一种可用于陈年道菜发酵的微生物菌剂的制作方法

本发明属于食品
技术领域：
，尤其涉及食品领域中特色菜的制备，具体为一种可用于陈年道菜发酵的微生物菌剂。
背景技术：
：陈年道菜是贵州镇远县的一种特色干态盐渍菜，已经有500多年的历史，相传为明代青龙洞“道人”所创始，遂称为“道菜”，曾为进奉皇室的贡品，1980年被评为黔东南自治州优质产品。由于此菜储藏愈久，品质愈佳，因而又称“陈年道菜”。此菜具有清香、味美、开胃等优点，富含氨基酸、还原糖、粗蛋白、钙、磷、铁等营养成分。陈年道菜是以当地棒菜(茎用芥菜)为原料，经过原料处理、日晒脱水、搓揉入味、盐渍发酵、白酒浸泡等10多道工艺，至少发酵贮藏3年后才可作为成品销售。目前，陈年道菜的生产仍以传统的家庭式或作坊式的自然发酵为主，发酵周期太长，原料表面附带的一些大肠杆菌、假单胞菌等不友好微生物快速生长，且长期存在于陈年道菜中，会导致亚硝酸盐、生物胺等不断形成并积累，存在一定的安全隐患。陈年道菜在入坛发酵前需要对原料反复搓揉使其质地变软，费时费力，发酵成熟后还需用白酒浸泡，而该工序主要依靠经验操作，会导致不同批次产品的口味很难统一，且酒味浓烈难以让外地消费者接受。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种可用于陈年道菜发酵的微生物菌剂。采用该菌剂发酵陈年道菜，可快速增加陈年道菜酸类、醇类等滋味物质，阻断亚硝酸盐和生物胺的积累，还可分解原料中的纤维素、果胶等物质，使其质地快速变软，省去了反复揉搓、外添白酒等工序，提升了陈年道菜的品质及食用安全性。为了实现以上发明目的，本发明的具体技术方案为：一株植物乳杆菌lactobacillusplantarum，已于2017年6月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc.no60196，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，制备含有该菌的微生物菌剂，用于陈年道菜发酵。一株短乳杆菌lactobacillusbrevis，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.12792，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，制备含有该菌的微生物菌剂，用于陈年道菜发酵。一株菌kazachstaniaexigua，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.12791，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，制备含有该菌的微生物菌剂，用于陈年道菜发酵。作为本申请中一种较好的实施方式，前面所述的微生物菌剂为固体菌剂，且含有植物乳杆菌lactobacillusplantarum、短乳杆菌lactobacillusbrevis和kazachstaniaexigua中的任意一种或两种，并用于陈年道菜发酵，菌剂中每一种菌的活菌数≥1-5×109cfu/g以上。作为本申请中一种较好的实施方式，该菌剂含有植物乳杆菌lactobacillusplantarum、短乳杆菌lactobacillusbrevis和kazachstaniaexigua，菌粉的质量比为5：3-1:2-4，菌剂中每一种菌的活菌数≥1-5×109cfu/g。作为本申请中一种较好的实施方式，用于陈年道菜发酵时，微生物菌剂的添加量为原料总质量的0.1-0.3％。一种陈年道菜的制备方法，该方法中采用可前述所述的菌剂，具体方法包括以下步骤：1)选料，选择新鲜无腐败的成熟棒菜为原料，除去杆状部位的茎皮，用清水洗净后滤干；2)将步骤1)处理后的棒菜用刀切成小块，加入食用盐和菌剂，充分拌匀后置于容器中，密闭发酵45-55h；3)将步骤2)发酵后的棒菜从容器中捞出，弃掉容器中的液体，晾晒使原料的含水量为60-70％，再加入菌剂，充分拌匀后置于容器中密闭发酵1个月，发酵结束后即为成品。作为本申请中一种较好的实施方式，步骤2)中食盐的添加量为原料质量的8-12％。作为本申请中一种较好的实施方式，步骤2)和步骤3)中菌剂的添加量相等，均为原料质量的0.05-0.15％。作为本申请中一种较好的实施方式，菌剂中含有植物乳杆菌lactobacillusplantarum，该菌剂的制备方法为：取100ul的lactobacillusplantarum的菌株保藏液，于10ml的mrs肉汤中37℃培养12-18h；将培养得到的菌液按总体积3％分别接入扩培培养基中继续培养。其中，lactobacillusplantarum的扩培培养基成分为：葡萄糖2.5-3.0％，酵母粉0.3-0.6％，牛肉膏0.5-1.0％。培养条件为：培养基初始ph6.0-6.5，培养温度30-35℃，摇床转速80-100r/min，培养时间为12-16h；扩培后的培养液，置于温度为4℃，转速为4000r/min的条件下离心20min，获得菌泥，加入保护剂，以质量计，保护剂与菌泥的比例关系为1∶2-3，真空冷冻干燥得到菌粉。其中，保护剂包括以下重量份的原料：脱脂奶粉9份,海藻糖2份,甘油0.6份,山梨醇2.5份,麦芽糊精1.2份；干燥温度-60至-50℃，真空度1pa，时间30-35h，冷冻干燥后分别制成粉剂。作为本申请中一种较好的实施方式，菌剂中含有短乳杆菌lactobacillusbrevis，该菌剂的制备方法为：取100ul的lactobacillusbrevis的菌株保藏液，于10ml的mrs肉汤中37℃培养12-18h；将培养得到的菌液按总体积3％分别接入扩培培养基中继续培养。其中，lactobacillusplantarum的扩培培养基成分为：葡萄糖2.5-3.0％，酵母粉0.3-0.6％，牛肉膏0.5-1.0％。培养条件为：培养基初始ph6.0-6.5，培养温度30-35℃，摇床转速80-100r/min，培养时间为12-16h；扩培后的培养液，置于温度为4℃，转速为4000r/min的条件下离心20min，获得菌泥，加入保护剂，以质量计，保护剂与菌泥的比例关系为1∶2-3，真空冷冻干燥得到菌粉。其中，保护剂包括以下重量份的原料：脱脂奶粉9份,海藻糖2份,甘油0.6份,山梨醇2.5份,麦芽糊精1.2份；干燥温度-60至-50℃，真空度1pa，时间30-35h，冷冻干燥后分别制成粉剂。作为本申请中一种较好的实施方式，菌剂中含有kazachstaniaexigua，该菌剂的制备方法为：吸取100ul的kazachstaniaexigua的菌株保藏液，于10ml的ypd液体培养基中28℃培养20-24h。将上述培养的菌液按总体积3％分别接入扩培培养基中继续培养。kazachstaniaexigua的扩培培养基成分为:蛋白胨1.0-1.5％，酵母浸出粉0.5-1.0％，蔗糖12-16％。培养条件为：培养基初始ph4.5-5.0，培养温度28-32℃，摇床转速80-100r/min，培养时间为15-18h。扩培后的培养液，置于温度为4℃，转速为4000r/min的条件下离心20min，获得菌泥，加入保护剂，以质量计，保护剂与菌泥的比例关系为1∶2-3，真空冷冻干燥得到菌粉。其中，保护剂包括以下重量份的原料：脱脂奶粉9份,海藻糖2份,甘油0.6份,山梨醇2.5份,麦芽糊精1.2份；干燥温度-60至-50℃，真空度1pa，时间30-35h，冷冻干燥后分别制成粉剂。而如果菌剂中含有以上三种菌种的任意两种或同时含有三种时，则将单独制备得到的菌粉按比例混合即可。作为本申请中一种较好的实施方式，同时含有三种菌粉的菌剂，菌种lactobacillusplantarum得到的菌粉，lactobacillusbrevis得到的菌粉与kazachstaniaexigua得到的菌粉的质量比为5：3-1:2-4。与现有技术相比，本发明的积极效果体现在：(一)目前，陈年道菜的生产仍以传统的家庭式或作坊式的自然发酵为主，还未见使用菌剂调控发酵的报道。原料处理后放入缸中密封发酵，至少发酵贮藏3年后才可作为成品销售。陈年道菜发酵周期太长，导致了难以规模化生产加工。本申请添加在生产工艺中添加菌剂，可缩短陈年道菜的发酵成熟周期，快速积累酸类、醇类等滋味物质，提升了道菜的风味。(二)在自然发酵过程中，原料表面附带的一些大肠杆菌、假单胞菌等不友好微生物快速生长，且长期存在于陈年道菜中，会导致亚硝酸盐、生物胺等不断形成并积累，存在一定的安全隐患。本发明采用的复合菌剂可快速生长代谢产生酸类、醇类等，丰富风味，且使陈年道菜的ph值迅速下降，抑制不友好微生物的生长，阻断亚硝酸盐和生物胺的积累，提升了陈年道菜的品质及食用安全性。(三)陈年道菜在入坛发酵前需要对原料进行处理，通过反复搓揉使其质地变软，其工序较为复杂，且费时费力，不利于规模化生产加工。陈年道菜发酵成熟后，还需用白酒浸泡，增添其酒香味，但该工序主要依靠经验操作，导致不同批次产品的口味很难统一，且酒味浓烈难以让外地消费者接受。本发明的复合菌剂可在陈年道菜发酵阶段分解原料中的纤维素、果胶等物质，使其质地快速变软，省去了反复揉搓的工序；同时还能产生适量乙醇，省去使用白酒浸泡的工序，风味更容易让消费者接受。附图说明图1为实施例中各样品的感官评定结果图图2为实施例中样品1、样品2和空白样品中酸类和醇类的含量柱状图。图3为实施例中样品1、样品2和空白样品中生物胺的含量柱状图。具体实施方式一种可用于陈年道菜发酵的微生物复合菌剂，该微生物复合菌剂中包括分类命名的植物乳杆菌lactobacillusplantarum，保藏日期为2017年6月8日，保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmcc.no60196。保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。一种可用于陈年道菜发酵的微生物复合菌剂，该微生物发酵剂中包括分类命名的短乳杆菌lactobacillusbrevis的菌株，保藏日期为2016年7月15日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.12792。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。一种可用于陈年道菜发酵的微生物复合菌剂，该微生物发酵剂中包括分类命名的kazachstaniaexigua的菌株，保藏日期为2016年7月15日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.12791。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。本申请文件中，％如无特殊说明，均表示wt％；所采用的原料，如无特殊说明外，均为市售产品。以下实施例中的菌均采用具体实施方式中保藏的菌种，各菌种的冻干粉均可采用现有技术进行制备得到。实施例1：一株植物乳杆菌lactobacillusplantarum，已于2017年6月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc.no60196，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，制备含有该菌的微生物菌剂，用于陈年道菜发酵。菌剂中每一种菌的活菌数≥1×109cfu/g。该菌剂的制备方法为：取100ul的lactobacillusplantarum的菌株保藏液，于10ml的mrs肉汤中37℃培养14h；将培养得到的菌液按总体积3％分别接入扩培培养基中继续培养。其中，lactobacillusplantarum的扩培培养基成分为：葡萄糖2.5％，酵母粉0.4％，牛肉膏0.8％。培养条件为：培养基初始ph6.2，培养温度32℃，摇床转速80r/min，培养时间为14h；扩培后的培养液，置于温度为4℃，转速为4000r/min的条件下离心20min，获得菌泥，加入保护剂，以质量计，保护剂与菌泥的比例关系为1∶24，真空冷冻干燥得到菌粉。其中，保护剂包括以下重量份的原料：脱脂奶粉9份,海藻糖2份,甘油0.6份,山梨醇2.5份,麦芽糊精1.2份；干燥温度-50℃，真空度1pa，时间32h，冷冻干燥后分别制成粉剂。实施例2：一株短乳杆菌lactobacillusbrevis，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.12792，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，制备含有该菌的微生物菌剂，用于陈年道菜发酵。菌剂中每一种菌的活菌数≥1×109cfu/g。该菌剂的制备方法为：取100ul的lactobacillusbrevis的菌株保藏液，于10ml的mrs肉汤中37℃培养15h；将培养得到的菌液按总体积3％分别接入扩培培养基中继续培养。其中，lactobacillusplantarum的扩培培养基成分为：葡萄糖3.0％，酵母粉0.6％，牛肉膏1.0％。培养条件为：培养基初始ph6.5，培养温度35℃，摇床转速100r/min，培养时间为16h；扩培后的培养液，置于温度为4℃，转速为4000r/min的条件下离心20min，获得菌泥，加入保护剂，以质量计，保护剂与菌泥的比例关系为1∶3，真空冷冻干燥得到菌粉。其中，保护剂包括以下重量份的原料：脱脂奶粉9份,海藻糖2份,甘油0.6份,山梨醇2.5份,麦芽糊精1.2份；干燥温度-60℃，真空度1pa，时间32h，冷冻干燥后分别制成粉剂。实施例3：一株菌kazachstaniaexigua，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.12791，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，制备含有该菌的微生物菌剂，用于陈年道菜发酵。菌剂中每一种菌的活菌数≥1×109cfu/g。该菌剂的制备方法为：吸取100ul的kazachstaniaexigua的菌株保藏液，于10ml的ypd液体培养基中28℃培养24h。将上述培养的菌液按总体积3％分别接入扩培培养基中继续培养。kazachstaniaexigua的扩培培养基成分为:蛋白胨1.5％，酵母浸出粉1.0％，蔗糖16％。培养条件为：培养基初始ph4.5，培养温度28℃，摇床转速90r/min，培养时间为16h。扩培后的培养液，置于温度为4℃，转速为4000r/min的条件下离心20min，获得菌泥，加入保护剂，以质量计，保护剂与菌泥的比例关系为1∶2，真空冷冻干燥得到菌粉。其中，保护剂包括以下重量份的原料：脱脂奶粉9份,海藻糖2份,甘油0.6份,山梨醇2.5份,麦芽糊精1.2份；干燥温度-55℃，真空度1pa，时间32h，冷冻干燥后分别制成粉剂。实施例4：一种微生物菌剂，该菌剂中含有植物乳杆菌lactobacillusplantarum菌粉、短乳杆菌lactobacillusbrevis菌粉和kazachstaniaexigua菌粉，各菌粉的质量比为5：3:2，菌剂中每一种菌的活菌数≥5×109cfu/g。该菌剂的制备方法为：(1)分别吸取100ul的lactobacillusplantarum和lactobacillusbrevis的菌株保藏液，于10ml的mrs肉汤中37℃培养12-18h；吸取100ul的kazachstaniaexigua的菌株保藏液，于10ml的ypd液体培养基中28℃培养20h。(2)将上述培养的菌液按总体积3％分别接入扩培培养基中继续培养。其中，lactobacillusplantarum和lactobacillusbrevis的扩培培养基成分为：葡萄糖2.5％，酵母粉0.4％，牛肉膏0.6％。培养条件为：培养基初始ph6.2，培养温度32℃，摇床转速90r/min，培养时间为14h。kazachstaniaexigua的扩培培养基成分为:蛋白胨1.2％，酵母浸出粉0.8％，蔗糖14％。培养条件为：培养基初始ph4.5，培养温度30℃，摇床转速90r/min，培养时间为16h。(3)将上述扩培后的培养液，置于温度为4℃，转速为4000r/min的条件下离心20min，获得菌泥，加入保护剂，以质量计，保护剂与菌泥的比例关系为1∶2，真空冷冻干燥得到菌粉。其中，保护剂包括以下重量份的原料：脱脂奶粉9份,海藻糖2份,甘油0.6份,山梨醇2.5份,麦芽糊精1.2份；干燥温度-60℃，真空度1pa，时间32h，冷冻干燥后分别制成粉剂，菌种lactobacillusplantarum得到的菌粉为a，lactobacillusbrevis得到的菌粉为b，kazachstaniaexigua得到的菌粉为c。(4)将菌粉a、b、c按比例混合，即为该复合菌剂。实施例5：一种陈年道菜的制备方法，该方法包括以下步骤：1)选择新鲜无腐败的成熟棒菜3000g，用刀削去杆状部位的茎皮，用清水洗净后滤干。2)将步骤1)处理后的棒菜用刀切成小块，置于大盆中，加入8％的食用盐和1.5g复合菌剂，充分拌匀后置于坛子或袋子等容器中，密闭发酵48h。3)将步骤2)发酵后的棒菜从容器中捞出，弃掉容器中的液体，置于簸箕中晾晒48h使原料的含水量在65％左右，再置于大盆中，加入1.5g复合菌剂，充分拌匀后置于步骤2)的容器中，密闭发酵1个月，发酵结束后即为样品1。采用的菌剂为实施例4中制备得到的的复合菌剂。实施例6：陈年道菜的制备方法同实施例5，区别仅在于菌剂中植物乳杆菌lactobacillusplantarum菌粉、短乳杆菌lactobacillusbrevis菌粉和kazachstaniaexigua菌粉的质量比为5：2:3，每克菌剂中每一种菌的活菌数≥5×109cfu/g，复合菌剂的添加量为2g，最后得到的陈年道菜样品2。对比例1：制备方法同实施例5，仅将菌剂改为从中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)购买植物乳杆菌lactobacillusplantarumcicc20242，短乳杆菌lactobacillusbreviscicc20014和kazachstaniaexiguacicc33206组成的菌剂，菌剂的制备采用现有方法。最后得到陈年道菜样品3。对比例2：(传统陈年道菜的制备方法)(1)选择新鲜无腐败的成熟棒菜3000g，用刀削去杆状部位的茎皮，用清水洗净后滤干。(2)将步骤(1)处理后的棒菜用刀切成小块，置于大盆中，加入8的食用盐，充分拌匀后置于坛子中，密闭发酵24h。(3)将步骤(2)发酵后的棒菜从容器中捞出，弃掉容器中的液体，将棒菜进行反复揉搓30min，置于大盆中，弃掉容器中的液体，再次密闭发酵24h。(4)重复步骤(3)3次。(5)将步骤(4)发酵后的棒菜从容器中捞出，弃掉容器中的液体，揉搓直到棒菜的质地柔软，置于簸箕中晾晒放置10h，充分拌匀后置于步骤(3)的容器中，室温下密闭发酵3年。(6)将步骤(5)发酵成熟的道菜用白酒浸泡后6h后，即为样品4(也称空白样品)。将实施例5、实施例6、对比例1和对比例2中获得陈年道菜进行感官对比，具体比较方法如下：1、感官对比随机选择10名专业感官人员，对样品1、样品2、样品3以及样品4的颜色、气味、滋味、质地进行评分，结果如图1所示。样品1的感官评分最高，滋味最好，表明实施例1的复合菌剂发酵后的陈年道菜效果最好。样品3的感官评分远低于样品1和样品2，且不及样品4，可见从陈年道菜中筛选的菌株来制备复合菌剂的效果，而市售同类型菌株难以适应陈年道菜苛刻的发酵条件。样品1和样品2的质地与样品4差距不大，说明采用复合菌剂发酵的陈年道菜不需要反复揉搓。2、基础理化指标对比依据国标方法，测定了样品1、样品2、样品3、样品4的水分含量、ph值、总酸浓度和亚硝酸盐含量，结果如表1所示。样品1的ph值最低、总酸浓度最高，样品2与样品4的ph值和总酸差距不大，表明复合菌剂发酵的陈年道菜在1个月时已经成熟，样品1、样品2的亚硝酸盐含量更低，表明复合菌剂发酵的陈年道菜食用安全性更高。样品3的总酸浓度远低于样品4，亚硝酸盐含量较高，可见市售同类型菌株难以缩短陈年道菜的发酵时间，还可能造成发酵不彻底带来的安全隐患。表1基础理化测定结果水分含量(％)ph值总酸(mg/100g)亚硝酸盐(mg/kg)样品154.263.513.023.24样品253.423.792.782.89样品354.734.520.7219.56样品445.193.722.6713.993、酸类、醇类含量对比依据国标方法，采用高效液相测定了样品1、样品2、样品4的乳酸、乙酸、苹果酸、琥珀酸、甲酸和乙醇，结果如图2所示。样品1、样品2和样品4的乳酸含量都比较高，样品1和样品2的乙醇含量低于样品4，表明复合菌剂发酵的陈年道菜酸味差距不大，酒味适中。4、生物胺含量对比依据国标方法，采用高效液相测定了样品1、样品2、样品4的8种生物胺，结果如图3所示。样品4的生物胺含量比较高，尤其是腐胺、尸胺和酪胺，而样品1和样品2的8种生物胺含量都比较低，表明复合菌剂可阻断陈年道菜生物胺的积累，食用更加安全。以上所述实例仅是本专利的优选实施方式，但本专利的保护范围并不局限于此。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本专利原理的前提下，根据本专利的技术方案及其专利构思，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利的保护范围之内。当前第1页12