一种液体发酵培养基及其应用
本发明涉及乳酸菌培养基技术领域。
背景技术：
乳酸菌是一类可将糖类发酵为乳酸的有益微生物，可定植于人和动物的肠道，具有维持肠道菌群平衡、调节机体免疫等功能，在工业、农牧业、食品和医药等领域已得到广泛应用。近年来，乳酸菌添加饲料在畜禽养殖业中越来越受到重视，其可提高畜禽免疫力、减少甚至替代抗生素的使用，同时还可提高饲料的利用率、改善肉质等。因此，乳酸菌在畜禽养殖业中具有广阔的前景。
乳酸杆菌是乳酸菌中的重要类群，是畜禽养殖饲料和发酵饲料中添加的主要类群。在应用中，乳酸杆菌的含量直接影响后续发酵(如青贮发酵)的质量和饲料的效果，表明乳酸杆菌扩培是其中重要的一环。目前的大多数乳酸杆菌发酵培养基，所使用的培养基成分复杂、配置繁琐、价格昂贵等，使得生产成本高，限制了其使用。因此，开发一种更廉价便捷的乳酸菌培养基，将可进一步简化乳酸菌饲料的生产方式，降低乳酸菌饲料的成本。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种液体发酵培养基，同时提供利用该培养基进行乳酸杆菌发酵的方法。
本发明提供一种液体发酵培养基，其特征在于，其包括如下重量份成份：糖蜜2份，玉米浆4份，kh2po40.1份。
进一步地，还包括水100份。
本发明还提供一种液体培养基的配置方法，包括如下步骤：按重量份数称取各组分，用蒸馏水100份溶解，自然ph(约3.0左右)，115℃灭菌20分钟。
进一步地，所述各组分的重量份数为糖蜜2份，玉米浆4份，kh2po40.1份。
本发明所述的培养基使用廉价的糖蜜和玉米浆为原料，价格低廉，从而可降低成本；同时本培养基所用成分少，配置简便、培养方式简单，从而可以提高生产效率。利用本培养基发酵所得乳酸菌菌体量可达2×108以上，能满足正常使用。
同时，本发明所述的培养基可用于哈尔滨乳杆菌、希氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、布氏乳酸菌bl4、布氏乳酸菌、短小乳杆菌、植物乳杆菌等多种乳酸菌的扩大培养，适用广泛，从而在进行适当优化后可推广至其他乳酸菌的发酵培养。
附图说明
图1是利用本发明所述的培养基对各种乳杆菌进行摇培发酵的显微镜镜检结果图。
图2是利用本发明所述的培养基对各种乳杆菌进行静置发酵的显微镜镜检结果图。
具体实施方式
实施例1
液体发酵培养基，其包括如下重量份成份：糖蜜2份，玉米浆4份，kh2po40.1份，水100份。
液体发酵培养基的配置方法如下：
按重量份数称取各组分，用蒸馏水100份溶解，自然ph(约3.0左右)，115℃灭菌20分钟即可。
所述各组分为糖蜜2份，玉米浆4份，kh2po40.1份。
液体发酵培养基用于布氏乳杆菌bl4的发酵：
(1)冷冻保藏的布氏乳杆菌bl4在mrs平板上进行划线活化，挑取单菌落接种于液体mrs培养基中，30℃200rpm培养24小时做种子液；
所述布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)bl4，该菌株于2020年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为cgmcc，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏编号为cgmccno.20935。
mrs平板：蛋白陈10.0g，葡萄糖20.0g牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，吐温801.0ml，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000ml，ph6.2，115℃30分钟灭菌，后倾倒适量入90mm直径的平板中制成mrs平板。
液体mrs培养基：蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，吐温801.0ml，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，蒸馏水1000ml，ph6.2，115℃30分钟灭菌备用。
(2)配置本发明所述的液体发酵培养基，灭菌后降温至室温；
(3)将步骤(1)种子液按1％接种量(终浓度约为106cfu/g)接种于步骤(2)的液体发酵培养基中，接种两份；
(4)30℃发酵36小时，其中一份密封瓶口静置培养，一份200rpm培养。
液体发酵培养基用于哈尔滨乳杆菌的发酵；
(1)冷冻保藏的哈尔滨乳杆菌在mrs平板上进行划线活化，挑取单菌落接种于液体mrs培养基中，30℃200rpm培养24小时做种子液；
所述哈尔滨乳杆菌，该菌株分离自蔬菜等植物组织样品中，分离方法为梯度稀释涂布法，所用分离和纯化培养基为mrs平板，菌种鉴定方法为16srdna测序鉴定。
(2)配置本发明所述的液体发酵培养基，灭菌后降温至室温；
(3)将步骤(1)种子液按1％接种量(终浓度约为106cfu/g)接种于步骤(2)的液体发酵培养基中，接种两份；
(4)30℃发酵36小时，其中一份密封瓶口静置培养，一份200rpm培养。
液体发酵培养基用于希氏乳杆菌的发酵；
(1)冷冻保藏的希氏乳杆菌在mrs平板上进行划线活化，挑取单菌落接种于液体mrs培养基中，30℃200rpm培养24小时做种子液；
所述希氏乳杆菌，该菌株分离自蔬菜等植物组织样品中，分离方法为梯度稀释涂布法，所用分离和纯化培养基为mrs平板，菌种鉴定方法为16srdna测序鉴定。
(2)配置本发明所述的液体发酵培养基，灭菌后降温至室温；
(3)将步骤(1)种子液按1％接种量(终浓度约为106cfu/g)接种于步骤(2)的液体发酵培养基中，接种两份；
(4)30℃发酵36小时，其中一份密封瓶口静置培养，一份200rpm培养。
液体发酵培养基用于副干酪乳杆菌的发酵；
(1)冷冻保藏的副干酪乳杆菌在mrs平板上进行划线活化，挑取单菌落接种于液体mrs培养基中，30℃200rpm培养24小时做种子液；
所述副干酪乳杆菌，该菌株分离自蔬菜等植物组织样品中，分离方法为梯度稀释涂布法，所用分离和纯化培养基为mrs平板，菌种鉴定方法为16srdna测序鉴定。
(2)配置本发明所述的液体发酵培养基，灭菌后降温至室温；
(3)将步骤(1)种子液按1％接种量(终浓度约为106cfu/g)接种于步骤(2)的液体发酵培养基中，接种两份；
(4)30℃发酵36小时，其中一份密封瓶口静置培养，一份200rpm培养。
液体发酵培养基用于布氏乳杆菌的发酵；
(1)冷冻保藏的布氏乳杆菌在mrs平板上进行划线活化，挑取单菌落接种于液体mrs培养基中，30℃200rpm培养24小时做种子液；
所述布氏乳杆菌，该菌株分离自蔬菜等植物组织样品中，分离方法为梯度稀释涂布法，所用分离和纯化培养基为mrs平板，菌种鉴定方法为16srdna测序鉴定。
(2)配置本发明所述的液体发酵培养基，灭菌后降温至室温；
(3)将步骤(1)种子液按1％接种量(终浓度约为106cfu/g)接种于步骤(2)的液体发酵培养基中，接种两份；
(4)30℃发酵36小时，其中一份密封瓶口静置培养，一份200rpm培养。
液体发酵培养基用于短乳杆菌的发酵；
(1)冷冻保藏的短乳杆菌在mrs平板上进行划线活化，挑取单菌落接种于液体mrs培养基中，30℃200rpm培养24小时做种子液；
所述短乳杆菌，该菌株分离自蔬菜等植物组织样品中，分离方法为梯度稀释涂布法，所用分离和纯化培养基为mrs平板，菌种鉴定方法为16srdna测序鉴定。
(2)配置本发明所述的液体发酵培养基，灭菌后降温至室温；
(3)将步骤(1)种子液按1％接种量(终浓度约为106cfu/g)接种于步骤(2)的液体发酵培养基中，接种两份；
(4)30℃发酵36小时，其中一份密封瓶口静置培养，一份200rpm培养。
液体发酵培养基用于植物乳杆菌的发酵；
(1)冷冻保藏的植物乳杆菌在mrs平板上进行划线活化，挑取单菌落接种于液体mrs培养基中，30℃200rpm培养24小时做种子液；
所述植物乳杆菌，该菌株分离自蔬菜叶片等植物组织样品中，分离方法为梯度稀释涂布法，所用分离和纯化培养基为mrs平板，菌种鉴定方法为16srdna测序鉴定。
(2)配置本发明所述的液体发酵培养基，灭菌后降温至室温；
(3)将步骤(1)种子液按1％接种量(终浓度约为106cfu/g)接种于步骤(2)的液体发酵培养基中，接种两份；
(4)30℃发酵36小时，其中一份密封瓶口静置培养，一份200rpm培养。
液体发酵培养基用于混合乳酸菌发酵
混合乳酸菌为等比例等量的哈尔滨乳杆菌、希氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、布氏乳杆菌bl4、布氏乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌；
(1)冷冻保藏的混合乳酸菌在mrs平板上进行划线活化，挑取单菌落接种于液体mrs培养基中，30℃200rpm培养24小时做种子液；
(2)配置本发明所述的液体发酵培养基，灭菌后降温至室温；
(3)将步骤(1)种子液按1％接种量(终浓度约为106cfu/g)接种于步骤(2)的液体发酵培养基中，接种两份；
(4)30℃发酵36小时，其中一份密封瓶口静置培养，一份200rpm培养。
菌体浓度测量和对比
步骤一：通过血球计数板进行菌体计数。
对如上菌发酵液，分别取发酵进行12小时后和完成后(36小时)的发酵液，混匀后取10μl于血球计数板上进行制片，置于40倍物镜下观察，对杆状菌体进行计数。
如图1和图2所示，利用本发明所述培养基进行多种乳杆菌的扩大培养，无论摇培还是静置培养，乳酸菌均能稳定扩增。在培养36小时后，乳酸杆菌菌体量通过粗略计数可达到5×108个/ml。
步骤二：通过梯度稀释法进行cfu计数。
对如上菌发酵液，分别取发酵完成(36小时)后的发酵液作为原液，混匀后通过十倍梯度稀释到10-6和10-7，每个梯度稀释液取100μl涂布于mrs平板上，30℃培养24-36h，对形成的菌落数进行计数。
如表1，利用本发明所述液体发酵培养基进行多种乳杆菌的扩培，所有菌株可完成扩增。在发酵完成后，大多数乳杆菌活菌数可达5×108cfu/ml甚至109cfu/ml，能够满足日常使用。
表1发酵完成后的乳酸杆菌活菌计数
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