一个基因kt526在提高植物耐逆性能上的应用
技术领域
1.本发明涉及植物耐逆性相关的基因与其应用，特别涉及来源于水稻的与抗逆相关的基因kt526在提高植物耐冷性中的应用。
背景技术：
2.水稻、玉米和小麦是我国重要的粮食作物，三大作物的产量、品质对于我国的粮食生产和粮食安全都至关重要。干旱、盐碱、高温和冻害等非生物逆境会直接影响粮食作物的正常生长和产量。利用现代农业生物技术，如转基因技术培育具有耐逆性和广泛适应性的农作物新品种，可以使农作物在逆境条件下保持稳定高产。随着转基因研究的深入，已经陆续分离克隆了一些与抗逆相关的基因，包括代谢过程中的关键调控基因、渗透调节蛋白、小分子物质，还有参与调控各种逆境应答途径的转录因子等。
3.转录因子是调控基因表达的关键基因，对作物的生长发育起着重要的调节作用。多年以来，转录因子的克隆和功能研究一直是科学研究的热点之一，科学家们利用不同的研究路线分离鉴定了大量的转录因子，也从中发现了一些与农艺性状相关的调控因子，为农作物的性状改良提供了重要基因资源。在水稻基因组测序工作完成后，许多数据库对水稻基因组进行了分析。据预测，在籼稻和粳稻中分别包含2,025个 和 2,384 个转录因子，分属于 63 个转录因子基因家族，如wrky（111/113，籼稻/粳稻）、bzip（88/109）、ap2/erebp（174/182）、aux/iaa（30/46）、myb（136/138）、hb（84/103）等。根据以往的文献报道与数据库的功能注释，这里既包含植物所特有的转录因子家族，如wrky，也包含与植物生长发育、抗逆性等密切相关的其它一些转录因子家族，如bzip、ap2/erebp、myb等。利用这些数据库，结合基因芯片杂交、est序列等基因表达信息，从基因组水平预测和分离水稻转录因子全长cdna，并利用已经建立的高效的水稻转化系统使其在水稻中过量表达，对其进行规模化功能验证，进一步通过研究转基因水稻的表型变化及抗逆性能的改变等推断转录因子的功能；在大量的重复性的植物转化、表型分析、功能鉴定等工作的基础上，寻找在改良农作物中具有实用价值的植物重要调节因子，并应用于作物的性状改良，对有效解决农业生产中的实际问题，具有重要的理论意义和应用价值。
技术实现要素：
4.本发明的目的是提供一个与耐逆性相关的水稻基因kt526，以用于提高植物的耐逆性能。
5.本发明所提供的与耐逆性相关的kt526基因，来源于稻属水稻（oryza sativa l.），编码具有下述氨基酸序列的蛋白质：1）序列表中的seq id no：1；序列表中的seq id no：1 由334个氨基酸残基组成，为蛋白kt526。
6.本发明中kt526的编码基因既可为所述基因的cdna序列，也可为所述基因的基因组dna序列，或者是与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的dna序列。具有
seq id no：1所示氨基酸序列的编码基因，可以具有序列表中seq id no：2所示的核苷酸序列。
7.含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
8.扩增kt526任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
9.本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将编码本发明与耐逆性相关的kt526基因导入植物组织、细胞或器官，植物耐逆性获得提高。
10.在上述提高植物耐逆性的方法中，本发明中水稻与耐逆性相关的kt526基因既可为所述基因的cdna序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的dna序列，是将所述基因的cdna或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用（例如，反义或共抑制技术）中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。
11.本发明水稻与耐逆性相关kt526基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pbin系列载体（如pbin 19等）、pbi系列载体（如pbi 101等）、gateway
tw
系列载体（如ph2gw7等）、pcambia系列载体（如pcambia 3301等）、per8、px6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如penter-topo、puc系列载体或pbluescript系列载体等。
12.使用本发明中水稻与耐逆性相关的kt526基因或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型（aba、干旱、盐碱或化学诱导等）启动子。所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒（camv）35s启动子，玉米ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2s1启动子（genbank号：nm_118848.2，gi:30687489）和napina（genbank号：m64633.1，gi:349405）启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、aba、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子和/或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
13.为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（gus基因、gfp基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（新霉素磷酸转移酶(nptii)基因、潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase）基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。所述含新霉素磷酸转移酶(nptii)
基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如g418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase）基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用southern、pcr或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。
14.其中，本发明以pcambia1300为出发载体，构建的含有本发明水稻与耐逆性相关的kt526基因的植物表达载体命名为pcactf-kt526。携带有本发明水稻与耐逆性相关的kt526基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(ca
2+
、peg)、ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。
15.此外，通过将转化有本发明水稻与耐逆性相关的kt526基因或其同源序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的耐逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。
16.本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。
17.本发明提供了一个与耐逆性相关的基因kt526。实验证明，将本发明的基因转化水稻可提高水稻对低温耐受性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物（特别是禾谷类作物）的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
18.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
19.图1为表达载体pcactf的t-dna区图谱。lb和rb分别为t-dna的左边界和右边界；hyg表示潮霉素抗性；p35s表示camv35s基因的启动子；camv35s ter表示camv35s基因的终止子；pact1表示actin基因的启动子；3flag表示3倍的flag标签序列；ocs表示ocs基因的终止子；hindiii、kpni、spei 、xbai、sali和psti分别表示限制性内切酶的酶切位点。
20.图2 为kt526转基因株系的耐冷性分析：a为冷处理前苗生长状态；b为冷处理5天苗生长状态；c为恢复培养一周后苗生长状态；d为冷处理后的苗存活率统计。
21.图3 为kt526转基因株系大田耐冷性分析：a为苗低温生长35天的状态；b为苗低温生长49天的状态；c为苗生长35天时的株高统计。
22.具体实施方式
23.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京华大基因完成，pcr试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自
宝生物工程有限公司，peasy-t1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，t4 dna连接酶购自promega公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pcactf由本实验改造所得，基本骨架来自于cambia公司的pcambia1300。
24.、kt526基因的分离从kt526基因的编码起始位点atg开始设计5’端引物，于终止密码处设计3’端引物：引物1：5
’ꢀ
tctagaatgtgtggaggcgccatcctc 3’引物2：5
’ꢀ
ctgcagtcagaaaagggcgccgtcgattg 3’引物1中tctaga序列为限制性内切酶xbai的酶切位点，下划线标识的序列为kt526基因的编码序列；引物2中ctgcag序列为限制性内切酶psti的酶切位点，下划线标识的序列为kt526基因的编码序列。引物1的序列如seq id no：3所示，引物2的序列如seq id no：4所示。
25.提取幼苗期的日本晴水稻的总rna，通过反转录得到cdna作为模板，用以上引物扩增kt526基因的全长，其大小为1005bp，其核苷酸序列如序列表中seq id no：2所示，所编码的蛋白质氨基酸序列如序列表中的seq id no：1所示。
26.具体反应为：取约2μg的总rna，加入1μl 10
×
dnase buffer，1μl的dnase，补depc处理过的水至10μl体系，混匀，37℃温育30min后，加入1μl的rq dnase stop solution, 65℃温育10min以终止反应后，加入2μl oligo(dt)18 primer(0.1μg/μl)， 4μl 5
×ꢀ
first-strand buffer，1μl ribonuclease inhibitor(40u/μl)， 2μl 4
×
dntp(各10mm)，1μl mmlv reverse transcriptase (200u/μl)，小心混匀，37℃保温1小时。然后90℃处理5分钟，冰上冷却，离心收集即获得相应的反转录产物cdna。将得到的cdna稀释10倍，取1μl作为pcr反应的模板，上、下游引物(10μm)各1μl，la taq酶(5u/μl )0.5μl，4
×
dntps(各10mm) 1μl，2
×
gc buffer(mg
2+
) 25μl，h2o 20.5μl。pcr反应条件为预热95℃ 5min，变性94℃ 1min，退火56℃ 30sec，延伸72℃ 1min，50sec，34个循环。反应结束后，对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得了大小分别与预期结果相符的dna片段。分别回收并纯化上述片段，将其连接入载体peasy-t1(全式金公司)中，通过热激法转化大肠杆菌（e. coli）top10菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/l壮观霉素的lb液体培养基中，37℃、200rpm 的摇床中培养12-16小时，提取质粒，分别得到含有目的片段的重组质粒，测序验证正确后，用xbai和psti 双酶切切下目的片段kt526, 连入进行相同双酶切的pcactf植物表达载体，构建得到载体pcactf-kt526。挑取菌落pcr鉴定为阳性的菌落进行测序验证。植物表达载体pcactf的t-dna区图谱如图1所示。
27.、kt526转基因水稻的获得用农杆菌介导法将按具体实施方式1获得的与耐逆性相关的基因kt526转化水稻，具体方法如下：1）转化农杆菌利用热激法将上述重组载体pcactf
‑ꢀ
kt526转入农杆菌agl0菌株（中国科学院遗传所赠送），利用农杆菌对水稻进行共转化。
28.2）侵染水稻愈伤组织挑取步骤1）获得的阳性重组农杆菌的单菌落接种于卡那霉素50mg/l和利福平
50mg/l的20ml yeb液体培养基中，在28℃、150rpm下振荡培养2-3天，再于4℃、5000rpm离心3分钟，去上清，将菌体沉淀重悬于含0.1mmol/l 乙酰丁香酮的aa培养基(co(n03)2·
6h2o 0.15mg/l，cacl
2 110mg/l, mgso
4 122mg/l, ki 3.75mg/l，nah2po4·
h2o 150mg/l，na
2-edta 0.01mm， feso4·
7h2o 139mg/l，kcl 2.95g/l，mnso4·
4h2o 84.5mg/l，znso4·
7h2o 6.25mg/l，h3bo
3 5mg/l， gly 37.5mg/l，cuso
4 0.005mg/l，na2moo4·
2h2o 1.25mg/l，盐酸硫胺素vb
1 5mg/l，烟酸 5mg/l，盐酸吡哆醇vb
6 5mg/l，肌酸 0.1g/l，酪蛋白水解物 0.3g/l，l-gln 87.6mg/l，l-asp 26.6mg/l，蔗糖20g/l)中，在28℃下避光振荡培养1-2小时至od
600
=0.6-0.9。挑选按常规植物组织培养方法获得的水稻中花11的生长状态良好、颗粒状愈伤组织浸入上述转化有pcactf-kt526的重组农杆菌培养液中摇动20分钟后，静置30分钟，取出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于n6共培养基（n6培养基+10g/l 葡萄糖+1mg/l乙酰丁香酮+2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d）2mg/l）上培养，其中n6基本培养基的配方为(nh4)2so
4 0.46g/l，kno
3 2.83g/l，cacl
2 0.2g/l，mgso
4 0.092g/l，kh2po
4 0.4g/l，na
2-edta 0.15g/l， feso4·
7h2o 0.11g/l， mnso4·
4h2o 0.44g/l，znso4·
7h2o 0.17g/l，h3bo
3 0.14g/l，cocl2·
6h2o 0.0005g/l，cuso4·
5h2o 0.0005g/l，na2moo4·
2h2o 0.005g/l，盐酸硫胺素vb
1 0.01g/l，烟酸 0.001g/l，盐酸吡哆醇vb
6 0.001g/l，肌酸 0.1g/l，酪蛋白水解物 0.3g/l，l-pro 0.5g/l，蔗糖30g/l，琼脂 10g/l，ph5.8。2-3天后，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，然后在含500mg/l头孢霉素的无菌水中浸泡30-60分钟，最后再用无菌水冲洗1遍，置于无菌滤纸上晾干，最后转入筛选培养基（n6基本培养基+2,4-d 2mg/l+头孢霉素250mg/l）筛选。
29.3）阳性转基因水稻的获得将侵染后的水稻愈伤组织于n6共培养基中共培养3-5天后，转至含50mg/l 潮霉素和400mg/l头孢霉素的n6固体培养基（n6大量元素+b5微量元素+b5有机成分+300mg/l水解酪蛋白+500mg/l脯氨酸+30g/l蔗糖+7-8g/l琼脂，ph 5.8）上筛选3周，再转入含50mg/l潮霉素和200mg/l头孢霉素的n6固体培养基上筛选4周，随后将抗性愈伤组织转入预分化培养基（n6培养基+1mg/l奈乙酸+2mg/l 6-苄基氨基嘌呤+5mg/l脱落酸），光照培养3周，再转入分化培养基（n6培养基+1mg/l奈乙酸+2mg/l 6-苄基氨基嘌呤）上进行分化，将生长出的再生植株在壮苗培养基(1/2 ms 无机盐+0.5mg/l奈乙酸+0.25mg/l多效唑)上进行生根培养后移至温室中，在28℃、15小时/天的光照下培养1个月后取植株叶片，按常规方法提取总dna，在正向引物5
’‑ꢀ
actcaccgcgacgtctgt
ꢀ‑3’
和反向引物5
’‑ꢀ
ttcctttgccctcggacg
ꢀ‑3’
的引导下，pcr扩增潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得1009 bp dna片段的为阳性转基因植株，检测结果表明用上述方法获得了转化有pcactf
‑ꢀ
kt526的转基因水稻。
30.、kt526转基因t1代植株的耐冷性分析收获kt526的t1代转基因水稻种子，选取6个以上的株系进行低温胁迫。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/l潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的kt526 的t1转基因株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10株，三个重复。培养至三叶期（第3片叶完全舒展），其生长状态如图2a。开始4℃冷筛，当对照新叶、老叶全卷后1至2天（图2b），重新正常培养，期间三角瓶中的营养液2天更换一
次，以保持营养液的新鲜状态。低温筛选后恢复培养一周后如图2c所示，转空载体对照株系大部分都已发黄、萎蔫、死亡，而转基因植株表现出很强的低温耐受力和恢复能力，恢复一周后的存活率统计如图2d所示，转基因株系的存活率均比对照要高。
31.此实验说明kt526基因具有增强水稻耐受低温的能力。
32.、kt526转基因t2代植株的大田耐冷性分析除上述的筛选外还进行了大田土壤低温筛选，选取6个以上的株系进行大田耐低温筛选。选择具有单位点插入的kt526 的t2转基因株系，将其播种至大田，完全自然条件下生长，生长期间日最低地温变化幅度为4℃-15℃。 生长至35天时，kt526转基因株系生长状态良好，茎秆粗壮，叶片发绿，分蘖增多且株高明显高于对照株系（图3a）。统计此时株高变化如图3c所示。低温生长至49天时，对照植株叶片变黄、枯干，生长缓慢，而kt526转基因株系正常生长（图3b）。上述结果显示t2代转基因水稻植株对低温的耐受能力明显高于未转基因水稻植株。
33.此实验表明，kt526基因具有增强水稻耐冷性的作用。