萌发，每处理单次镜检不少于50个孢子，重复镜检5次。计算公式为：孢子萌发百分率(％)＝(视野中萌发孢子个数/视野中孢子总数)×100。实验结果表明，在pda平板上，26℃，培养10天，菌落直径63.75mm，产孢量1.57×108孢子/ml，孢子萌发率超过90％，其菌落直径、产孢量显著高于菌株scauyz16。菌落或菌丝的生长速率以及菌株的产孢量是评价优良昆虫病原真菌的一个重要评价指标，较快的生长、产孢特性有利工业大规模发酵生产。菌株scaujh19在108孢子/ml下对斜纹夜蛾若虫有较高的致病力，综合菌株的菌落生长速率及产孢量考虑，菌株scaujh19为斜纹夜蛾若虫致病的优良菌株。如图1所示，菌落中间绒状，边缘粉末状，表面白色，背面橘黄色，有少量皱褶。孢子卵圆形和近球形(如图2所示)。表5部分菌株的菌落直径、产孢量及孢子萌发率2、分子生物学鉴定针对纯化菌株scauyz-16进行分子生物学鉴定。采用ctab法提取dna，包括以下步骤：(a)将球孢白僵菌菌株scauyz-16在pda平板上培养一周后，小心刮取菌丝体于研钵中，加入液氮迅速充分研碎；(b)取适量研碎的菌丝体迅速转移到离心管中，加入300μl经65℃预热的dna提取液裂解液，充分混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液混匀，65℃下水浴1h，10min左右轻轻震荡一次，12000rpm常温条件下离心5min；(c)缓慢吸取上清液于另一新离心管中，缓慢加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液进行再次抽提，12000rpm常温条件下离心5min；(d)缓慢吸取上清液于另一新离心管中，加入1/10体积的醋酸钠，等体积预冷的异丙醇，室温静止15min；(e)加入70％乙醇洗涤沉淀2次；(f)移液枪紧贴管壁缓慢吸出乙醇，置于超净工作台内吹干；(g)所得沉淀溶于50μl的te中；(h)用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余提取物置于-20℃条件下保存。真菌dna的pcr所用引物为通用引物：b5.1f：5’-cgacccggccaactactttga-3’和b3.1r：5’-gtcttccagtaccactacgcc-3’。扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。50微升反应体系如下：pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(含eb)，缓冲液为1×tae，电压150v、电流220ma，markerdl2000作为分子量标准参照物，电泳结束后，在凝胶成像仪上检测并拍照记录。特异性pcr产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。序列比对与发育树构建：测序结果用blast搜索同源性较高的相关序列，使用mega5.1软件中的clusterw进行序列比对和多重序列比对。并在该软件中构建neighbour-joining(nj)系统发育树。实验结果表明，(1)如图3所示，每个泳道的电泳条带比较清晰，可以根据pcr产物的迁移距离来准确判断该菌株的基因片段约为600bp左右，其中泳道4为scauyz-16菌株。(2)将得到的该菌株基因型的its序列和从genbank下载的4株白僵菌菌相关序列组合，构建分子系统树，结果如图4所示，scauyz-16菌株属于beauveriabassiana，为球孢白僵菌。综合形态学特征与生理生化特性鉴定结果显示，该scauyz-16菌株最终确定属于球孢白僵菌属。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12