荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液、其制备方法及其应用与流程

1.本发明属于微生物及微生物制剂技术领域，具体涉及一种荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液、其制备方法及其应用。


背景技术：

2.植物病毒种类繁多，目前发现的病毒病已达几百种，数量仅低于真菌病害，每年因此都会造成重大损失。病毒病的防治主要以早期预防为主，大田生产中常通过筛选抗病品种、防虫脱毒、栽培管理等来防治病毒病，但收效甚微。硒作为“生命元素”，是生物体生长所必需的，在提高机体免疫力、调节代谢、抗氧化、解毒、促进生殖等方面均有重要的生理功能，纳米硒因其低毒高活性成为最佳的补硒形态。微生物转化合成的纳米硒条件温和，结构稳定，分散性好，应用前景良好。
3.近年来，高效安全的微生物制剂一直是作物病虫害防治研究的重点。但目前鲜少有抗病效果及促生效果俱佳的研究成果，更缺乏推广应用。从生物防治方面进行探索，筛选促生且防效优良的微生物制剂应用于作物病毒病的生物防治中，是目前研究的重中之重。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株耐受亚硒酸钠的荧光假单胞杆菌生物合成的纳米硒合成活性菌液；该纳米硒合成活性菌液对作物病毒病具有较好的防治效果，为作物病毒病的防治提供新的微生物资源。此外，本发明荧光假单胞杆菌的纳米硒后的纳米硒合成活性菌液还对作物具有促生效果，且效果显著。
5.为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液，是由荧光假单胞杆菌进行生物发酵合成纳米硒后，由荧光假单胞杆菌及其合成的纳米硒组成的混合液；
7.所述荧光假单胞杆菌为荧光假单胞杆菌kbd
‑
1；该菌株于2020年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为cgmcc no.20567，分类命名为pseudomonas fluorescens。
8.上述荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液的制备方法，步骤如下：
9.将活化后的菌株cgmcc no.20567以1％接种量加入到含1mm亚硒酸钠的lb液体培养基中，28℃、150r/min振荡培养，2
‑
5d后菌液中观察到红色出现，上述发酵混合液即为所述荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液。
10.上所述荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液在防治作物病毒病或作物促生中的应用。
11.上述荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液在制备防治作物病毒病的抗病毒剂或制备作物促生剂中的应用。
12.一种防治作物病毒病的方法，将上述的荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液均
匀喷洒于作物叶片正反面，使作物与基质湿透；所述荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液中的菌含量≥108cfu/ml；纳米硒浓度≥50mg/l。
13.在上述方案的基础上，所述病毒病包括由烟草花叶病毒(tmv)、黄瓜花叶病毒(cmv)、马铃薯y病毒(pvy)和番茄斑萎病毒(tswv)中的任意一种病毒所引起的作物疾病。
14.一种作物的促生方法，将上述的荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液稀释后对作物进行灌根处理，所述稀释后的荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液中菌含量为2
×
105cfu/ml～2
×
106cfu/ml，纳米硒浓度为0.1mg/l～1mg/l；优选的，所述稀释后的荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液中菌含量为5
×
105cfu/ml，纳米硒浓度为0.25mg/l。
15.在上述方案的基础上，所述灌根处理为：在移栽时灌根一次；缓苗3d后再连续灌根2次，中间间隔3d，每次每株10ml。
16.一种作物抗病毒剂，其有效成分包含上述的荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液；所述作物抗病毒剂中荧光假单胞杆菌菌含量≥108cfu/ml，纳米硒浓度≥50mg/l。
17.一种作物促生剂，其有效成分包含上述的荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液；所述作物促生剂中荧光假单胞杆菌菌含量为2
×
105cfu/ml～2
×
106cfu/ml，纳米硒浓度为0.1mg/l～1mg/l。
18.本发明技术方案的优点：
19.本发明的荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液，可应用于防治作物病毒病。采用接种枯斑寄主的生物学测定显示，荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液对tmv具有较好的抑制效果，抑制率为95.5％，较单独使用荧光假单胞杆菌菌液具有较好的防治效果。同时，荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液对tmv、cmv、pvy、tswv的防效均较好，均在70.0％以上。这表明，荧光假单胞杆菌在其生物发酵合成活性纳米硒后增强了其抗病毒的能力，在田间生产上用作抗病毒剂可有效预防田间病毒病的发生。另，本发明的荧光假单胞杆菌的纳米硒合成活性菌液的促生效果较好，在生产上具有一定的实际应用价值。
附图说明
20.图1为菌株kbd
‑
1生物合成纳米硒的效果(左：纳米硒生物合成活性菌液，菌液颜色为红色；右：kbd
‑
2菌液，菌液颜色为淡黄色)；
21.图2为纳米硒生物合成活性菌液对tmv的枯斑抑制效果图(右侧叶：纳米硒合成活性菌液；左侧叶：空白对照)。
具体实施方式
22.在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
23.下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
24.实施例1菌株的分离、纯化及鉴定
25.从保山病毒病高发植烟区采集未发病烟株根际土壤样品，称取采集的土样2g，加入20ml ddh2o，28℃、180rpm振荡培养16h，取出静置30min，取上清在lb固体培养基上划线，放入28℃培养箱中培养获得菌株。参照tiangen tianamp bacteria dna kit试剂盒说明书
进行dna提取，后按照takara公司的16s rdna bacterial identification pcr kit试剂盒说明书进行pcr扩增，由宝生物工程(大连)有限公司进行16s rdna测序。通过ncbi网站上的blast程序将测定的序列与genbank中的序列比对，确定该菌株为荧光假单胞杆菌。该菌株代号为kbd
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1，该菌株于2020年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为cgmcc no.20567，分类命名为pseudomonas fluorescens。
26.实施例2菌株kbd
‑
1生物合成纳米硒
27.将活性菌株kbd
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1接种到lb固体培养基上进行纯化，挑取生长良好的单一菌落接种于lb液体培养基中，28℃、150rpm振荡培养20h，后以1％接种量加入到含1mm亚硒酸钠的lb液体培养基中，28℃、150r/min振荡培养，2
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5d后菌液中观察到红色出现，表明活性菌株kbd
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1能还原亚硒酸钠生成纳米硒(图1)，后用水稀释，制成纳米硒合成活性菌液(硒含量50mg/l、菌浓度108cfu/ml)。
28.实施例3菌株kbd
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1及纳米硒合成活性菌液对tmv的抑制作用
29.采用半叶法检测活性，分别取10ml kbd
‑
1菌液(浓度为108cfu/ml)及其纳米硒合成活性菌液(硒含量为50mg/l、菌浓度108cfu/ml)与等体积40倍tmv汁液(将带tmv的烟草叶片冷冻研磨成粉末，按1：40加去离子水，纱布过滤)混合15min后，各摩擦接种3株三生烟，每株接种上部2片叶，同时设空白对照(lb液体培养基与等体积40倍tmv汁液混合)，3
‑
5d调查枯斑数。实验结果显示，kbd
‑
1菌液及其纳米硒合成活性菌液对tmv均有较好的钝化效果，抑制率分别为89.2％、95.5％(表1)，生物合成纳米硒后增强了对tmv的抑制作用。
30.表1菌株kbd
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1及纳米硒合成活性菌液对tmv的抑制作用
[0031][0032]
实施例4纳米硒生物合成活性菌液对田间作物病毒病的预防作用
[0033]
(1)菌液处理。实验室发酵50l纳米硒生物合成活性菌液(硒含量为50mg/l、菌浓度108cfu/ml)及配制40倍病毒(tmv、cmv、pvy、tswv)汁液备用。无毒k326烟苗假植之后，5
‑
6叶期进行接种。3个处理：处理i菌液和病毒汁液混合15min后接种；处理ii先喷菌液，2h后再接种病毒汁液；处理iii先接种病毒汁液，2h后再喷施菌液。喷药时叶片正反两面均匀喷施，保证各处理喷雾量基本一致，喷雾量以烟苗和基质湿透为宜。
[0034]
(2)小区设置。2020年4月28日于中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地分别进行抗tmv、cmv、pvy、tswv病毒试验。每个抗病毒实验设3个处理，并且以lb培养基与等体积病毒汁液混合为阳性对照，每个处理3次重复，每小区50株，小区间设保护行。
[0035]
烟株移栽30d后调查发病情况，结果显示，纳米硒生物合成活性菌液对4种病毒的防效均较好(表2)。其中，与病毒汁液混合抑制效果最好，菌液可钝化绝大部分病毒的活性，对4种病毒的抑制效果均在85.0％以上，tmv抑制率最高达92.7％；其次是先喷菌液，2h后接种病毒，菌液可在烟叶表面定殖，阻止病毒侵染，对4种病毒的防效为71.8％
‑
73.3％；而接
种后喷菌液对4种病毒的防治效果均不足15.0％，没有经过菌液处理的对照组发病率达到97.7％以上。故菌液与病毒混合接种对病毒的抑制效果最佳，其次为先喷菌液再接种，实际生产上可将菌株kbd
‑
1生物合成纳米硒用作抗病毒剂，能有效预防田间病毒病的发生。
[0036]
表2纳米硒生物合成活性菌液在田间对4种常见病毒的抑制活性
[0037][0038][0039]
实施例5纳米硒生物合成活性菌液对作物的促生作用
[0040]
将滤纸修剪适当大小，置于培养皿中。将纳米硒生物合成活性菌液(硒含量为50mg/l)分别稀释0倍(硒含量为50mg/l、菌浓度108cfu/ml)、50倍、100倍、200倍、500倍，滴到滤纸使其湿润。后选取圆润饱满的绿豆，每个培养皿放置10粒，并以灭菌lb液体培养基作为对照，每天观察并保证滤纸湿润。结果发现，绿豆经稀释的纳米硒生物合成活性菌液处理后，其鲜重、株高明显高于lb培养基处理，未经稀释的处理抑制绿豆的生长，发芽率仅有53.3％，并且芽长度仅有0.3cm。稀释50倍后对绿豆的生根有抑制作用，但是对株高的增加有促进作用。总体来看，稀释200倍后对绿豆的促生效果最佳。
[0041]
在育苗基质中培育k326至5
‑
6片真叶，移栽时用纳米硒生物合成活性菌液(硒含量为50mg/l)200倍液灌根，缓苗3d后再连续灌根2次，中间间隔3d，每次每株10ml，以lb培养基、清水灌根作为对照，每处理6株，3次重复。末次灌根3d后调查鲜重及最大叶长宽。由表4可看出，连续三次灌施纳米硒生物合成活性菌液后，烟株的鲜重及最大叶长宽均高于lb培养基和清水处理，促生效果明显。
[0042]
表3纳米硒生物合成活性菌液对绿豆的促生作用
[0043][0044]
表4纳米硒生物合成活性菌液对k326的促生作用
[0045][0046]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。