一种荧光化合物及其制备方法、荧光修饰核苷酸、试剂盒与流程

1.本发明涉及有机化合物试剂技术领域，具体涉及一种荧光化合物及其制备方法、荧光修饰核苷酸、试剂盒，荧光修饰核酸应用于核酸测序。


背景技术：

2.已发现荧光染料作为检测标记广泛用于分子生物学、细胞生物学和分析遗传学的用途。例如，荧光-标记的寡核苷酸现在在多种不同试验中被使用，包括核苷酸测序、荧光原位杂交、基于核苷酸阵列的杂交试验、荧光极化研究和核酸扩增试验。
3.dna测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在dna双螺旋结构被发现后不久就有人报道过dna测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年a.m.maxam和w.gilbert发明了化学降解法。sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止dna测序的主流。然而随着科学的发展，传统的sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（next-generation sequencing)应运而生。第二代测序技术的基本原理是边合成边测序，用不同颜色的荧光标记四种不同的dntp，当dna聚合酶合成互补链时，每添加一种dntp就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测dna的序列信息。
4.然而，采用不同颜色荧光标记核苷酸进行多重荧光检测存在限制荧光标记物选择的多重因素。首先，由于染料的吸收带通常被宽泛的分开，当若干荧光染料一起使用时，需要选择能够被合适的光谱分辨的染料化合物结合使用，并且需要考虑尽量扩大不同荧光染料发光信号的可区分性；其次，由于许多激发方法采用高功能激光，因此需要染料化合物具有足够的光稳定性以经受检测过程中的激光激发；另外，最重要的是需要考虑荧光染料必须与使用的其他试剂如缓冲液、聚合酶、连接酶等是相容的，尤其是需要荧光染料修饰后的核酸是聚合酶能够识别的。并且随着测序技术的不断发展，人们研究发现具有改进的荧光性质（例如荧光强度、荧光最大值的位置以及荧光带的形状）的荧光染料分子可以改进核酸测序的速度和准确性。由于测序反应的缓冲液环境、测序反应的温度环境以及核酸的碱基结构等均会影响荧光化合物的发光性能，比如荧光最大值、荧光强度等。由此，人们逐渐开始通过调整和改进荧光化合物的结构，提高荧光化合物与核碱基之间的序列特异性作用性能，进而提高荧光化合物在测序过程中的发光性能。同时，通过荧光化合物结构的改进，提高修饰核酸并入的效率，降低测序的误差水平并且减少核酸测序中试剂的使用，降低核酸测序的成本，成为了研究热点。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供一种荧光化合物，能够作为核酸测序的修饰核苷酸的荧光修饰结构，提高荧光修饰核酸的聚合酶亲和力，提高掺入效率，提高测序质量。
6.本发明的目的之二是提供一种荧光化合物的制备方法。
7.本发明的目的之三是提供连接本发明荧光化合物进行修饰的荧光修饰核苷酸，应用于边合成边测序系统，提高修饰核酸的掺入效率，提高测序质量。
8.同时，本发明还在于提供一种试剂盒，包含本发明提供的荧光修饰核苷酸，应用于核酸测序。
9.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种荧光化合物，由式（ⅰ）所示的化学结构通式的化合物形成：（ⅰ）；其中p为1~5的整数；m、n为1~3的整数；r1、r2各自独立地为烷基或取代的烷基；r3、r4各自独立地为h、卤素、so
3-、磺酰胺或稠合至相邻碳原子的另一个环；r1、r2、 r3、r4至少有一个具有磺酸基团；r5为or6或nr6r7，其中r6和r7独立地为h、烷基或被取代的烷基，芳基或被取代的芳基。
10.需要解释的是，由式（ⅰ）所示的化学结构通式的化合物形成是指荧光化合物的结构可以是式（ⅰ）所示的化学结构，也可以是式（ⅰ）所示的化学结构的内消旋体，也可以是式（ⅰ）所示化学结构的其他共振结构。
11.本发明荧光化合物用作以荧光作为检测信号的标记物，通常通过共价连接、表面缀合或其他形式附接至检测过程发生反应的试剂中，比如蛋白试剂、核酸试剂等；本发明具体以作为核苷酸的荧光修饰基团对本发明荧光化合物的用途进行举例说明。具体的，将本发明荧光化合物通过连接基附接至核苷酸形成修饰核苷酸，使修饰核苷酸具有独特的荧光性能，通过检测荧光信号判断修饰核苷酸的存在，甚至判断修饰核苷酸的种类。本发明荧光化合物通常是通过-cor
5-作为连接基附接至核苷酸形成修饰核苷酸，本发明创造性的改进-cor
5-与荧光化合物核心结构之间的连接结构，采用含有醚键的杂烷基结构-(ch2)
m-o-(ch2)
n-作为连接结构将连接基-cor
5-连接至荧光化合物核心结构，提高荧光化合物作为修饰分子形成的修饰核苷酸用作核酸测序反应过程中的掺入效率，提高测序质量。
12.本发明的一个最优选实施例中，上述荧光化合物结构中m为3，n为1；r3为h，r4为磺酰胺；r1为-(ch2)
4 so
3-，r2为甲基；p为2或4；应当可以理解的是，在不影响本发明声称的荧光化合物的荧光性能和作为修饰分子形成修饰核苷酸的其他性能的前提下，本发明荧光化合物核心结构不同位置的取代基也可以为其他结构取代基，m、n为1~3的整数；p为1~5的整数。
13.上述荧光化合物的制备方法，以包括式（
ⅰ
）、式（
ⅱ
）、式（
ⅲ
）所示化合物为原料制备而成：
（
ⅰ
）、（
ⅱ
）、（
ⅲ
）；其中r1、r2各自独立地为烷基或取代的烷基；r3、r4各自独立地为h、卤素、so
3-、磺酰胺或稠合至相邻碳原子的另一个环；r1、r2、 r3、r4至少有一个具有磺酸基团；t为1~5的整数。
14.上述荧光化合物通过连接基r5附接至核苷酸形成荧光修饰核苷酸，通常附接位置为核苷酸嘧啶碱基的c5位或7-脱氮嘌呤碱基的c7位。并且为了配合边合成边测序的核酸测序过程，荧光修饰核酸的的核糖或脱氧核糖的3’oh位置共价附接阻断基团，本发明一个实施例优选的，阻断基团为甲基叠氮。
15.本发明还提供一种用于核苷酸测序的试剂盒，包含四种核苷酸试剂，其中一种核苷酸试剂为上述荧光修饰核苷酸，其他三种核苷酸试剂采用不同的荧光化合物进行标记修饰，每种荧光化合物具有不同的最大吸收度且每种荧光化合物相互之间是可区分的；本发明另外的实施例中提供一种用于核苷酸测序的试剂盒，包含四种核苷酸试剂，其中第一种核苷酸采用上述荧光化合物作为荧光修饰基团，第二种核苷酸采用与第一种核苷酸结构不同的上述荧光化合物作为荧光修饰基团，第三种核苷酸修饰与第一种核苷酸和第二种核苷酸不同的荧光修饰基团，第四种核苷酸不带有荧光修饰基团；作为进一步优选的，本发明另外的实施例中提供一种用于核苷酸测序的试剂盒，包含四种核苷酸试剂，其中第一种核苷酸采用上述荧光化合物作为荧光修饰基团，第二种核苷酸采用与第一核苷酸结构不同的上述荧光化合物作为荧光修饰基团，第三种核苷酸采用第一种核苷酸荧光修饰基团和第二种核苷酸银光修饰基团的混合物作为荧光修饰基团，第四种核苷酸不带有荧光修饰基团。测序仪器可以包含在不同的波长下操作的两种激光，实现对四种修饰核苷酸的识别。
16.上述荧光化合物、修饰核苷酸以及试剂盒能够用于核苷酸测序之外，还可以用于表达分析、杂交分析、细胞测定或蛋白质测定等。上述荧光化合物可以结合具体的应用场景附接至底物部分，底物部分可以是需要荧光标记修饰的任何分子或物质，例如核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、配体、颗粒、固体表面、有机或无机聚合物、染色体、细胞核、活细胞以及其组合或集合物；荧光化合物可以结合实际应用场景通过疏水吸引力、离子吸引力和共价附接等多种方式附接至相应的底物部分，优选的，通过-cor5转变为酰胺或酯结构通过连接基共价附接至底物部分。
附图说明
17.图1是试验例1中不同修饰核苷酸的荧光性能稳定性对比例图；图2是试验例2中不同修饰核苷酸的荧光性能稳定性对比例图。
具体实施方式
18.定义：除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所述技术领域普通技术人员通常理解相同的含义。
19.术语“烷基”指的是c1-c20烃并且可以包括c3-c10非芳族的碳环，烷基可以包含一个或更多个不饱和的基团，比如烯基和炔基。
20.术语“卤素”指的是氟、氯、溴、或碘，通常涉及核心结构中h原子的取代。
21.术语“被取代的烷基”指的是上述烷基、烯基或炔基，任选地被卤素、氰基、so
3-、sra、ora、nrbrc、氧代、conrbrc、cooh和coorb进一步取代。ra、rb和rc可以各自独立地选自h、烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、芳基和被取代的芳基。其中被取代的烷基、被取代的烯基和被取代的炔基可以任选地通过选自o、nrb、s、s-o以及类似物至少一个杂原子或基团被中断。被取代的烷基还包括另外的芳基或被取代的芳基部分。
22.本发明技术方案的详细描述：下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
23.本发明提供一种荧光化合物，其具有式（ⅰ）所示的化学结构通式，或式（ⅰ）所示的化学结构通式化合物的内消旋体或共振结构：（ⅰ）；其中p为1~5的整数；m、n为1~3的整数；r1、r2各自独立地为烷基或取代的烷基；r3、r4各自独立地为h、卤素、so
3-、磺酰胺或稠合至相邻碳原子的另一个环；r1、r2、 r3、r4至少有一个具有磺酸基团；r5为or6或nr6r7，其中r6和r7独立地为h、烷基或被取代的烷基，芳基或被取代的芳基。
24.作为优选的，本发明的其中一个实施例提供一种荧光化合物，具有式（ⅱ）所示化学结构通式，或式（ⅱ）所示化学结构通式的内消旋体或共振结构：
（ⅱ）；其中p为1~5的整数；m、n为1~3的整数；r3、r4各自独立地为h、卤素、so
3-、磺酰胺或稠合至相邻碳原子的另一个环；r5为or6或nr6r7，其中r6和r7独立地为h、烷基或被取代的烷基，芳基或被取代的芳基。
25.作为进一步优选的，本发明的另一个实施例中提供一种荧光化合物，具有式（ⅲ）所示化学结构通式，或式（ⅲ）所示化学结构通式的内消旋体或共振结构：（ⅲ）其中p为1~5的整数；m、n为1~3的整数；r5为or6或nr6r7，其中r6和r7独立地为h、烷基或被取代的烷基，芳基或被取代的芳基。
26.上述荧光化合物结构中cor5作为连接基团的一部分通过将荧光化合物附接至参与检测反应需要产生荧光信号的检测试剂或者检测载体上，比如蛋白、磁微粒、核酸等，实现对检测试剂和检测载体的荧光标记。优选的，上述荧光化合物作为核苷酸的修饰结构形成修饰核苷酸作为反应试剂参与核苷酸测序反应，以cor5作为连接基团的一部分将荧光化合物连接至核苷酸的相应位置；本发明创造性的改进-cor
5-与荧光化合物核心结构之间的连接结构，采用含有醚键的杂烷基结构-(ch2)
m-o-(ch2)
n-作为连接结构将连接基-cor
5-连接至荧光化合物核心结构，提高荧光化合物作为修饰分子形成的修饰核苷酸用作核酸测序反应过程中的掺入效率，提高测序质量。下面将结合具体结构的荧光化合物以及形成的修饰核苷酸分析作为举例说明，对上述有益效果进行表征和验证：
实施例1本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式（ⅳ）所示：（ⅳ）实施例2本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式（
ⅴ
）所示：（
ⅴ
）实施例3本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式（ⅵ）所示：（ⅵ）实施例4本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式（ⅶ）所示：（ⅶ）实施例5本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式（
ⅷ
）所示：
（
ⅷ
）实施例6本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式（
ⅳ‑
1）所示：（
ⅳ‑
1）实施例7本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式（
ⅴ‑
1）所示：（
ⅴ‑
1）实施例8本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式（
ⅵ‑
1）所示：（
ⅵ‑
1）实施例9本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式（
ⅶ‑
1）所示：（
ⅶ‑
1）实施例10本实施例提供一种荧光化合物，其化学结构通式如式（
ⅷ‑
1）所示：
（
ⅷ‑
1）上述实施例1~10荧光化合物作为修饰分子对核苷酸进行荧光修饰时，通常需要中间连接基结构将荧光化合物附接至核苷酸的相应位置，通常需要首先将实施例1~10荧光化合物的cooh结构与形成连接基结构的化合物反应形成-coor6结构或-conr6r7结构，通过r6或r6r7结构将荧光化合物附接至核苷酸形成荧光修饰核酸，or6、nr6r7结构相当于荧光修饰核酸化合物结构中的linker结构，本领域技术人员公知的linker结构均可适用于本技术，例如 r6和r7可以选自烷基或被取代的烷基，芳基或被取代的芳基，并且通常linker结构中包括化学可裂解或者物理/生物可切割结构。本发明下述实施例选择一种具体的linker结构对本发明的荧光修饰核苷酸进行举例说明。
27.实施例11本实施例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如式（
ⅸ
）所示：（
ⅸ
）实施例12本实施例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如式（
ⅹ
）所示：（
ⅹ
）上述实施例中将式（
ⅸ
）和式（
ⅹ
）荧光化合物通过具体的linker结构附接至腺嘌呤核苷酸的c7位形成的荧光修饰核苷酸，其仍然能够响应酶促发生的沃森-克里克碱基配对反应。应当可以理解的是，本发明其他实施例提供的其他荧光化合物同样可以通过
linker结构附接至腺嘌呤核苷酸形成新的荧光修饰核苷酸，同样应当可以理解的是，本发明实施例提供的荧光化合物也可以通过linker结构附接至其他类型的核苷酸形成荧光修饰的核苷酸，对于嘧啶类核苷酸的附接位置为嘧啶碱基的c5位，形成的荧光修饰核苷酸同样能够响应酶促发生的沃森-克里克碱基配对反应。
28.另外，需要解释的是上述实施例中针对荧光化合物与核苷酸之间的linker结构进行了举例说明，为了避免荧光化合物分子影响dna聚合酶对核苷酸的识别能力，通常会针对linker结构进行延长改进，比如增加间隔基单元等，应当可以理解的是，本领域技术人员公知的其他结构的linker同样适用于本发明修饰核酸，只需要形成的荧光修饰核酸能够正常响应酶促发生的沃森-克里克碱基配对反应即可。
29.另外，目前常用的边合成边测序的高通量测序方法，不同的核苷酸三磷酸酯（a、t、c和g）分别用独特且相互可区分的荧光分子修饰核苷酸，在测序反应中，加入修饰的核苷酸试剂，通过检测并入测序模板多核苷酸链上的独特荧光分子的信号判断并入的核苷酸的种类，进而实现对多核苷酸链的测序；通常需要修饰的核苷酸具有3
’‑
oh阻断基团，阻断基团包括可裂解或切割去除结构，控制聚合延伸反应的继续进行，在完成一次荧光信号检测后，将并入的修饰的核苷酸的3
’‑
阻断基团和荧光分子通过相同的或者不同的化学或酶促或者物理方法移除，暴露可延伸的新生链用于下一步的修饰核苷酸的并入，实现核苷酸链的持续测序。因此，本发明实施例提供的荧光修饰核酸能够作为边合成边测序的试剂盒中的核苷酸试剂，并且当本发明荧光修饰核酸作为核苷酸试剂进行核苷酸测序反应时，荧光修饰核酸的核糖或脱氧核糖的3’oh位置共价附接阻断基团，该阻断基团通常是化学可裂解或物理/生物可切割的，比如甲基叠氮。同时，上述用于核苷酸测序的试剂盒还包括除本发明实施例提供的荧光修饰核酸之外的其他三种核苷酸试剂，其他三种核苷酸试剂可以是具有荧光标记的或不具有荧光标记的，作为优选的，其他三种核苷酸试剂均具有不同的荧光修饰，并且每种荧光化合物具有不同的最大吸收度且每种荧光化合物相互之间是可区分的。
30.作为进一步优选的，本发明试剂盒包含四种荧光标记的核苷酸，其中第一种核苷酸采用本发明荧光化合物作为标记，第二种核苷酸采用不同与本发明荧光化合物光谱发光颜色的化合物作为标记，第三种核苷酸采用第一种和第二种核苷酸的荧光修饰基团的混合物作为标记，第四种寡核苷酸不连接荧光标记物，具体的第一种核苷酸、第二种核苷酸、第三种核苷酸和第四种核苷酸分别形成“红”、“绿”、“红/绿”以及“深色”的光信号。
31.实施例13本实施例提供一种实施例12所示荧光修饰核酸的制备方法，以式（
ⅰ‑
1）、式（
ⅱ‑
1）、式（
ⅲ‑
1）所示化合物为原料制备而成：（
ⅰ‑
1）、（
ⅱ‑
1）、（
ⅲ‑
1）、
（
ⅳ
）、（
ⅴ
）具体操作步骤如下：1）合成荧光化合物：
①
取溴丙醇加入有机溶剂中，加入溴乙酸乙酯，低温环境下，缓慢加入nah，低温反应一定时间后，升温至室温继续搅拌反应，tlc（pe/ea体系）检测反应完全后，调节反应体系的ph，萃取有机相，干燥浓缩柱分离制得中间产物1；反应方程式如下式（1）所示：（1）
②
取4-肼基苯磺酰胺盐酸盐加入到有机溶剂中，加入3-甲基-2-丁酮，升温继续反应，tlc检测反应完全，降温至室温，加入萃取剂过滤，抽干得中间产物2；反应方程式如式（2）所示：（2）
③
取中间产物2加入到单口瓶中，加入有机溶剂、中间产物1，加热反应，tlc检测反应完全，降温至室温，加入萃取剂过滤得中间产物3；反应方程式如式（3）所示：（3）
④
取中间产物3溶于有机溶剂中，加入氢氧化钠，加热反应，tlc检测反应完全，浓缩除去有机溶剂，得式（
ⅰ‑
1）所示原料；反应方程式如式（4）所示：（4）
⑤
取2甲基乙酰乙酸乙酯，加入有机溶剂，低温下加入催化剂，升至室温，加入丁磺酸内酯，加热回流反应，旋干溶剂，加水溶解，调节ph，过滤，旋干溶液得油状物，作为中间产
物4；取中间产物4，加入有机溶剂溶解，滴加氢氧化钾水溶液，加热回流，旋干溶剂，加水溶解，调节ph，旋干，多级萃取得油状物，作为中间产物5；取中间产物5，加入有机溶剂，二苯肼盐酸盐，加热反应完全后，旋干，加入乙酸乙酯洗涤，倒出有机相，旋干得油状物，作为式（
ⅱ‑
1）所示原料；整个反应方程式如下式（5）所示：（5）
⑥
取式（
ⅰ‑
1）所示原料，溶于有机溶剂中，加入n,n-二苯丙脒，加热反应，tlc检测反应完全后，浓缩除去有机溶剂，将残渣重新溶解后，加入式（
ⅱ‑
2）所示原料，加热反应，tlc检测反应完全后，浓缩除去溶剂，拌样柱分离得式（
ⅳ‑
1）所示化合物；整个反应方程式如式（6）所示荧光化合物：（6）2）荧光化合物连接linker结构：式（
ⅳ‑
1）所示荧光化合物溶于dmf中，加入diea、tstu，室温搅拌反应，加入式（
ⅳ
）所示化合物的有机溶液，室温搅拌，tlc检测，反应完全，浓缩除去溶剂，拌样柱分离得中间产物6；反应方程式如式（7）所示：（7）3）制备荧光修饰核酸：取中间产物6溶于dmf中，加入diea、tstu，室温搅拌5min，加入式（
ⅴ
）所示化合物的有机溶液，室温搅拌2h，hplc检测反应完全，加入0.1m teab，室温搅拌30min，浓缩除去溶剂，分离纯化，得式。
32.称取步骤2）制备的中间产物3 5mg，加入dmf 2ml溶解，加入diea 100μl，搅拌10min，加入tstu 4mg，10min，tlc监测原料反应完全，称取预先合成的化合物（
ⅴ
）所示化合物15mg，溶解在300μl 0.1 m的teab溶液中，加入到反应中，20min，分离纯化，得（
ⅹ
）所示荧光修饰核苷酸；反应方程式如式（8）所示：
（8）需要说明的是按照实施例13同样的方法原理能够合成以实施例1~10所示荧光化合物作为修饰分子的荧光修饰核酸，只需要依据终产物的化合物结构替换相应的原料即可。
33.对比例1本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式（
ⅸ‑
1）所示：（
ⅸ‑
1）对比例2本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式（
ⅹ‑
1）所示：（
ⅹ‑
1）对比例3本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式（
ⅸ‑
2）所示：
（
ⅸ‑
2）对比例4本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式（
ⅹ‑
2）所示：（
ⅹ‑
2）对比例5本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式（
ⅸ‑
3）所示：（
ⅸ‑
3）对比例6本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式（
ⅸ‑
4）所示：
（
ⅸ‑
4）对比例7本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构通式如下式（
ⅹ‑
3）所示：（
ⅹ‑
3）对比例8本对比例提供一种荧光修饰核苷酸，其化学结构式如式（
ⅹ‑
4）所示：（
ⅹ‑
4）试验例1将实施例11、对比例1、对比例3、对比例5和对比例6提供的荧光修饰核苷酸分别配置成相同浓度的溶液（0.5μmol/l），采用荧光分光光度计，检测不同修饰核苷酸溶液随着温度升高荧光强度的衰减比率（20℃、40℃、60℃），结果如图1所示：不同的荧光修饰核苷酸在结构上的区别主要体现在cooh与荧光化合物核心结构之间的连接结构，主要差异在于是否包含醚键，那么由图1所示的结果可知，cooh与荧光化合物核心结构之间的连接结构包含醚键或者烷基直链结构，在荧光化合物核心结构不变的情况下，荧光修饰核苷酸的荧光性能的温度稳定性没有显著的变化。
34.试验例2将实施例12、对比例2、对比例4、对比例7和对比例8提供的荧光修饰核苷酸分别配
置成相同浓度的溶液（0.5μmol/l），采用荧光分光光度计，检测不同修饰核苷酸溶液随着温度升高荧光强度的衰减比率（20℃、40℃、60℃），结果如图2所示：不同的荧光修饰核苷酸在结构上的区别主要体现在cooh与荧光化合物核心结构之间的连接结构，主要差异在于是否包含醚键，那么由图2所示的结果可知，cooh与荧光化合物核心结构之间的连接结构包含醚键或者烷基直链结构，在荧光化合物核心结构不变的情况下，荧光修饰核苷酸的荧光性能的温度稳定性没有显著的变化。
35.试验例3检测不同荧光修饰核苷酸的聚合酶亲和力kd值：检测方法：50ul 反应体系，therminator
™ꢀ
iii dna polymerase 1ul，1* thermopol reaction buffer ，10um ona26, 待测核苷酸a浓度0.1um、0.2um、0.4um 0.8um、1.6um、5um、10um分别 65℃反应10min，25mm edta终止并进行稀释后用aglient dna 1000试剂盒分析掺入速率并根据米氏方程计算kd；其中ona26为发卡结构核酸底物，其序列为gactgcgccgcgccatcatgacagctagttctagctgtcatgatggcgcggcgc，下划线部分互补配对，退火形成发卡结构，结果如下表1~2所示：表1 实施例11对比例1对比例3对比例5对比例6kdμm0.542.511.90.752.0表2 实施例12对比例2对比例4对比例7对比例8kdμm0.552.822.110.822.1由上述表1和表2所示的结果可知，相比cooh通过直链烷基结构连接至荧光化合物核心结构的荧光修饰基团修饰的核苷酸a，本发明cooh通过含有醚键的杂烷链-(ch2)
m-o-(ch2)
n-（m、n=1~3）连接至荧光化合物的核心结构的荧光修饰基团修饰的核苷酸a，具有更高的聚合酶亲和力，提高修饰核苷酸的掺入效率，降低修饰核苷酸的用量，降低试剂成本。
36.试验例4通过替换市售高通量测序试剂盒中的修饰核苷酸a（其中a采用包括至少两种不同荧光化合物的混合物进行标记），对人模板进行测序，对采用不同结构的修饰核苷酸a进行测序的各项质量数据进行统计，具体的试验设计及分组如下：第一组：修饰核苷酸a包括对比例1+对比例2；第二组：修饰核苷酸a包括对比例1+实施例12；第三组：修饰核苷酸a包括实施例11+对比例2；第四组：修饰核苷酸a包括实施例11+实施例12；第五组：修饰核苷酸a包括对比例1+对比例4；第六组：修饰核苷酸a包括对比例3+对比例2；第七组：修饰核苷酸a包括对比例5+对比例7；第八组：修饰核苷酸a包括对比例6+对比例8，测序过程的各项数据统计结果如下表3所示：表3
组别测序循环数density（k/mm2）cluster pf（%）phas/prephas%＞=q30（100cycles）错误率（%）第一组100256620.333/0.56656.13.55第二组10025674.10.265/0.805722.12第三组10025679.40.247/0.71276.61.98第四组10025690.40.159/0.12084.10.75第五组100256650.301/0.91560.12.98
第六组100256630.324/0.92358.43.12第七组10025675.50.274/0.78574.32.05第八组10025672.30.287/0.90165.72.43
由上述表3统计结果可知，相比cooh通过直链烷基结构连接至荧光化合物核心结构的荧光修饰基团，本发明cooh通过含有醚键的杂烷链-(ch2)
m-o-(ch2)
n-（m、n=1~3）连接至荧光化合物的核心结构的荧光修饰基团，在作为核苷酸的荧光标记结构形成修饰核苷酸试剂时，能够提高测序质量，提高测序结果的准确性。
37.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。