一株克雷伯菌KlebsiellapneumoniaeLW3菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物降解技术领域，更具体地，涉及一株克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株及其应用。

背景技术：

随着工业现代化的飞速发展，自然环境也不可避免受到了工业各种废弃物的污染，多氯联苯(polychlorinatedbiphenyls,pcbs)就是其中之一。pcbs不是天然存在的，是联苯在金属催化剂的作用下高温氯化而成的一类氯代芳烃化合物，根据苯环上的氯原子不同取代程度，共有209种同系物，其分子通式为c12h(10-n)cln(n＝1～10，氯原子数目)，pcbs是首批被列入《国际斯德哥尔摩公约》的12种持久性有机污染物(persistentorganicpollutants,pops)之一，尽管目前世界范围内pcbs已全部停产，但是世界范围内已经生产和应用的多氯联苯已超过170万吨，且有相当一部分已泄露进入环境并造成污染。pcbs对消化、神经、生殖和免疫系统都具有一定的功能损伤甚至诱发癌症，即使是低浓度的多氯联苯，也会对机体造成一定的损伤，部分pcbs还会影响哺乳动物和鸟类的繁殖，导致生长发育障碍。dl-pcbs较ndl-pcbs毒性更强，相关研究表明一些dl-pcbs可持续激活芳烃受体(arylhydrocarbonreceptor,ahr)，进而引起各种病理变化甚至致癌，ndl-pcbs可通过酶蛋白诱导酶代谢活化为致癌突物。pcbs的半挥发性与其在环境中的持久性使pcbs随大气环流和海洋运动长期循环往复于水、大气、土壤内，进而在世界范围内流通，而且易吸附于土壤、海洋沉积物和生物机体内，几乎不被机体排出或降解，有研究证实即使是在从未使用过pcbs的地区如南极、北极冰川中也检测到了pcbs污染，包括西藏南迦巴凡峰也检测出了pcbs，可见，环境中pcbs污染已成为当前环境一大难题。

目前应用较多的降解多氯联苯污染治理方法主要有物理修复方法，化学修复方法和生物修复方法，其中，物理修复技术(如热处理技术、热解吸技术、土壤淋洗技术和溶剂萃取技术等)以及化学修复技术(如化学氧化技术、化学还原技术等)仍是目前多氯联苯污染土壤修复工程中的常用技术，但易造成二次污染、破坏土壤生物学功能以及运行成本高等缺点限制了这些技术的推广应用。生物修复治理多氯联苯污染的方法，由于其更加绿色、环保、且成本低，在彻底消除环境污染的同时也对环境生态功能发挥着重要作用，逐渐成为环境治理的热门技术。授权公告号为cn103789209b的中国发明专利提供了一种简单、可靠的多氯联苯好氧降解菌的筛选方法及一株多氯联苯降解菌sphingobiumfuliginishc3，能有效降解一氯、二氯及三氯联苯。此外，已经分离得到且验证对多氯联苯混合物或多氯联苯单体具有降解作用的菌属大约有几十种，其中较为常见的菌属有假单胞菌属(pseudomonassp)、红球菌属(rhodococcussp)等，但是，迄今为止应用此类微生物修复多氯联苯污染场地的工程案例仍然较少。其根本原因是多氯联苯降解菌资源不够丰富。微生物所能降解的多氯联苯的种类是有限的，而且降解效率也有高低之分，环境中常见的多氯联苯有60～90种，依靠一两株降解菌是无法将其全部降解的。

因此，今后仍需从环境中不断筛选多氯联苯降解菌，以积累更多优良的降解菌，从而为生物强化技术提供充足的微生物资源，同时也能为高效工程菌的构建提供基因资源。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有多氯联苯降解菌种类有限的问题，提供一种克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株。

本发明的第二个目的在于提供所述克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株在降解多氯联苯或修复多氯联苯污染的自然环境方面的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于降解多氯联苯的方法。

本发明的第四个目的是提供所述克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株在制备降解多氯联苯的微生物制剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种用于降解多氯联苯的微生物制剂。

本发明的第六个目的是提供所述微生物制剂在降解多氯联苯或修复多氯联苯污染的自然环境方面的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一株克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株，其特征在于，所述菌株于2020年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmccno：61283。

具体地，所述菌株的16srdna的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明从红树林底泥中分离纯化，筛选得到上述菌株，通过将所述克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株进行4-氯联苯降解试验，结果发现，klebsiellapneumoniaelw3菌株对c1(5mg/l)、c2(10mg/l)、c3(20mg/l)、c4(40mg/l)和c5(60mg/l)五组不同浓度的的4-氯联苯的降解率分别达到97.12％、99.54％、99.44％、99.66％和99.72％，随着4-氯联苯浓度的增加降解率逐渐升高，表明该菌株对pcbs具有良好的降解效果。

因此，本发明提供所述克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株在降解多氯联苯或修复多氯联苯污染的自然环境方面的应用。

优选地，所述多氯联苯的浓度为5～60mg/l。

最优选地，所述多氯联苯为4-氯联苯。

本发明还提供一种用于降解多氯联苯的方法，将克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株和/或其菌液接种到多氯联苯污染物中。

本发明还提供所述所述克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株在制备降解多氯联苯的微生物制剂中的应用。

本发明还提供一种用于降解多氯联苯的微生物制剂，所述药剂包含克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株和/或其菌液。

上述微生物制剂在降解多氯联苯或修复多氯联苯污染的自然环境方面的应用也应在本发明的保护范围内。

优选地，所述菌液为klebsiellapneumoniaelw3菌株经过发酵所得培养液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株及其应用，所述菌株于2020年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmccno：61283。本发明研究表明，klebsiellapneumoniaelw3菌株具有高效降解多氯联苯的作用，klebsiellapneumoniaelw3菌株作为一种有效、绿色的多氯联苯污染降解菌，对于多氯联苯环境污染的修复，具有很好的潜力和应用前景。

附图说明

图1为mm30培养基菌落形态照片。

图2为lb培养基菌落形态照片。

图3为lw3菌的革兰氏染色镜检照片。

图4为lw3菌的扫描电镜图片。

图5为lw3降解pcbs在不同时期的残留量。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1菌株lw3的筛选

(1)选择性分离培养基的配制：

mixture44溶液(mg/100ml)：na2b4o7·10h2o17.7，cuso4·5h2o39.2，cacl2·6h2o20.1，znso4·7h2o1095，edta250，加入100-150μl浓h2so4，以防止产生沉淀。

微量金属盐溶液(mg/100ml)：edta0.5，caco31，feso4·7h2o0.5，mgso4·7h2o10，mnso4·h2o10，mixture4410ml。

大量元素溶液(g/l)：(nh4)2so41，kh2po43，na2po6，微量金属盐溶液0.5ml，调节ph7.1(通过滴加稀hcl与naoh进行调节)。

mm30液体培养基：(nh4)2so4g/l、1kh2po43g/l、na2po46g/l、微量金属盐溶液0.5ml、ph7.1(配制mm30培养基时，再加入维生素b120.0002mg/l促进诱导微生物脱氯。)

mm30固体培养基：mm30液体培养基中加入1.8％的琼脂，经高压蒸汽灭菌(121℃，0.1mpa)20min后，倒入培养皿中，待冷却凝固后加入联苯或多氯联苯溶液吹干备用。

lb培养基：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、ph7.0。

(2)菌株的筛选

①向mm30液体培养基加入联苯母液使其终浓度为200mg/l，静置使有机溶剂挥发后加入新鲜的红树林底泥样品适量，于30℃，180rpm恒温摇床中培养5～7d。

②取较为澄清菌悬液1ml加入bp浓度为200mg/l的mm30培养基中，将联苯作为唯一碳源进行传代，一次传代5～7次。

③取100μl菌液连续梯度稀释后均匀涂布于bp浓度为200mg/l的mm30固体培养基，于37℃培养箱倒置培养48～72h，挑取不同形态的菌落划线于含有联苯的mm30固体培养基中继续纯化培养直至获得单个菌落。

④将获得的单一菌株使用特异性引物(pcba1、pcba4、pcba5)进行扩增，引物序列如表1所示，加样体系如表2所示，pcr扩增程序如表3所示，凝胶电泳检查，将出现目的大小片段的菌株进转接于以pcb3(4-氯联苯)为唯一碳源的mm30液体培养基中继续传代5～7次。

⑤蘸取菌液划线接种于pcb3为唯一碳源的mm30固体培养基，倒置培养48～72h，获得单一菌落。

表1引物序列

表2加样体系

表3pcr扩增程序

实施例2菌株lw3鉴定

1、传统的生物学鉴定

(1)菌株lw3的外观特征

在传代过程中，在mm30培养基上生长较为缓慢，lw3在接种后72h左右形成肉眼可见的白色的小点状菌落，如图1所示。

呈现在lb固体培养基上，lw3在24h后即可形成肉眼可见的圆形菌落，外表光滑，如图2所示。

图3为lw3的革兰氏染色显微镜图(放大倍数1000x)，lw3为革兰氏阴性菌，油镜下观察到粉红色球形或卵圆形，单个、成对存在的球形或椭球形，有的成团块状或方形排列。

图4为lw3的扫描电镜图，在电镜下分别在5k倍和45k倍数下观察菌株形态，发现lw3是表面粗糙，凹凸不平的短杆状细菌，长度约在0.6～1.2μm之间，宽在0.3～0.5微米之间。

(2)菌株lw3的生化特征测定

观察菌株在不同含碳、含氮化合物培养基中的生长状况，以及菌株对不同碳源、氮源的分解利用情况及其代谢产产物，本试验使用新型生化鉴定管(环凯微生物，070060新型生化鉴定管)进行生化鉴定。

结果如表4所示，lw3发酵葡萄糖产酸产气，可利用蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖和肌醇4种物质，还能够水解赖氨酸脱羧酶。

表4

2、分子生物学鉴定

(1)菌株lw3基因测序

分离得到的菌株在lb肉汤培养基中培养36～48h，生长较为旺盛，本试验采取水提法抽提拟降解菌dna，具体提取步骤如下：

吸取1.5ml菌液于离心管中，1200rpm/min离心5min，弃上清液，加入无菌水1ml震荡混匀后再次离心清洗，重复以上操作2次；

2次清洗结束后，弃上清，加入100μl无菌水震荡混匀，沸水浴10min，再冰浴5min，再次离心，上清液即溶出的细菌dna，将dna送广州生工生物科技有限公司测序，并将测定得到的部分序列与genebank数据中进行同源性比较。

(2)鉴定结果

lw3的16srdna的核苷酸序列如seqidno:1所示，lw3与序列号为nc_016845.1(klebsiellapneumoniaesubsp.pneumoniaehs11286)菌株同源性高达98％，同属克雷伯菌属。因此本发明筛选获得的降解菌鉴定为克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)。该菌株已于2020年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmccno：61283，分类命名为klebsiellapneumoniaelw3，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

实施例3plw3对pcb3(4-氯联苯)降解体系的验证

(1)试剂

试验所用无机盐培养基为mm30无机盐液体培养基，pcb3(4-氯联苯)单品标准品。

(2)pcb3(4-氯联苯)降解验证体系

降解验证实验发生于体积为50ml的黑盖广口螺纹三角瓶中，反应体积为5ml。本降解试验设置pcb3为5个浓度梯度，分别为c1(5mg/l)、c2(10mg/l)、c3(20mg/l)、c4(40mg/l)和c5(60mg/l)，首先在降解体系中加入mm30无机盐液体培养基，再加入pcb3母液，待溶剂挥发完毕后以10％的接种量加入已制备好的降解菌菌液，于30℃，180rpm转速摇床培养，分别在接种后0、24、48、72、96h检测其pcb3的残留量，验证并观察其降解效果。

(3)pcbs定量检测

pcbs疏水性极强，难溶于水等极性溶液，而易溶于有机溶剂。所以降解体系溶液中pcbs的提取至关重要，为充分提取体系中的pcbs，本试验检测前加入破乳剂进行处理：

向降解体系中加入2ml已除水的正己烷，加入2g(nh4)2so4做为破乳剂，涡旋震荡1min后，于120×g转速下离心2min，尽可能萃取到溶液体系中的多氯联苯；

取出玻璃瓶，用干燥的玻璃滴管将上层有机相转移至干燥的玻璃离心管中，再向原玻璃瓶中加入1ml正己烷，重复上述震荡、离心步骤，将上层液体转移至玻璃离心管中；

加入少量无水硫酸钠干燥出去水分，用干燥玻璃滴管吸取上层液体转移到新的干燥玻璃离心管中，吸取适量于进样小瓶中，4℃保存，准备gc-uecd上样。

本试验通过外标法直接比较进行多氯联苯的定量检测。单位色谱峰面积代表的底物物质的量不同，数据处理时通过比较降解体系样品色谱图峰面积与标准品峰面积，根据二者峰面积比，结合已知标准品pcb3标准品浓度，进而计算出降解体系液体中pcb3的浓度，计算公式如下：

apcb3：为降解体系中添加的pcb3的峰面积；

apcb3标准：为购买的pcb3标准品的峰面积；

cpcb3标准：pcb3标准品的浓度(10ng/μl)。

(4)lw3对pcb3(4-氯联苯)的降解能力

图5和表5为不同降解时期pcbs的残留量，可以看出，lw3菌株c1(5mg/l)、c2(10mg/l)、c3(20mg/l)、c4(40mg/l)和c5(60mg/l)五组的pcb3(4-氯联苯)浓度下，降解率分别为97.12％、99.54％、99.44％、99.66％和99.72％，c1低浓度组降解率最低是97.12％，随着浓度增加降解率逐渐升高。

lw3在整个降解过程中c1组残留量始终保持最高，在接种24h后除c1低浓度组残留量在40％以上，其余4组的残留量均低于5％，48h后c1组残留量迅速下降但是还在15％以上，c5组残留量降低至0.84％，是5个浓度组中残留量最低的，后续48h内c5仍然保持残留量最低，c1残留量也逐渐降低，但最终残留量仍是最高为2.88％，c2、c3、c4、c5各组pcbs最终残留量分别是0.46％、0.56％、0.34％和0.28％。

表5lw3降解体系中pcbs不同时期的残余浓度

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广东海洋大学

<120>一株克雷伯菌klebsiellapneumoniaelw3菌株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1206

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

cgtggggcagctacacatgcagtcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgacga60

gcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaa120

acggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgc180

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gtatgt1206