一种用毕赤酵母生产菌丝霉素的方法与流程

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种用毕赤酵母生产菌丝霉素的方法。

背景技术：

中国是畜牧养殖大国，每年生产的动物饲料达1亿吨以上，而在存放过程中因饲料腐败变质引起的损失超过10亿元。目前解决这一问题普遍采用的措施是在饲料中添加化学防腐剂，但残留在动物机体内的化学防腐剂不仅影响了畜禽产品的质量，还威胁到人们的身体健康，如引发肠胃炎等疾病，影响肝、肾功能等。另一方面，由于在我国动物饲料中长期大量地添加抗生素，严重影响动物消化道微生态平衡，造成一些病原菌耐药性的发生，使得针对由这些病原菌所引起的感染所进行的预防和治疗变得非常困难。因此，替代化学防腐剂和抗生素在动物养殖中的使用，真正实现畜牧业的和谐、健康发展是我国畜牧养殖业急需攻克的难题。

传统的抗生素是通过与微生物特定部位的受体结合，从而破坏微生物的正常结构或阻断酶的活性及必要的代谢途径等来实现抑菌或杀菌的作用。微生物的靶位点发生简单的基因突变就可对付抗生素的攻击，从而产生耐药性。与传统抗生素相比，微生物对抗菌肽产生耐药性的过程则要困难很多。这是因为抗菌肽的主要作用机理是通过与细胞膜上的氨基酸相互作用，以此穿透细胞膜、扼杀细菌，所以细菌必须改变膜的表面结构，即改变相当部分的基因，才能对付抗菌肽的攻击，而这几乎是不可能的。抗菌肽的另一个突出优点是抗菌谱广，传统抗生素只针对某一类细菌具有抗性，而抗菌肽通常对g⁺和g^-菌均具有抗性。此外，抗生素的残留问题越来越受到广泛的重视，而抗菌肽是一种小分子多肽，在动物的消化道内可以被降解为氨基酸，因而不存在残留的问题。在国外，已有多种成熟的抗菌肽产品在临床医疗中应用，而且取得了较好的效果。例如，来自两栖动物的抗菌肽马盖宁(magainin)，已被用于某些感染性疾病的临床治疗；来自微生物的抗菌肽乳链菌素(nisin)，已被美国fda批准为血液防腐剂添加成分。我国在抗菌肽的研究方面还处于探索阶段，在关键技术上还不成熟。抗生素残留已经成为我国畜产品走向国际市场的最大障碍之一，因此发展具有自主知识产权的新型抗菌肽产品来替代化学防腐剂和抗生素的使用，对于我国畜牧业的安全、健康、和谐发展具有重要意义。

菌丝霉素是丹麦生物技术公司在2005年从腐生子囊菌的分泌蛋白中分离出的首例真菌防御素。防御素是存在于动物和高等植物中的一类富含半胱氨酸的天然抗菌肽，它们对多种微生物均具有较强的防御能力，因此，防御素是目前颇具吸引力的一类新型候选抗菌药物。菌丝霉素的成熟功能片段只有40个氨基酸，其分子量约为4.4kda，其空间结构由一个α-螺旋和两个反向平行的β-折叠组成是典型的防御素csαβ结构。其生物学活性主要表现为对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用，尤其是对肺炎链球菌、脓性链球菌、金黄色葡萄球菌等，菌丝霉素的抗菌方式类似于现在广泛使用的万古霉素。此外，菌丝霉素在体外抑菌试验、动物试验及一些临床试验中表现出无细胞毒性、无溶血性、脑脊液渗透性好等优势，且能有效治疗由肺炎链球菌引起的实验腹膜炎、肺炎小鼠，亦能有效杀灭对传统抗生素有抵抗力的一些菌种，对引发肺炎、脑膜炎和链球菌性扁桃体炎的肺炎球菌也有疗效，不产生耐药性，与传统使用的抗生素之间不存在交叉抗性，因此作为新一代抗生素替代品具有巨大的发展潜力。

现有的菌丝霉素表达系统目前有以下几个来源，1)从腐生子囊菌的分泌蛋白中分离得到，但是含量很低且难以分离纯化；2)化学合成生产菌丝霉素周期短，但该方法成本高昂；3)通过基因工程手段获得，主要是采用原核表达和真核表达系统。其中原核表达系统虽表达量高、生长周期短，但其翻译后加工修饰体系不完善，表达产物活性低，且分离纯化产物难度大。真核表达系统中的酿酒酵母也具有局限性，分泌效率差，质粒易丢失，培养调价苛刻，成本高，不适用于工业大规模的生产。

技术实现要素：

本发明为了克服现有技术存在的不足，如分离纯化难度大，生产周期长、成本高，残留甲醇带来的危害，以及产物活性低等缺陷，提供一种利用毕赤酵母表达抗菌肽菌丝霉素的方法。

一种用毕赤酵母生产菌丝霉素的方法，包括以下步骤：

(1)改造菌丝霉素基因，合成并扩增菌丝霉素基因，序列见seqidno.1:

ggttttggttgtaatggtccatgggatgaagatgacatgcaatgccataatcattgcaagtccattaagggttacaaaggtggttattgtgctaagggtggttttgtctgtaagtgttat；

(2)构建毕赤酵母中表达改造后的菌丝霉素基因的重组质粒pgapzαb-plec，重组质粒pgapzαb-plec的序列如seqidno.2所示；

(3)用重组质粒pgapzαb-plec转化毕赤酵母x33；

(4)筛选和鉴定重组酵母；

(5)获得抗菌肽菌丝霉素菌液，沉淀并浓缩菌丝霉素。

优选地，所述方法在步骤(5)之后还包括如下步骤：

a.实时pcr法鉴定菌丝霉素基因的表达量；

b.测定菌丝霉素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径鉴定其抑制效果。

优选地，步骤a的过程如下：

1)培养毕赤酵母所生产的菌丝霉素；

2)分别按照酿酒酵母和青蒿的生产条件生产菌丝霉素；所述酿酒酵母生产条件为：酵母完全培养基ypd，ph值为ph4.5-5.0，最适生长温度28-30℃，固体培养皿倒置培养室内进行培养2-3d时，转入液体培养基培养，使用旋转式或往复式摇床，至少每200r/min，保证充分通气；所述青蒿生产条件为：ms培养基中25-26℃、光强1000～1500lx光照培养14h，每20d更换一次培养基；

3)提取rna，进行菌丝霉素的表达量鉴定。

优选地，步骤b的过程如下：

1)大肠杆菌和金色葡萄球菌分别于37℃，200rpm过夜培养；

2)分别取200μl大肠杆菌和金色葡萄球菌分别的菌液，均匀涂布于未加抗生素的lb平板上，轻轻放置牛津杯；

3)吸取毕赤酵母上清200μl加入牛津杯，、正对照为0.5mg/ml氨苄青霉素amp，平行对照分别为等量的酿酒酵母和青蒿所生产的菌丝霉素，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，次日观察抑菌效果。

优选地，步骤(1)所述改造菌丝霉素基因，合成并扩增菌丝霉素基因的过程如下：

(a)合成改造后的菌丝霉素基因序列，并将其保存于pmd19simple质粒中，改造后的菌丝霉素基因序列如seqidno.1所示；

(b)用如下引物对保存于pmd19simple质粒中的改造后的菌丝霉素基因进行扩增：

引物plecf1：5’-ccgctcgagaaaagaggttttggttgtaatggt-3’(seqidno.3)；

引物plecr1：5’-gctctagagccttatcatcgtcgtcataacacttac-3’(seqidno.4)；

(c)将pcr扩增得到的改造后的菌丝霉素基因经2.0％琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段。

优选地，步骤(2)所述构建毕赤酵母中表达改造后的菌丝霉素基因的重组质粒pgapzαb-plec的过程如下：

(a)用xhoi和xbai酶切回收纯化的pcr扩增得到的改造后的菌丝霉素基因，产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳后，回收plec基因片段；

(b)用xhoi和xbai酶切pgapzαb载体，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，回收pgapzαb载体片段；

(c)t4连接酶，16℃连接2h得到pgapzαb-plec载体；

(d)转化大肠杆菌dh5α菌株；

(e)转化后提取质粒dna进行酶切鉴定。

优选地，步骤(3)所述用重组质粒pgapzαb-plec转化毕赤酵母x33的过程如下：

(a)制备毕赤酵母x33感受态细胞；

1)接种毕赤酵母x33于含5ml的ypd培养基的50ml灭菌离心管，30℃，200rpm，过夜培养；

2)取过夜培养的毕赤酵母50μl于50ml的ypd培养基，培养至od600＝1.3-1.5，放置冰上10min；

3)4℃,1500g,5min离心收集细胞，用预冷的50ml灭菌ddh2o重悬细胞沉淀；

4)重复步骤3；

5)4℃,1500g,5min离心收集细胞，用预冷的10ml灭菌1msorbitol(山梨醇)重悬细胞沉淀；

6)4℃,1500g,5min离心收集细胞，用预冷的160μl灭菌1msorbitol(山梨醇)重悬细胞沉淀，轻轻旋转混匀，分装到1.5ml的ep管中，每管80ul，置于冰上待用。

(b)重组质粒pgapzαb-plec线性化，用avrⅱ单酶切重组质粒pgapzαb-plec，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶切回收；

(c)转化线性化质粒pgapzαb-plec到毕赤酵母x33感受态细胞中；

1)吸取80μl酵母感受态细胞到5-10μg线性化的质粒dna中，用手轻弹至混匀；

2)转移到已预冷的2mm电击杯中，冰浴静置5min；

3)将电击杯外的水擦干净，置于电转仪中，电击转化酵母。转化程序为：1.5kv，25μf，200ω，保证放电时间在4.5-4.9ms间，小于4说明dna盐浓度太高；

4)立即加入1ml已预冷1m山梨醇，转移至2ml离心管中，30℃，静置培养1h；

5)加入1mlypd，30℃，200rpm，培养1h；

6)5000rpm，离心5min，弃掉部分上清，留200μl重悬菌体，涂布于含100μg/ml的ypds平板上；

7)30℃，避光培养2-3days。

优选地，步骤(4)所述筛选和鉴定重组酵母的过程如下：

(a)挑取单克隆划线于平板保菌，同时于10μlddh2o混匀，取1.5μl；

(b)加入1μl5u/μllyticase，30℃孵育10min；

(c)液氮速冻1min，得2.5μlcelllysate；

(d)加入pcr反应体系(不加taq酶)，于95℃，5min；

(e)加入0.15μltaq酶，进行pcr反应；

(f)经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆子。

本发明构建了生产菌丝霉素的毕赤酵母表达菌株，其优点在于：1.可以在简单培养基上快速生长，并能高效发酵，生产异源蛋白；2.具有真核细胞蛋白合成通路，能够进行真核修饰，如糖基化、二硫键的形成、蛋白加工等；3.表达分泌的蛋白产品易于分离纯化；4.外源蛋白基因遗传稳定，外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体的复制而复制，不易丢失；5.研究采用毕赤酵母pgapzαb组成型表达载体，该启动子不需要甲醇诱导，操作简单，不会引入有毒物质，有利于表达产物的商品化。6.菌丝霉素在毕赤酵母中的表达量(pp)，较改造前，基因的表达量相对于酿酒酵母(yp)提高了40％，相对于青蒿(ap)，提高了75％；7.以抑菌圈的大小，表示表达产物的抑菌效果，毕赤酵母中表达的菌丝霉素(pp)，较改造前，对大肠杆菌的抑制效果，相对于酿酒酵母(yp)和青蒿(ap)提高了62.5％，对大肠杆菌的抑制效果，相对于酿酒酵母(yp)和青蒿(ap)提高了75％。

附图说明

图1为重组质粒pgapzαb-plec的构建过程示意图；

图2为菌丝霉素基因的pcr扩增产物电泳图；

图3为菌丝霉素连载体pgapzαb后转化大肠杆菌dh5α，提取质粒的酶切鉴定电泳图；

图4重组质粒pgapzαb-plec单酶切线性化鉴定电泳图；

图5为载体pgapzαb-plec转化毕赤酵母x33后，菌落pcr鉴定电泳图；

图6实时pcr方法检测改造后菌丝霉素的表达量；

图7改造前后，青蒿抑菌效果对比图。

在图2中，泳道m为5000bpdnamarker(5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道3为plectasin的pcr扩增产物。

在图3中，泳道m为5000bpdnamarker(5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1为plec-pgapzαb载体的酶切产物。

在图4中，泳道m为5000bpdnamarker(5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道4为质粒plec-pgapzαb，5-6为plec-pgapzαb单酶切产物。

在图5中，泳道m为2000bpdnamarker(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1为空白对照，泳道1为正对照对照，3-11为随机挑选的克隆子pcr筛选结果。

在图6中，pp代表本专利改造后用毕赤酵母表达菌丝霉素，yp为改造前用酿酒酵母表达菌丝霉素，ap为改造前用青蒿表达菌丝霉素。

在图7中，pp代表本专利改造后用毕赤酵母表达菌丝霉素，yp为改造前用酿酒酵母表达菌丝霉素，ap为改造前用青蒿表达菌丝霉素。

具体实施方式实施例中所用到的序列均为上文提到的序列

以下结合附图和具体实施方式对本发明作详细描述，而不会限制本发明。

如图1所示，本发明的用毕赤酵母生产菌丝霉素的方法，其包括以下步骤：

(1)改造菌丝霉素基因，合成并扩增菌丝霉素基因，序列见seqidno.1；

(2)构建毕赤酵母中表达改造后的菌丝霉素基因的重组质粒pgapzαb-plec，重组质粒pgapzαb-plec的序列如seqidno.2所示；

(3)用重组质粒pgapzαb-plec转化毕赤酵母x33；

(4)筛选和鉴定重组酵母；

(5)获得抗菌肽菌丝霉素菌液，沉淀并浓缩菌丝霉素；

(6)实时pcr法鉴定菌丝霉素基因的表达量；

(7)测定菌丝霉素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径鉴定其抑制效果。

本发明一种用毕赤酵母生产菌丝霉素的方法的具体操作过程为：

1、改造菌丝霉素基因，合成并扩增菌丝霉素基因

合成和克隆菌丝霉素基因，对ncbigenbank中菌丝霉素成熟肽的基因序列进行改造，改造后序列见序列表，并将该dna片段保存于pmd19simple质粒(购于宝生物工程(大连)有限公司)中。再根据其基因序列人工设计合成一对特异引物，以保存于pmd19simple质粒中的菌丝霉素(plectasin)基因片段为模板通过pcr技术克隆扩增目的基因片段(图2)。pcr反应条件：94℃5min预变性，94℃30s-50℃30s-72℃20s，30个循环，72℃5min。经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20℃备用。

表1所用引物序列

2、构建分泌型表达载体pgapzαb-plec

用xhoi和xbali分别酶切pgapzαb载体(购于长沙赢润生物技术有限公司)和纯化后的pcr扩增目的片段plec，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，回收plec基因片段和pgapzαb载体片段。t4连接酶，16℃连接2h得到pgapzαb-plec载体，转化大肠杆菌dh5α菌株。转化后提取质粒dna进行酶切鉴定(图3)。

3、重组载体pgapzαb-plec转化毕赤酵母x33

1)制备毕赤酵母x33感受态细胞：

①接种毕赤酵母于含5ml的ypd培养基的50ml灭菌离心管，30℃，200rpm，过夜培养；

②取过夜培养的毕赤酵母50μl于50ml的ypd培养基，培养至od600＝1.3-1.5，放置冰上10min；

③4℃,1500g,5min离心收集细胞，用预冷的50ml灭菌ddh2o重悬细胞沉淀；

④重复步骤③。

⑤4℃,1500g,5min离心收集细胞，用预冷的10ml灭菌1msorbitol(山梨醇)重悬细胞沉淀。

⑥4℃,1500g,5min离心收集细胞，用预冷的160μl灭菌1msorbitol(山梨醇)重悬细胞沉淀，轻轻旋转混匀，分装到1.5ml的ep管中，每管80μl，置于冰上，当天使用。

2)重组质粒pgapzαb-plec线性化,用avrⅱ单酶切重组质粒pgapzαb-plec，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后(图4)，胶切回收。

3)转化质粒pgapzαb-plec到毕赤酵母x33感受态细胞中：

①吸取80μl酵母感受态细胞到5-10μg线性化的质粒dna中，用手轻弹至混匀；

②转移到已预冷的2mm电击杯中，冰浴静置5min；

③将电击杯外的水擦干净，置于电转仪中，电击转化酵母。转化程序为：1.5kv，25μf，200ω，保证放电时间在4.5-4.9ms间，小于4说明dna盐浓度太高。

④立即加入1ml已预冷1m山梨醇，转移至2ml离心管中，30℃，静置培养1h；

⑤加入1mlypd，30℃，200rpm，培养1h；

⑥5000rpm，离心5min，弃掉部分上清，留200μl重悬菌体，涂布于含100μg/ml的ypds平板上；

⑦30℃，避光培养2-3days。

4、筛选和鉴定重组酵母。

1)菌落pcr筛选重组酵母：

①挑取单克隆划线于平板保菌，同时于10μlddh2o混匀，取1.5μl；

②加入1μl5u/μllyticase，30℃孵育10min；

③液氮速冻1min，得2.5μlcelllysate；

④加入pcr反应体系(不加taq酶)，于95℃，5min，为了确保α信号肽，目的基因，c端的标签在同一个读码框内设计如下上下游引物，分别是在α信号肽上游的一段序列，c端的标签下游的一段序列，序列如下：

引物5’pgap：5’-gtccctatttcaatcaattgaa-3’(seqidno.5)；

引物3′aox1：5’-gcaaatggcattctgacatcc-3’(seqidno.6)；

反应体系如下：

⑤加入0.15μltaq酶，进行pcr反应；

热循环设置为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min5s，32cycles；72℃延伸5min。同时设置阴性无模板对照和阳性质粒对照。

⑥经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆子(图5)；

2)测序再次鉴定目的基因整合至酵母细胞染色体中:

将上一步筛选的阳性克隆子，转接至ypds液体培养基，30℃，200rpm培养至菌液od600～1.0后，提取酵母基因组送测序。在α信号肽上游设计一条检测引物，送公司测序，确认α信号肽和菌丝霉素在同一读码框内且成功整合入酵母染色体中。

测序引物:

testprimer：5'-gtccctatttcaatcaattgaa-3'(seqidno.5)。

5、获得抗菌肽菌丝霉素菌液，沉淀并浓缩菌丝霉素

1)培养工程菌表达重组菌丝霉素：

①转接100μl抗菌肽菌丝霉素毕赤酵母工程菌至10mlypd液体培养基中，30℃，200rpm震荡培养至菌液的od600值为1.3～1.5。

②转接1ml步骤①活化的菌液至100mlypd液体培养基中，30℃，200rpm震荡培养3～5天。

2)超滤杯浓缩蛋白

①取50ml菌液，4000rpm离心15min，收集上清；

②用截留分子量为3000da的millipore超滤杯浓缩收集上清至约250μl；

3)三氯醋酸浓缩沉淀蛋白；

①准备1.5ml干净的离心管，移入200μl蛋白样品溶液；

②加入50μl沉淀液a，涡旋震荡10sec，使之充分混匀；

③冰上或放在冰箱冷藏室的低层,孵育一小时；

④在4℃，15000rpm(20000g)离心15min；

⑤小心去掉上清液和管壁以及管底的液体，保留沉淀；

⑥加入600μl洗涤液b涡旋震荡10sec；

⑦放在冰箱冷藏室的低层冷藏10min，再4℃，12000rpm(12830g)离心15min得到沉淀；

⑧在通风橱中，倒掉上清，沉淀物通风晾干30min或冷冻干燥机上抽干；

⑨加入20μl溶解液c并涡旋震荡10sec，如果溶液为黄色，加入1-5μl调和液d，使其变回蓝色；

6、实时pcr鉴定菌丝霉素基因的表达情况：

1)如上述5中的方法，培养毕赤酵母所生产的菌丝霉素；

2)分别按照酿酒酵母和青蒿的合适生产条件，生产菌丝霉素；

3)提取rna，并按照试剂盒的使用方式，进行菌丝霉素的表达量鉴定(图6)。

7、抗菌肽菌丝霉素的活性检测

1)大肠杆菌和金色葡萄球菌分别于37℃，200rpm过夜培养。

2)分别取200μl大肠杆菌和金色葡萄球菌分别的菌液，均匀涂布于未加抗生素的lb平板上，轻轻放置牛津杯。

3)吸取毕赤酵母上清200μl加入牛津杯，、正对照为0.5mg/ml氨苄青霉素amp，平行对照分别为等量的酿酒酵母和青蒿所生产的菌丝霉素，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，次日观察抑菌效果(图7)。

序列表

<110>长沙中科晶博生物科技有限公司

<120>一种用毕赤酵母生产菌丝霉素的方法

<141>2020-12-24

<160>6

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<210>1

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<212>dna

<213>null

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