1.一种兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
将兔碎肌肉组织置于含有胶原蛋白酶xi的基础培养基中孵育消化;
将兔肌肉干细胞采用percoll浓度梯度90%,55%,40%,35%,27.5%进行纯化。
2.如权利要求1一种兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)兔肌肉干细胞的提取:
s1:选取幼兔,处死,将在无菌环境下兔解剖,除菌处理获得兔肌肉组织;
s2:将s1获得的兔肌肉组织切碎,去除脂肪、血管、结缔组织,得到碎肌肉组织;
s3:将s2获得的碎肌肉组织置于含有抗生素和胶原蛋白酶xi的dmem培养液中孵育消化,直到达到消化终点获得消化混合物;
s4:向s3获得的消化混合物加入pbs缓冲液,混合均匀并离心,收集沉淀,加入胰蛋白酶液进行二次消化获得消化混合物;
s5:向s4获得的消化混合物加入胎牛血清终止消化,加入含有胎牛血清的pbs缓冲液,得到含有肌肉干细胞的单核细胞群悬浮液;
s6:将s5所述悬浮液混合均匀,过滤,离心收集沉淀;将细胞重悬,并再次通过滤网过滤,离心,弃去上清得到细胞沉淀;
(2)兔肌肉干细胞的纯化:
s7:将s6获得的细胞用基础培养基重悬,采用权利要求1所述的percoll浓度梯度对细胞进行纯化得到细胞沉淀;
(3)兔肌肉干细胞培养和诱导分化:
s8:将s7获得的兔肌肉干细胞重悬于完全培养基中,接种在铺好matrigel的胶板中,30-40℃、1-10%co2条件下进行培养。
3.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法,其特征在于,s1所述除菌处理为将去除内脏的整只兔子在70-75vol%乙醇中浸泡1-5min,保存在含有抗生素的pbs缓冲液中。
4.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法,其特征在于,s2所述碎肌肉组织是将兔的肌肉组织切碎至0.5-1.5mm3。
5.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法,其特征在于,权利要求1所述胶原蛋白酶xi的质量体积浓度为0.1-0.5%,碎肌肉和胶原酶液的质量体积比例为1:2-1:5。
6.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法,其特征在于,权利要求2所述消化的终点为消化混合物顺畅通过10-16g的注射器针头。
7.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法,其特征在于,s4所述胰蛋白酶的质量体积浓度比例为0.1-0.5%,碎肌肉和胶原酶液的质量体积比例为1:2-1:5。
8.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法,其特征在于,权利要求1所述的percoll梯度纯化,按从高到低的浓度将2mlpercoll溶液缓慢加入容器中,在最上层加入细胞悬液,离心,从55%和40%之间的界面层获得单核细胞,加入5倍体积的pbs缓冲液重悬,离心,去除上清;重复操作,收集细胞沉淀。
9.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法,其特征在于,s7所述的基础培养基包括5-15vol%胎牛血清、1vol%青霉素-链霉素双抗的dmem培养基;s8所述的完全培养基包括5-25vol%胎牛血清、1vol%青霉素-链霉素-两性霉素b三抗的dmem培养基。
10.权利要求1-9任一所述兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法在动物细胞肉培养、干细胞研究中的应用。