一种提高水稻氮素利用率的分子育种方法与流程

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本发明涉及水稻育种和分子遗传学技术领域，尤其涉及一种提高水稻氮素利用率的分子育种方法。
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背景技术：

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水稻是世界重要粮食作物，也是我国最主要的粮食作物之一，约占粮食作物总面积的30%。关注水稻安全生产对于中国的可持续发展十分重要。氮是作物生长和发育所需的最重要的大量营养元素。氮肥的应用大大提高了水稻产量。随着农业和化工业的发展，水稻的施氮量迅速增长，但其氮素利用率随着氮肥用量的增长明显下降。过量施用氮肥直接后果是氮素利用率降低，造成巨大的能源浪费，而且导致了包括气候变化、土壤酸化及水体富营养化等一系列环境问题，甚至会导致水稻产量下降。
[0004]
针对目前水稻品种氮素利用率低的情况，目前许多科学家都在开展水稻种质资源氮素利用率基础研究，从种质资源中定位和挖掘提高氮素利用率的有利基因，阐明氮素利用率的遗传机理，为培育高氮素利用率品种提供科学依据，对保障粮食和环境安全具有重大而深远的意义。
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水稻氮素利用效率为数量遗传，目前已经报导了多个关于水稻氮素利用率的qtl位点。tong等(2006)利用以特青为轮回亲本、lemont为供体的染色体片段替代系在两个不同氮浓度处理条件下，确定了31个控制株高，单株穗数，叶绿素含量，茎干重和单株产量的qtl。wang等(2009)利用以日本晴为供体亲本，9311为轮回亲本的125个片段置换系在正常施肥、低氮和低磷三个处理条件下，发现了26个与穗数和产量有关的位点。liu等(2016)用157个ssr标记对187个品种在正常施氮和低氮条件下的株高和分蘖数进行了qtl计算，获得了8个qtl位点。另外，相关研究也报导了多个与水稻氮素吸收、运输和利用相关的基因，如osamt3(gaur等, 2012)、qngr9(sun等, 2014)、osnrt1.1b(hu等, 2015)、tond1(zhang等, 2015)、osnr2(gao等, 2019)、osnpf6.1(tang等, 2019)等。这些报导的qtl位点和基因部分可以应用于水稻分子育种过程中，为提高水稻的氮素利用率育种做出了相应的贡献。
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东乡野生稻属多年生普通野生稻，发现于江西省东乡县，携带了诸多常规栽培稻不具有的优异基因资源。已有研究报道证实东乡野生稻中具有氮高效特性(zhou等, 2014)。对于利用东乡野生稻中的氮高效特性及相关基因来提高水稻氮素利用率的水稻育种，在当前市场上尚未有成熟的方法。
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技术实现要素：

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为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种提高水稻氮素利用率的分子育种方法，通过分子标记辅助育种，将在赣香b/东乡野生稻重组自交系鉴定到的氮素利用率qtl
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qtgw11导入到赣香b中，构建了含qtl-qtgw11的赣香b近等基因系，育成氮素利用率显著提
高的保持系赣香b。
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为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：一种提高水稻氮素利用率的分子育种方法，包括以下步骤：(1) 以氮素利用率较低的籼型三系保持系赣香b作为轮回亲本，以携带氮素利用率qtl-qtgw11的株系gy122作为供体，进行杂交获得f1；(2) 种植f1，苗期提取单株叶片dna，利用与氮素利用率qtl-qtgw11紧密连锁的ssr分子标记rm206和rm27154进行杂种鉴定，选择基因型杂合的单株与轮回亲本赣香b进行回交，获得bc1f1；(3)种植bc1f1，苗期提取单株叶片dna，利用与氮素利用率qtl-qtgw11紧密连锁的ssr分子标记rm206和rm27154进行分子标记检测，选择2个分子标记基因型均为杂合的单株与轮回亲本赣香b继续回交，获得bc2f1;(4)继续重复步骤(3)，分别获得bc3f1，bc4f1；(5)种植bc4f1，苗期提取单株叶片dna，利用分子标记rm206和rm27154进行分子标记检测，选择2个分子标记基因型均为杂合的单株收种，获得bc4f2;(6)将bc4f2和亲本进行低氮浓度的水培实验；二叶期提取叶片dna检测分子标记类型；三叶一心期鉴定秧苗的根长，挑选根长较轮回亲本长、且分子标记类型为纯合的东乡野生稻型的单株种植于大田，自交获得bc4f3；(7)继续种植bc4f3，重复步骤(6)；继续自交2代，即育成氮素利用率显著提高的水稻株系。
[0010]
优选的，步骤(1)中所述的gy122株系为东乡野生稻与赣香b的重组自交株系。
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优选的，步骤(2)中所述的氮素利用率qtl-qtgw11紧密连锁的ssr分子标记rm206左端引物序列，5’cccatgcgtttaactattct3’右端引物序列，5’cgttccatcgatccgtatgg3’分子标记rm27154左端引物序列，5’tagtcgggcatctcctcttcc3’右端引物序列，5’gttacctccgatgaaggcaagg3’。
[0012]
优选的，步骤(6)中低氮浓度的水培实验中其nh4no3浓度为0.25mm。
[0013]
本发明提出的一种提高水稻氮素利用率的分子育种方法，有益效果在于：相对于传统的水稻氮素高效育种，本研究利用与氮素利用率qtl-qtgw11紧密连锁的ssr分子标记rm206和rm27154，通过分子辅助选择结合表型选择，可以快速准确的提高水稻氮素利用率，避免了在选育过程中由于环境影响和人为因素导致的误差，加快育种进程。
附图说明
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图1为qtl-qtgw11在第11号染色体的位置；图2为分子标记rm206在bc1f1群体中的丙烯酰胺凝胶检测结果；其中，1号泳道为赣香b带型，2号泳道为东乡野生稻带型，3-17号泳道为gy122株系/赣香的bc1f1群体不同单株带型(7，10，11号单株为阳性杂合株)；图3为分子标记rm27154在bc1f1群体中的丙烯酰胺凝胶检测结果；其中，1号泳道为东乡野生稻带型，2号泳道为赣香b带型，3-17号泳道为gy122株系/赣香的bc1f1群体不同单株
带型(5，6，9，10，11，16，17号单株为阳性杂合株)；图4为亲本和bc4f2群体单株，在低氮水培条件下的根长照片。从左至右分别为：赣香b、gy122株系、不含qtl-qtgw11位点单株、包含qtl-qtgw11位点单株。
具体实施方式
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下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。所述方法无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
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一种提高水稻氮素利用率的分子育种方法：包括以下步骤：(1)通过赣香b/东乡野生稻重组自交系鉴定到一个氮素利用率qtl-qtgw11，位于11号染色体，等位基因来源于东乡野生稻(图1)。
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(2)以氮素利用率较低的籼型三系保持系赣香b作为轮回亲本，以携带氮素利用率qtl-qtgw11的株系gy122作为供体，进行杂交获得f1；(3)种植f1，苗期提取单株叶片dna，利用与氮素利用率qtl-qtgw11紧密连锁的ssr分子标记rm206和rm27154进行杂种鉴定，选择基因型杂合的单株与轮回亲本赣香b进行回交，获得bc1f1；(4)种植bc1f1，苗期提取单株叶片dna，利用与氮素利用率qtl-qtgw11紧密连锁的ssr分子标记rm206和rm27154进行分子标记检测(图2，图3)，选择2个分子标记基因型均为杂合的单株—第10、11号单株与轮回亲本赣香b进行回交，获得bc2f1;(5)继续重复步骤(4)，分别获得bc3f1，bc4f1；(6)种植bc4f1，苗期提取单株叶片dna，利用分子标记rm206和rm27154进行分子标记检测，选择2个分子标记基因型均为杂合的单株收种，获得bc4f2;(7)将bc4f2和亲本进行低氮浓度的水培实验；二叶期提取dna检测分子标记类型；三叶一心期鉴定秧苗的根长(图4)，挑选根长较轮回亲本长、且分子标记类型为纯合的东乡野生稻型的单株种植于大田，自交获得bc4f3；(8)继续种植bc4f3，重复步骤(7)；继续自交2代，即育成氮素利用率显著提高的水稻株系。
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优选的，步骤(2)中所述的gy122株系为东乡野生稻与赣香b的重组自交株系。
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优选的，步骤(3)中所述的氮素利用率qtl-qtgw11紧密连锁的ssr分子标记rm206左端引物序列，5’cccatgcgtttaactattct3’右端引物序列，5’cgttccatcgatccgtatgg3’分子标记rm27154左端引物序列，5’tagtcgggcatctcctcttcc3’右端引物序列，5’gttacctccgatgaaggcaagg3’。
[0020]
优选的，步骤(7)中所述的低氮浓度的水培实验，其nh4no3浓度为0.25mm。
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以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。