一种成年牦牛瘤胃上皮细胞的分离培养方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种成年牦牛瘤胃上皮细胞的分离培养方法。


背景技术：

2.我国是世界上牦牛养殖大国，存栏量占世界牦牛养殖总量的92%以上，牦牛能够适应高寒、低氧及牧草匮乏的环境成为中国青藏高原地区的优势畜种之一，能够提供肉、牛奶、毛皮和燃料（粪便，作为生活燃料），在当地牧民的生活中起着至关重要的作用。并且随着人们生活水平的提高，牦牛肉的消费量不断提高，牦牛养殖业成为牧区经济的支柱产业。
3.瘤胃是反刍动物饲料消化代谢、营养吸收、养分沉积、免疫屏障等功能的重要器官。瘤胃发酵产生的挥发性脂肪酸主要是通过瘤胃上皮吸收，并作为能源物质经血液循环被带到机体各组织器官，为机体提供能量。此外，瘤胃上皮还具有四种屏障保护功能，即生物屏障、化学屏障、机械屏障及免疫屏障，使瘤胃内产生的一些有毒代谢产物如毒素、致病菌、脂多糖等不能通过瘤胃屏障，从而有效地防止一些代谢性疾病的发生。瘤胃上皮细胞的健康生长增殖对瘤胃上皮组织至关重要，是我们从分子机制研究牛瘤胃生理功能最佳的体外细胞模型。保证瘤胃上皮组织的健康是牦牛健康高效养殖的基础。
4.原代培养是获得瘤胃上皮细胞的唯一手段，瘤胃上皮是微生物附着、消化和代谢的主要场所，分离培养过程中容易被污染，目前国内外对牛瘤胃上皮细胞分离与培养方法较少而且技术不成熟，多采用幼龄牛瘤胃组织，细胞培养存活时间多在24h左右，很少能够得到稳定传代的瘤胃上皮细胞，幼龄动物成本较高，并且成功率低。针对牦牛瘤胃上皮细胞分离与培养的方法并没有。目前培养瘤胃上皮细胞的方法用酶消化法，但是收集细胞的效率同物种、组织块的大小、酶的类型、酶消化时间，酶消化的方式，酶的活性及浓度有关, 而牦牛生活环境特殊，不同于其他的牛，且成年牦牛瘤胃上皮细胞已经处于老化状态，因此，已有的专利文献获取瘤胃上皮细胞的方法并不适用于培养成年牦牛瘤胃上皮细胞，经检索，现有技术并未有关于培养成年牦牛瘤胃上皮细胞的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可靠性、可行性高的成年牦牛瘤胃上皮细胞的分离培养方法。
6.本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种成年牦牛瘤胃上皮细胞的分离培养方法，它包括以下步骤：s1. 采集成年牦牛瘤胃上皮组织，放入烧杯中用70%的乙醇清洗干净；将上皮组织边缘全部去除，剩余组织放在离心管中剪碎成糊状；s2. 将剪碎的上皮组织用i型胶原酶和胰蛋白酶的edta混合液消化后再用0.5%的胰蛋白酶消化四次，收集细胞悬液备用；s3. 将收集到的细胞悬液离心收集细胞沉淀后先用10%胎牛血清的mem培养液重悬细
胞，离心收集的细胞沉淀再用抗生素的pbs缓冲液重悬细胞沉淀，用45
µ
m尼龙滤网过滤细胞悬液，分散细胞，收集的单细胞悬液离心清洗细胞；其中，所述抗生素的pbs缓冲液为含有200u/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素，100
µ
g/ml庆大霉素和0.5ug/ml两性霉素b；s4. 清洗后的细胞沉淀用低糖dmem完全培养基重悬细胞后接种于培养瓶中培养，所述培养是在37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养；每隔40min换新的培养瓶培养去除成纤维细胞，如此重复四次，培养两天后更换培养基，细胞贴壁生长；其中，所述培养基为含有15%胎牛血清，15ng/ml表皮生长因子，0.5%胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂，110 mg/l丙酮酸钠，4mm l-谷氨酰胺，200u/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素，100
µ
g/ml庆大霉素和0.5ug/ml两性霉素b的低糖dmem完全培养基；s5. 待细胞贴壁稳定生长50%时，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%edta消化3min去除成纤维细胞，加入低糖dmem完全培养基继续培养，当细胞生长至培养瓶80%时进行传代或者冻存细胞，即得到高纯度的牦牛瘤胃上皮细胞。
7.进一步地，步骤s2中所述混合液中i型胶原酶、胰蛋白酶和edta的质量百分比含量分别为0.1%、0.25%和0.02%。
8.进一步地，步骤s2中i型胶原酶和胰蛋白酶的edta混合液消化是在37℃的水浴振荡器中处理30min，剪碎的上皮组织和混合液的体积比为1:2，消化后离心去除混合液后再用4℃预冷含有抗生素的pbs缓冲液离心清洗，所述含有抗生素的pbs缓冲液为含有200u/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素，100
µ
g/ml庆大霉素和0.5ug/ml两性霉素b。
9.进一步地，步骤s2中所述0.5%的胰蛋白酶消化的具体操作为：将经混合液消化后的上皮组织转移至2倍体积的0.5%胰蛋白酶放入37℃水浴振荡器中处理30min，将胰蛋白酶消化后的液体通过300目尼龙滤网过滤消化液收集细胞悬液，同时将细胞悬液用含有10%胎牛血清的mem培养液终止细胞消化，使用d-hanks溶液清洗组织和滤网上残留的细胞并收集起来，再加新的0.5%的胰蛋白酶如此循环三次，后三次消化时间依次为20min，20min和15min。
10.进一步地，步骤s3中所述离心的方法为4℃离心机转速为3000rpm，离心时间为8min。
11.进一步地，步骤s3中所述分散细胞使用45
µ
m细胞筛分散细胞，收集细胞悬液并分散细胞两次。
12.进一步地，步骤s5中所述传代是当细胞生长至培养瓶80%时用0.25%胰蛋白酶-0.02%edta胰蛋白酶消化5-10min进行收集细胞传代。
13.进一步地，步骤s5中所述冻存的冻存液为dmem培养液，胎牛血清与dmso以体积比为6:3:1的比例配置。
14.本发明具有以下优点：1、本发明方法成功分离培养出了状态良好的成年牦牛瘤胃上皮细胞，解决了现有技术只能从犊牛身上分离瘤胃上皮细胞的难题，显著节约了成本，且在屠宰场即可取样，采用方便；本发明方法为牦牛瘤胃上皮生理调控和营养吸收机制提供试验细胞模型；2、本发明将采集的成年牦牛瘤胃上皮组织用70%的无水乙醇进行洗涤，能有效去除杂质和污染物，相比于传统的抗生素洗涤，节约了成本，减少了污染；
硒添加剂，110 mg/l丙酮酸钠，4mm l-谷氨酰胺，200u/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素，100
µ
g/ml庆大霉素和0.5ug/ml两性霉素b的低糖dmem完全培养基；s5. 待细胞贴壁稳定生长50%时，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%edta消化3min去除成纤维细胞，加入低糖dmem完全培养基继续培养，当细胞生长至培养瓶80%时用0.25%胰蛋白酶-0.02%edta胰蛋白酶消化5-10min进行收集细胞传代；当细胞生长至培养瓶80%时冻存细胞，冻存液为dmem培养液，胎牛血清与dmso以体积比为6:3:1的比例配置，如图4所示。
20.经观察，上述方法所得的牦牛瘤胃上皮细胞24～48 h开始贴壁，3到4天完成铺层，如图2和图3所示，所得的细胞形态均一，呈铺路石样，说明本发明方法能有效去除微生物的污染，降低对细胞的损伤，胶原酶和胰蛋白酶的结合使用有效减少了消化次数，细胞活性较高，保证细胞能够快速进入对数生长期。
21.对比例1（1）使用灭菌的剪刀和镊子，牦牛处死后，取瘤胃后腹盲囊组织，剪取10cm
×
10cm大小瘤胃上皮组织，使用自来水多次冲洗，去除瘤胃内容物，再使用含有700u/ml青霉素，0.7mg/ml链霉素，350
µ
g/ml庆大霉素和1.5ug/ml两性霉素b的4℃预冷pbs缓冲液仔细冲洗干净；（2）瘤胃组织装入含有抗生素的4℃预冷pbs缓冲液的自封袋中置于冰上带回实验室；在实验室中使用蒸馏水仔细清洗干净后，再用含有抗生素的4℃预冷pbs缓冲液清洗，放入含有抗生素的4℃预冷pbs缓冲液的烧杯中带入超净台中；（3）将组织放入含有抗生素的4℃预冷pbs缓冲液的15cm培养皿中，手动将瘤胃组织上的肌肉层和瘤胃上皮分离；（4）就分离后的瘤胃上皮组织继续使用含有4℃预冷抗生素的pbs缓冲液清洗3次，组织进行剪碎成糊状，；（5）将剪碎的上皮组织转入含有5%胰蛋白酶的50ml离心管中，组织与胶原酶的体积比为1：2，放入37℃水浴振荡器中处理30min。前两次消化的细胞滤液丢弃，第三次将胰蛋白酶消化后的液体通过300目尼龙滤网过滤消化液收集细胞悬液，同时将细胞悬液用含有10%胎牛血清和2倍抗生素的mem培养液终止细胞消化，尼龙滤网过滤后添加少量含有200u/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素和0.5ug/ml两性霉素b的d
′
hanks溶液清洗组织以及滤网上残留的细胞进行收集干净，如此消化六次；（6）细胞悬液3000rpm离心8min，收集细胞沉淀，10%胎牛血清的mem培养液重悬细胞，离心清洗细胞；（7）清洗后的细胞沉淀，含有10%胎牛血清和1倍抗生素的mem完全培养基重悬细胞后，接种于培养瓶中培养；（8）每隔40min换新的培养瓶如此重复四次，去除成纤维细胞；24h后更换培养基，观察细胞状态，如图1所示。
22.通过以上实验可知，对比例1中的胰蛋白酶消化力度太大，严重损害细胞致使细胞无法贴壁生长，收集到的大多数为死细胞，且大量抗生素的使用增加了成本。本发明实施例1的牦牛瘤胃上皮细胞分离方法所得的细胞2-3天开始贴壁生长，4天就可以处于细胞增殖对数期，4-5天完成铺层，得到细胞活力较高能够稳定传代的瘤胃上皮细胞。
23.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。