基于解脂耶氏酵母的发酵方法、发酵液及发酵液的应用与流程

1.本申请属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种基于解脂耶氏酵母的发酵方法、发酵液及发酵液的应用。


背景技术：

2.解脂耶氏酵母(yarrowia iipolytica)是一种优良的脂肪酶及单细胞蛋白生产菌。该酵母具有以下特点：(1)被美国食品药品管理局认定是安全菌株(generally regarded as safe，gras)，在食品、医药、饲料工业上具有广泛的应用前景；(2)能合成大量的胞内蛋白质，并且能够分泌蛋白酶等；(3)生长周期短、容易培养，且菌体蛋白质含量高，是良好的饲料酵母。
3.解脂耶式酵母表达系统安全可靠，无抗性基因、无缺失蛋白酶，能经济高效表达活性分子，具备产业化开发前景。但目前脂耶式酵母发酵工艺采用的是常规分批发酵法发酵，其发酵程度低、易染菌，不利于工业大规模生产。
4.因此，相关技术有待改进。


技术实现要素：

5.本申请的目的在于提供一种基于解脂耶氏酵母的发酵方法、发酵液及发酵液的应用，旨在解决现有脂耶式酵母发酵工艺发酵程度低、易染菌的技术问题。
6.为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
7.第一方面，本申请提供一种基于解脂耶氏酵母的发酵方法，包括如下步骤：
8.将解脂耶氏酵母菌种活化，得到种子液；
9.将所述种子液置于液体培养基中在酸性条件下进行搅拌发酵处理；
10.其中，
11.所述液体培养基包括：20
‑
30g/l葡萄糖，8
‑
16g/l酵母提取物，0.1
‑
0.3g/l无水硫酸镁，2
‑
3g/l磷酸二氢钾；
12.所述搅拌发酵处理的过程中，溶氧浓度保持在20％
‑
40％，当溶氧浓度低于20％时，添加甘油和酵母蛋白胨。
13.本申请提供的发酵方法是一种基于解脂耶式酵母的高密度发酵方法，通过选用合适的培养基，在酸性条件下持续进行搅拌发酵，搅拌发酵过程溶氧浓度始终保持在20％
‑
40％，且当溶氧浓度低于20％补充甘油和酵母蛋白胨，补料中酵母蛋白胨能补充能量，而甘油能抑制大量丝状解脂耶式酵母形成，使更适合高密度发酵和产生目的蛋白的球状解脂耶式酵母更好地生长，同时甘油能抑制其他杂菌生长，这样可以减少染菌风险；该发酵方法发酵程度高，可显著提高发酵产物中的解脂耶式酵母菌细胞干重，因此具有很好的应用前景。
14.第二方面，本申请提供一种发酵液，所述发酵液通过本申请所述的发酵方法进行发酵得到。
15.本申请提供的发酵液由本申请特有的发酵方法进行发酵得到。因此，该发酵液发
酵程度高，杂菌少，而且解脂耶式酵母菌细胞干重高，具有很好的应用前景。
16.第三方面，本申请提供一种应用，即本申请所述的发酵液在猪饲料中的应用。
17.本申请通过对该发酵液拌料饲喂和饮水添加饲喂评估其对断奶仔猪的作用效果，结果显示显著提高了试验仔猪体重，并且在试验期间仔猪未出现腹泻情况，对于仔猪日采食量和平均日增重均有提高的趋势，因此具有提高仔猪免疫力和促进生长的作用，可以很好地用于猪饲料中。
附图说明
18.为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1是本申请实施例提供的基于解脂耶氏酵母的发酵方法的流程示意图；
20.图2是本申请实施例提供的发酵方法中，液体培养基碳源优化结果示意图；
21.图3是本申请实施例提供的发酵方法中，液体培养基氮源优化结果示意图；
22.图4是本申请实施例提供的发酵方法中，液体培养基无机盐优化结果示意图；
23.图5是本申请实施例提供的发酵方法中，液体培养基响应面优化试验结果分析图。
具体实施方式
24.为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
25.本申请实施例第一方面提供一种基于解脂耶氏酵母的发酵方法，如图1所示，该发酵方法包括如下步骤：
26.s01：将解脂耶氏酵母菌种活化，得到种子液；
27.s02：将所述种子液置于液体培养基中在酸性条件下进行搅拌发酵处理；
28.其中，
29.所述液体培养基包括：20
‑
30g/l葡萄糖，8
‑
16g/l酵母提取物，0.1
‑
0.3g/l无水硫酸镁，2
‑
3g/l磷酸二氢钾；
30.所述搅拌发酵处理的过程中，溶氧浓度保持在20％
‑
40％，当溶氧浓度低于20％时，添加甘油和酵母蛋白胨。
31.本申请提供的发酵方法是一种基于解脂耶式酵母的高密度发酵方法，通过选用合适的培养基，在酸性条件下持续进行搅拌发酵，搅拌发酵过程中溶氧浓度始终保持在20％
‑
40％，且当溶氧浓度低于20％补充甘油和酵母蛋白胨，补料中酵母蛋白胨能补充能量，而甘油能抑制大量丝状解脂耶式酵母形成，使更适合高密度发酵和产生目的蛋白的球状解脂耶式酵母更好地生长，同时甘油能抑制其他杂菌生长，这样可以减少染菌风险；该发酵方法发酵程度高，可显著提高发酵产物中的解脂耶式酵母菌细胞干重，因此具有很好的应用前景。
32.在上述步骤s01中，将解脂耶氏酵母菌种活化，得到种子液的步骤包括：将冷冻保藏的所述解脂耶氏酵母菌种在平板上划线培养，然后挑出单菌落涂斜面，从所述斜面上接
种于酵母浸出粉胨葡萄糖(ypd)液体培养基中，以10％接种量扩培，得到所述种子液。具体地，可以将
‑
80℃甘油管中冷冻保藏的菌株在平板上划线，然后在30℃下培养24h。后续从斜面上接种于ypd液体培养基中。本申请实施例中，可以以10％接种量扩培至1.5l种子液。
33.在上述步骤s02中，单因素正交试验结果分析，液体培养基以葡萄糖为碳源，以酵母提取物为氮源，以无水硫酸镁为一种无机盐。如图2所示(图中，1
‑
蔗糖；2
‑
干油；3
‑
山梨醇；4
‑
葡萄糖；5
‑
麦芽糖；6
‑
乳糖)，通过对蔗糖、干油、山梨醇、葡萄糖、麦芽糖和乳糖进行优化，选用葡萄糖为碳源；如图3所示(图中，1
‑
酵母提取物；2
‑
胰蛋白胨；3
‑
尿素；4
‑
氯化铵；5
‑
酵母提取物+氯化铵)，通过对酵母提取物、胰蛋白胨、尿素、氯化铵、酵母提取物
‑
氯化铵进行优化，选用酵母提取物为氮源；如图4所示(图中，1
‑
无水硫酸镁；2
‑
七水合硫酸锌3
‑
一水合硫酸锰；4
‑
七水合硫酸亚铁；5
‑
无水氯化钙)，通过对无水硫酸镁、七水合硫酸锌、一水合硫酸锰、七水合硫酸亚铁和无水氯化钙进行优化，选用无水硫酸镁为无机盐。图2
‑
图4中，光密度od值越高，表明解脂耶氏酵母菌体生长越多，效果越好。
34.在一些实施例中，根据单因素正交试验优化培养基结果确定葡萄糖、酵母提取物和无水硫酸镁为响应面优化过程的三个中心点进行响应面优化发酵工艺，确定最佳条件为葡萄糖浓度为25.21g/l、酵母提取物浓度为15g/l、无水硫酸镁浓度为0.22g/l、磷酸二氢钾2.5g/l。具体地，如图5所示，通过回归方程所作各影响因子两两交互的响应曲面及其等高线。另外，回归模型的p值为0.0054＜0.01，说明该回归方程是极显著的。失拟项的值为0.1062，统计学上不显著，即无失拟项因素存在，该模型的决定系数r2＝91.45％，调整后r2
adj
＝80.45％，说明该方程，能解释80.45％的响应值变化，故能利用本模型代替真实实验。使用design expert 8.0.6软件处理数据后，得到对于100ml解脂耶式酵母发酵培养od600的培养基最佳条件为葡萄糖浓度为25.21g/l，酵母提取物浓度为15g/l，无水硫酸镁浓度为0.22g/l，磷酸二氢钾2.5g/l。上述优选地液体培养基发酵效果更佳。
35.在一些实施例中，将所述种子液置于液体培养基的步骤中，所述种子液与所述液体培养基的体积比为1：18
‑
22。该比例下可以很好地进行发酵，获得深度发酵的发酵液。进一步，所述种子液与所述液体培养基的体积比为1：20，例如，将扩培的1.5l种子液加入有30l上述液体培养基的发酵罐中，进行高密度发酵工艺。
36.在一些实施例中，所述搅拌发酵处理的过程中，溶氧浓度通过搅拌和压强维持在20％
‑
40％范围内(具体可以是20％、25％、28％、30％、35％、40％等)。当将种子液置于液体培养基中准备开始发酵时，搅拌速度可以在150
‑
200r/min范围内，压强在0.05mpa
‑
0.1mpa范围内，这样保持溶氧浓度在20％
‑
40％范围内。而当溶氧浓度低于初始发酵值时，表明液体培养基已开始进一步消耗，一般溶氧量会出现快速下降并反弹现象。因此，当溶氧浓度低于20％时，可以添加甘油和酵母蛋白胨，并不断搅拌、适当加压，以使溶氧浓度维持在20％
‑
40％范围内。这样，通过酵母蛋白胨补充能量，通过甘油促进球状解脂耶式酵母更好地生长以及抑制杂菌生长，从而可以显著提高发酵程度。进一步地，当溶氧浓度低于10％(如5％、8％、10％等)时，添加甘油和酵母蛋白胨。
37.在一些实施例中，所述添加甘油和酵母蛋白胨的步骤包括：将含有甘油和酵母蛋白胨的溶解液以200
‑
300ml/h的速度添加(即以流加方式添加甘油和酵母蛋白胨形成的复合培养基)入发酵罐中；其中，所述溶解液中，甘油18
‑
22g/l，酵母蛋白胨12
‑
17g/l。上述条件下，可以使解脂耶氏酵母更佳稳定地发酵。一般每30l液体培养基发酵时，每次补料，可以
加1l(流加速度250ml/h，4h加完)甘油和酵母蛋白胨的溶解液(甘油18
‑
22g/l+酵母蛋白胨12
‑
17g/l)，进行能量补充。
38.在一实施例中，所述酸性条件是ph＝5
‑
6的条件。优选地，最佳ph保持在5.5。
39.在一实施例中，所述搅拌发酵处理的搅拌速度为150
‑
200r/min；具体搅拌转速根据溶氧进行调节。
40.在一实施例中，所述搅拌发酵处理的发酵时间为36
‑
48h，所述搅拌发酵处理的发酵温度为26
‑
30℃。
41.单纯用ypd培养基液发酵或常规分批发酵法发酵解脂耶式酵母，菌体一般呈菌丝状，发酵程度低且易染菌。而本申请选用合适的培养基，在酸性条件下持续进行搅拌发酵，搅拌发酵过程中溶氧量稳定在20％
‑
40％，且适当补料，而且补料中的甘油能抑制大量丝状解脂耶式酵母形成，使更适合高密度发酵和产生目的蛋白的球状解脂耶式酵母生长，同时甘油能抑制其他杂菌生长，这样可以减少染菌风险；例如，将扩培的1.5l种子液加入含30l液体培养基的发酵罐中，调低初始ph值在5，发酵过程中当溶氧迅速下降后并有所反弹时，流加甘油和酵母蛋白胨形成的复合培养基，具体地，可以加甘油20g/l+酵母蛋白胨15g/l，共1000ml左右，并控制ph保持在5.5，调节溶氧量保持在20％
‑
40％。
42.本申请实施例第二方面提供一种发酵液，所述发酵液通过本申请所述的发酵方法进行发酵得到。
43.本申请提供的发酵液由本申请特有的发酵方法进行发酵得到。因此，该发酵液发酵程度高，杂菌少，而且解脂耶式酵母菌细胞干重高，具有很好的应用前景。
44.具体地，所述发酵液中的细胞干重(即解脂耶式酵母菌细胞干重)至少40g/l。普通ypd培养基或常规分批发酵法发酵解脂耶式酵母，发酵结束时细胞干重一般为15～20g/l，而采用本申请的发酵方法，发酵结束时发酵液中的解脂耶式酵母菌细胞干重显著提高，例如一个实施例中，解脂耶式酵母菌细胞干重达到45g/l，相比于现有常规发酵法产量提高了125％。
45.最后，本申请实施例还提供一种应用，即本申请实施例所述的发酵液在猪饲料中的应用。
46.本申请通过对该发酵液拌料饲喂和饮水添加饲喂评估其对断奶仔猪的作用效果，结果显示显著提高了试验仔猪体重，并且在试验期间仔猪未出现腹泻情况，对于仔猪日采食量和平均日增重均有提高的趋势，因此具有提高仔猪免疫力和促进生长的作用，可以很好地用于猪饲料中。
47.具体地，该发酵液制成解脂耶氏酵母制剂，通过饲喂解脂耶氏酵母制剂显著提高了试验30d时仔猪体重，并且在试验期间饲喂酵母制剂组仔猪未出现腹泻情况(p<0.05)；对于仔猪日采食量和平均日增重均有提高的趋势。
48.下面结合具体实施例进行说明。
49.实施例1
50.一种发酵液，通过如下发酵方法得到：
51.1、种子液活化：从
‑
80℃甘油管冷冻保藏的解脂耶氏酵母菌株在平板划线，在30℃下培养24h，挑出单菌落涂斜面，从斜面上接种于ypd液体培养基中；以10％接种量扩培至1.5l种子液；
52.2、发酵过程：将扩培的上述1.5l种子液加入装有30l液体培养基(成分：葡萄糖浓度为25.21g/l、酵母提取物浓度为15g/l、无水硫酸镁浓度为0.22g/l、磷酸二氢钾2.5g/l)的发酵罐中进行搅拌发酵，调低初始ph值在5，发酵过程中当溶氧迅速下降后并有所反弹时流加(流加速度250ml/h)甘油和酵母蛋白胨的溶液1000ml(甘油20g/l+酵母蛋白胨15g/l)左右，并控制ph保持在5.5，搅拌转速150
‑
200r/min，根据溶氧调节，使溶氧保持在20％
‑
40％，发酵温度为28℃，发酵时间为40h。
53.实施例2
54.将上述实施例1发酵方法得到的发酵液在无抗饲养条件下，通过拌料饲喂发酵液评估其对断奶仔猪提高免疫力、促生长的作用效果。试验选择同批断奶，平均体重在6.7kg左右的健康丹系(大
×
长
×
大)三元杂交断奶仔猪66头，按体重分为2个处理组(对照组a：常规饲料进行喂养；发酵液组a：常规饲料+实施例1的发酵液混合成饲料进行喂养)，没天喂养饲料和体重测量，进行为期30天的饲养试验，并于试验第0、14、27天采集粪便，两组分别选取9头健康猪采集粪便。相关参数和结果见表1所示。
55.表1饲喂解脂耶氏酵母的发酵液对断奶仔猪生长性能的影响
[0056][0057]
由上表1可知：
[0058]
(1)在平均日采食量方面：对照组a为435
±
58g，发酵液组a为468
±
77g，发酵液组a比对照组a提高7.58％；
[0059]
(2)在平均日增重方面：对照组a为302
±
47g，发酵液组a为324
±
65g，发酵液组a比对照组a提高7.28％；
[0060]
(3)在料重比方面：对照组a为1.44
±
0.02，发酵液组a为1.44
±
0.03；
[0061]
(4)腹泻方面：对照组a为0.01
±
0.00，发酵液组a未出现腹泻情况0
±
0.00(p<0.05)。
[0062]
通过该试验可以看出，饲喂上述发酵液显著提高了试验30d时仔猪体重，对仔猪日采食量、平均日增重方面都有显著提高，并且在试验期间饲喂发酵液制剂组仔猪未出现腹泻情况(p<0.05)。
[0063]
实施例3
[0064]
将上述实施例1发酵方法得到的在无抗饲养条件下，通过饮水添加发酵液进行试验评估其对断奶仔猪提高免疫力、促生长的作用效果。试验选择同批断奶，平均体重在
6.7kg左右的健康丹系(大
×
长
×
大)三元杂交断奶仔猪66头，按体重分为2个处理组(对照组b：常规饲料喂养；发酵液组b：常规饲料喂养+实施例1的发酵液结合饮水喂养)，每个组处理3个重复，每个重复有11头仔猪，进行为期27天的饲养试验，并于试验第0、14、27天采集粪便，两组分别选取9头健康猪采集粪便(每栏选取3头猪)。试验结果表明：(1)在平均日采食量方面：对照组b为442g，发酵液组b为450g，发酵液组b比对照组a提高1.81％；
[0065]
(2)在平均日增重方面：对照组b为339g，发酵液组b为331g，发酵液组b比对照组b降低2.36％；
[0066]
(3)在料重比方面：对照组b为1.30，发酵液组b为1.36，发酵液组b比对照组b提高4.62％；
[0067]
(4)毛色方面：发酵液组b(毛色2.12)优于对照组b(毛色2.00)；
[0068]
(5)肤色方面：发酵液组b(肤色2.15)优于对照组b(肤色1.97)；
[0069]
(6)腹泻方面：两组腹泻指数没有差异性(0.002)。
[0070]
综合以上各项生产性能指标来看，本申请实施例的发酵液结合饮水添加对仔猪外貌性状有较好的改善，同时能提高仔猪平均日采食量和料重比。
[0071]
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。