一种表达甲基化HBHA蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株、制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种表达甲基化hbha蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株、制备方法及其应用，属于生物技术应用领域。
背景技术：
：结核分枝杆菌肝素结合血凝素(heparin-bindinghemagglutininadhesin，hbha)是近年来研究发现的一种重要的致病因子。hbha是一种由结核分枝杆菌表达的糖蛋白，可同时出现在菌体和培养液中。hbha包括由199个氨基酸组成的蛋白质一级结构，相对分子质量约28kda，其编码基因rv0475(id：886272)全长约600bp。hbha是一种多功能结合蛋白，它不仅能诱导结核分枝杆菌的聚集、结核分枝杆菌与非吞噬细胞(如上皮细胞)之间的黏附，还能通过与补体c3结合，调理肺泡ⅱ型上皮细胞对结核分枝杆菌的吞噬，介导结核分枝杆菌侵入肺部的播散环节。hbha还可以通过抑制细胞自噬过程中lc3，达到抑制巨噬细胞自噬的目的，为结核分枝杆菌在巨噬细胞中长期稳定生存创造了条件；并且，受休眠调节系统的控制，在休眠结核分枝杆菌中高表达，与结核分枝杆菌潜伏感染密切相关。hbha在结核分支杆菌中以甲基化形式存在，这不仅可以保护hbha蛋白不被水解，而且甲基化hbha能诱导机体产生ifn-γ，在机体感染过程中发挥重要的保护性免疫作用。而体外将甲基化hbha作为抗原直接刺激人外周血单个核细胞(pbmcs)，发现处于潜伏性结核感染(latenttuberculosisinfection，ltbi)状态者的t淋巴细胞产生ifn-γ的能力明显强于活动性结核病(activetuberculosis，atb)患者和健康对照人群，这使得区分atb和ltbi成为可能。但是，由于从卡介苗(bacilluscalmette-guerin，bcg)或其它结核分枝杆菌中纯化天然hbha较为困难(培养时间长、产量小)，而大肠杆菌在表达中对hbha不具有甲基化作用，因此，目前大多研究使用耻垢分枝杆菌获得甲基化hbha重组蛋白。然而，可用于在耻垢分枝杆菌中表达甲基化hbha蛋白的重组载体构建困难，当前已有的研究使用的表达重组甲基化hbha蛋白的载体，诱导表达困难，且表达量不稳定，因此获得能够稳定表达甲基化hbha蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株是一个难题。技术实现要素：(一)要解决的技术问题为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种表达甲基化hbha蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株及其构建方法和应用。(二)技术方案为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：一种表达甲基化hbha蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株，其保藏编号为cgmccno.20811。该菌株可大量稳定地表达甲基化hbha蛋白，将该菌株于2020年09月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)进行保藏，菌株名称为耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)，保藏编号为cgmccno.20811。一种用于表达甲基化hbha蛋白的表达载体，其包括由分枝杆菌表达载体pmyca与结核分枝杆菌hbha基因连结构成，所述表达载体表达的结核分枝杆菌hbha重组蛋白携带6个组氨酸(6×his)标签及tev标签切除位点。进一步地，所述表达载体包括依次连接的cole1型质粒dna复制起始区域cole1，分枝杆菌复制起始位点orim，乙酰胺酶启动子调节器amia(msmeg_5338)和amic(msmeg_5339)(结合乙酰胺，调节启动子启动)，结核分枝杆菌h37rv来源hbha片段的基因(accessionnumber：rv0475，600bp)、t1终止子及潮霉素抗性筛选基因hygr。进一步地，所述表达载体的序列如seqidno.7所示。同样是用于耻垢分枝杆菌中生产甲基化hbha，但是使用的表达载体不同。大量实验研究发现，如果使用的表达载体为hsp70启动子，采用高温进行诱导表达，容易出现诱导表达不稳定，过程难以控制的问题。而本发明使用的表达载体由乙酰胺进行诱导表达，方便可控，便于进行生产管理。如上所述的表达载体，优选地，所述表达载体以结核分枝杆菌hbha基因编码区为目的基因，并通过不依赖于连接反应的克隆方法将所述目的基因插入pmyca载体骨架而得到的，目的基因采用序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物进行扩增获得，所述pmyca载体骨架采用序列如seqidno.3和seqidno.4所示的引物进行扩增获得。一种表达甲基化hbha蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株的制备方法，其包括如下步骤：s1、构建如上所述的用于表达甲基化hbha的表达载体；s2、将所述甲基化hbha重组表达载体转化耻垢分支杆菌，得到重组耻垢分枝杆菌菌株。如上所述的重组耻垢分枝杆菌菌株的制备方法，优选地，在步骤s1中，所述用于表达甲基化hbha的表达载体的制备采用如下方法：s101、用序列如seqidno.1和seqidno.2所示引物对结核分枝杆菌的基因组dna扩增获得hbha基因的目的基因；s102、用序列如seqidno.3和seqidno.4所示引物对质粒pmyca载体扩增获得线性化的pmyca载体；s103、将上述获得目的基因与线性化的pmyca载体与treliefsosoomix混合，50℃反应15分钟，反应后用热激法转化入dh5α感受态细胞后，涂布于含潮霉素b100μg/ml的lb固体培养基上，37℃培养12～18个小时，挑取阳性单克隆菌落扩大培养并提取质粒；s104、采用序列如seqidno.5和seqidno.6所示引物对步骤s103提取的质粒扩增，获得扩增片段大小为640bp，说明阳性单克隆菌含有目的基因，重组质粒进行一代测序，测序结果如与seqidno.7所示序列一致，则获得的阳性单克隆菌落含有用于表达甲基化hbha的表达载体。如上所述的重组耻垢分枝杆菌菌株的制备方法，优选地，在步骤s2中，转化耻垢分支杆菌采用电转化法，条件为电压2500v，电容25μf，电阻1000ω，之后采用潮霉素抗性7h10筛选平板筛选菜花样单克隆阳性菌落，采用序列如seqidno.5和seqidno.6所示引物对阳性菌落鉴定，含有640bp条带，说明获得阳性菌落为表达甲基化hbha蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株。一种表达甲基化hbha蛋白的方法，其采用如上所述表达甲基化hbha蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株进行培养，并在培养过程中诱导重组耻垢分枝杆菌菌株含有的甲基化hbha重组表达载体进行表达，培养结束后对表达产生的甲基化的hbha进行分离纯化。如上所述的表达甲基化hbha蛋白的方法，优选地，重组耻垢分枝杆菌菌株培养采用含潮霉素b100～150μg/ml的液体培养基7h9进行，得到od值为0.6～1.0的菌液，向该菌液中按终浓度0.15～0.2g/10ml菌液加入乙酰胺，然后继续培养进行诱导表达，然后离心收集菌体，将收集的菌体超声裂解至所得裂解液呈清晰透明后，离心分离上清，使用his亲和纯化柱对收集的上清进行亲和层析，得到纯化后的蛋白。如上所述的表达甲基化hbha蛋白的方法，优选地，所述诱导表达的条件为37℃、160～200rpm摇床培养48～72小时。如上所述的表达甲基化hbha蛋白的方法，优选地，所述超声裂解的条件为超声功率130～150w，超声振幅70～80％，超声时间为5～10秒，超声间隔时间为10秒。(三)有益效果本发明的有益效果是：本发明提供的用于表达甲基化hbha蛋白的表达载体，可用于转化表达甲基化hbha蛋白。本发明提供的转化有甲基化hbha重组表达载体的宿主工程菌株cgmccno.20811，可以高效稳定地表达重组甲基化hbha蛋白，且重组甲基化hbha蛋白的诱导生产过程可控，分离纯化工艺简单、活性高，可以作为有效的抗原于体外刺激外周血t淋巴细胞产生ifn-γ，为结核分支杆菌感染的辅助诊断(例如，鉴别诊断结核分枝杆菌潜伏感染与活动感染)提供了安全、有效且充足的检测试剂，本发明提出的制备甲基化的、可刺激致敏t淋巴细胞释放ifn-γ的hbha抗原的方法在hbha功能研究和结核分支杆菌感染体外诊断中具有广泛的应用前景。附图说明图1为pmyca-hbha重组表达载体图谱，图中顶部数字1表示质粒起始点；图2为hbha表达产物的sds-page电泳图谱；图3为hbha表达产物western-blot的鉴定结果；图4为以抗hbha多克隆抗体行western-blot的结果；图5为以泛抗甲基化赖氨酸抗体行western-blot的结果；图6为甲基化hbha(mhbha)刺激下的ifn-γ释放试验。具体实施方式为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。实施例11、目的基因的克隆及质粒载体线性化以结核分枝杆菌hbha基因(rv0475，geneid：886272)为模板，设计用于pcr扩增引物，目的是为了获得大量的结核分枝杆菌hbha基因，同时设计质粒载体线性化引物，合成引物时，在hbha基因的上、下游引物上均设计含有与质粒载体线性化的上、下游引物对应互补的同源臂序列，用于进行不依赖于连接反应的克隆；设计出多对引物(如下)进行试验，验证其实验效果。引物组一：hbha上游引物f1(seqidno.1)：5`-agaacctgtacttccagggcatggctgaaaactcgaacat-3`hbha下游引物r1(seqidno.2)：5`-gcctggcagtcgatcgtacgctacttctgggtgaccttct-3`pmyca上游引物f2(seqidno.3)：5`-cgtacgatcgactgccaggc-3`pmyca下游引物r2(seqidno.4)：5`-gccctggaagtacaggttct-3`引物组二：hbha上游引物f3(seqidno.8)：5`-aacctgtacttccagggcgcatggctgaaaactcgaacat-3`hbha下游引物r3(seqidno.9)：5`-gatgcctggcagtcgatcgtctacttctgggtgaccttct-3`pmyca上游引物f4(seqidno.10):5`-acgatcgactgccaggcatc-3`pmyca上游引物r4(seqidno.11):5`-gcgccctggaagtacaggtt-3`引物组三：hbha上游引物f5(seqidno.12)：5`-tccagggcgccatggacgatatggctgaaaactcgaacat-3`hbha下游引物r5(seqidno.13)：5`-atttgatgcctggcagtcgactacttctgggtgaccttct-3`pmyca上游引物f6(seqidno.14):5`-tcgactgccaggcatcaaat-3`pmyca上游引物r6(seqidno.15):5`-atcgtccatggcgccctgga-3`引物组四：hbha上游引物f7(seqidno.16)：5`-tacttccagggcgccatggaatggctgaaaactcgaacat-3`hbha下游引物r7(seqidno.17)：5`-gttttatttgatgcctggcactacttctgggtgaccttct-3`pmyca上游引物f8(seqidno.18):5`-tgccaggcatcaaataaaac-3`pmyca上游引物r8(seqidno.19):5`-tccatggcgccctggaagta-3`。经试验发现，虽然上述引物序列亦可以将hbha基因片段插入表达载体，但有些会导致重组的耻垢分枝杆菌表达载体在耻垢分枝杆菌中不表达。最后选择的是在hbha基因的上游引物f1、下游引物r1均设计含有20bp的与pmyca上游引物f2、下游引物r2对应互补的同源臂序列(下划线部分)，用于进行不依赖于连接反应的克隆(lic)：hbha基因扩增引物hbha上游引物f1(seqidno.1)：5`-agaacctgtacttccagggcatggctgaaaactcgaacat-3`hbha下游引物r1(seqidno.2)：5`-gcctggcagtcgatcgtacgctacttctgggtgaccttct-3`1.2质粒载体线性化引物通过前期试验，选用限制性内切酶连结方法由于操作复杂且依赖于特定的插入位点，不能实现任意位点的连结，因此采用不依赖于连接反应的克隆方法将hbha基因扩增片段与线性化的pmyca载体相连接。选择的质粒载体为pmyca载体(addgeneid:84268)，通过扩增方式获得线性化pmyca载体，引物设计最后确定选择在pmyca载体tev标签切除位点之后、t1终止子之前的多克隆位点(multiplecloningsite，mcs)区域。具体所用引物序列如下：pmyca上游引物f2(seqidno.3)：5`-cgtacgatcgactgccaggc-3`pmyca下游引物r2(seqidno.4)：5`-gccctggaagtacaggttct-3`1.3hbha基因片段pcr扩增反应体系及具体反应程序pcr反应体系参见表1，其中，h37rv基因组dna由结核分枝杆菌h37rv(来自北京中国农业大学，时间为2008年8月)中提取，基因组dna提取方法参见《医学分子生物学实验技术》(人卫第3版，药立波主编)。表1.hbha基因片段扩增反应体系组分体积数h37rv基因组dna(25.7ng/μl)2μlhbha上游引物f1(10μmol/l)2μlhbha下游引物r1(10μmol/l)2μl2×taqpcrmastermix25μlddh2o19μl总体积50μlpcr反应程序参见表2：表2.hbha基因片段扩增反应程序pcr扩增后获得hbha基因扩增片段。1.4线性化pmyca载体扩增反应体系及具体反应程序pcr反应体系参见表3，pmyca质粒来自young-hwasong的馈赠。表3.线性化pmyca载体扩增反应体系组分体积数质粒pmyca(91.6ng/μl)1μlpmyca上游引物f2(10μmol/l)2μlpmyca下游引物r2(10μmol/l)2μl2×taqpcrmastermix25μlddh2o20μl总体积50μlpcr反应程序参见表4：表4.线性化pmyca载体扩增反应程序pcr扩增后获得线性化的pmyca载体。2、重组耻垢分枝杆菌mc2-155-mhbha菌株的构建及鉴定2.1pmyca-hbha重组质粒构建将上述获得的hbha基因扩增片段、线性化pmyca载体与trelieftmsosoomix(北京擎科生物科技有限公司)充分混合，50℃反应15分钟，然后使用热激法：1、实验前将水浴锅温度调至42℃，并提前加热到预设温度。2、冰上融化感受态dh5a，加1μg/μl的质粒1μl于10μl感受态中，冰上放置30min。3、42℃水浴锅中热休克90s，迅速转移至冰上2min-5min。4、在无菌工作台内向各管含质粒的感受态中加入200μllb培养液(无抗性)，然后转移到培养管中，37℃条件下，低速培养1h。5、将200μl悬液倒入相应抗性的lb固体培养基上，把涂布棒在酒精灯上过火灭菌然后把悬液涂布均匀，倒置于37℃恒温孵箱中培养12-16小时，次日观察菌落生长情况。转化入dh5α感受态细胞(购自擎科生物科技有限公司)后，移液器吸取400μl混合物均匀涂布于含潮霉素b100μg/ml的lb固体培养基上，37℃培养12～18个小时，挑取阳性单克隆菌落扩大培养并提取质粒。将提取的质粒用包含连接处的引物做菌液pcr及琼脂糖凝胶电泳检测，引物序列如下：上游引物f3(seqidno.5)：5`-agaacctgtacttccagggc-3`下游引物r3(seqidno.6)：5`-gcctggcagtcgatcgtacg-3`检测结果显示扩增片段大小为640bp，说明阳性单克隆菌落中含有hbha基因。重组质粒进行一代测序，结果表明重组质粒全长6500bp，其包括：cole1型质粒dna复制起始区域cole1，分枝杆菌复制起始位点orim，乙酰胺酶启动子调节器amia(msmeg_5338)和amic(msmeg_5339)(结合乙酰胺，调节启动子启动)，结核分枝杆菌h37rv来源hbha片段(accessionnumber：rv0475，600bp)、t1终止子及潮霉素抗性筛选基因hygr，具体序列见seqidno.7所示，dna序列正确。因此，重组质粒构建成功，命名为pmyca-hbha，参见图1。所述重组表达载体表达的甲基化hbha蛋白携带组氨酸(6×his)标签及tev标签切除位点，通过潮霉素抗性基因hygr进行筛选。2.2重组质粒转化宿主细胞使用电转化的方法将重组质粒pmyca-hbha转化入前期制备并保存的耻垢分枝杆菌mc2-155菌株感受态细胞(购自美国atcc细胞资源中心，获取时间2011年8月，感受态细胞制备的具体方法为：吸取400μl的耻垢分枝杆菌mc2-155菌液，加入至100ml7h9液体培养基(含有tween-80和oadc)中，37℃，220rpm摇菌3-4天；至od600达到0.4-0.6；冰浴90min，常温7000×g离心8min，收集细菌；弃除上清，用高压过的10％甘油洗涤菌体2-3次，7000×g离心8min，最后用2ml10％的甘油重悬细菌，200μl分装保存于-80℃备用。bio-rad电转化仪电转化条件为：电转杯直径2mm，电压2500v，电容25μf，电阻1000ω；耻垢分枝杆菌mc2-155菌株感受态细胞浓度为：od值在600nm为0.6左右；重组质粒浓度为：163.2ng/μl；二者体积比为：10:1。电转化后向电转杯中加入500μl7h9培养基(含10％oadc、0.5％甘油及0.05％tween-80)，37℃、5％co2孵育4小时后均匀涂布于潮霉素抗性7h10(middlebrook，潮霉素浓度为150μg/ml)筛选平板上。培养72小时(37℃)，可见明显菜花样单克隆阳性菌落生长，挑取单克隆阳性菌落做菌液pcr鉴定(采用上游引物f3(seqidno.5)、下游引物r3(seqidno.6))含有大小正确的条带(约640bp)，表明电转化成功，菌株命名为重组耻垢分枝杆菌mc2-155-mhbha。需要注意的是：耻垢分枝杆菌感受态细胞需要新鲜制备，电转化后必须加入培养基温育后再接种于抗性培养基进行筛选，保证电转化的成功率。将该重组耻垢分枝杆菌菌株mc2-155-mhbha于2020年09月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)进行保藏，菌株名称为耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)，保藏编号为cgmccno.20811。实施例2重组耻垢分枝杆菌mc2-155-mhbha的诱导表达、蛋白纯化及鉴定1小量诱导表达及鉴定将实施例1中获得阳性菌落重组耻垢分枝杆菌mc2-155-mhbha接种于10ml含潮霉素b100μg/ml的液体培养基7h9(含10％oadc、0.5％甘油及0.05％tween-80)中，37℃、200r摇床培养48小时，测od值为0.6～1.0。向其中加入0.2g乙酰胺(终浓度为2％，w/v)诱导表达48小时后，6000g离心10分钟收集菌体。于冰上超声裂解菌体(参数：功率130w，振幅80％，超声10秒，暂停10秒)，至菌液呈清晰透明后，于4℃、12000g离心30min，收集上清，使用his亲和纯化柱对诱导后的上清液进行亲和层析纯化蛋白。使用10kda和50kda的millipore超滤离心管除盐后，进行蛋白纯度和浓度分析。蛋白产量大于2mg/ml，纯度大于95％。最后将纯化获得的蛋白，使用sds-page鉴定表达情况，结果见图2，图中泳道1.marker；泳道2.乙酰胺诱导表达全菌裂解液上清；泳道3.通过his柱子后滤过液；泳道4.bindingbuffer冲洗液；泳道5.elutionbuffer洗脱第1ml；泳道6.elutionbuffer洗脱第2ml；泳道7.elutionbuffer洗脱第3ml。结果表明获得的蛋白大小约为30kda。应用抗hbha多克隆抗体以免疫印迹(western-blot)法(购自genescript公司)鉴定表达蛋白性质，结果见图3，其中泳道1.marker；泳道2.bcg中表达的天然hbha蛋白(本实验室前期制备，只是用于验证说明，其具体制备方法见论文周珊,马越云,刘家云,等.重组和天然hbha蛋白制备及其活性研究[j].中华检验医学杂志,2010(03):271-275.)；泳道3.重组大肠杆菌e.coli表达的hbha蛋白(本实验室前期制备，只是用于验证说明，其具体制备方法见论文见周珊,马越云,刘家云,等.重组和天然hbha蛋白制备及其活性研究[j].中华检验医学杂志,2010(03):271-275.)；泳道4.重组耻垢分枝杆菌mc2-155-mhbha表达的hbha蛋白。确认重组耻垢分枝杆菌mc2-155-mhbha表达产物为hbha，但相对分子量大小与其他菌株表达的有一定区别。2甲基化鉴定对mc2-155-mhbha表达产物进行蛋白纯化后，获得的蛋白，应用抗甲基化赖氨酸抗体，以western-blot法鉴定hbha甲基化。大肠杆菌表达的hbha，这由前期本实验室制备，以抗hbha多克隆抗体行western-blot的结果见图4，抗甲基化赖氨酸抗体行western-blot的结果见图5，图4和图5中泳道1.marker；泳道2.mc2-155-mhbha表达产物；泳道3.e.coli-hbha表达产物。可见大肠杆菌表达的hbha不具有甲基化，而重组耻垢分枝杆菌mc2-155-mhbha表达产物有甲基化表现(图4)，即为重组mhbha(his标签已去除，pmyca载体载体自带his标签及tev标签切除位点)。3ifn-γ释放试验取标记有样本1-样本8的8管不同新鲜全血各6ml，加入不同浓度的重组mhbha，由上述亲和层析纯化获得的蛋白(0、1、5、10、20和50μg/ml)，于37℃孵育18h。之后以elisa法测定ifn-γ水平。结果见图6，其中：1.样本1；2.样本2；3.样本3；4.样本4；5.样本5；6.样本6；7.样本7；8.样本8。可见5μg/mlhbha可有有效刺激ifn-γ释放。由上可知：1)与重组大肠杆菌工程菌株表达的hbha相比，产生的重组hbha蛋白纯度相当，但mc2-155-mhbha表达的hbha蛋白具有甲基化结构修饰，而大肠杆菌的hbha表达产物则不具有甲基化结构修饰。2)与采用pmv为基础骨架(如pmv261)的重组hbha表达载体的表达效率相比，表现出了以下优点：一是以乙酰胺为启动表达条件，异源表达调节更严格，而pmv系列载体以热休克蛋白hsp60为启动子，受环境温度影响大，可控制性差，该重组hbha表达载体更有利于实现工业化生产的精细化调控，具有更好的市场前景，二是在同等细菌产量条件下，pmyca-hbha比pmv261-hbha目的蛋白产量更高(pmyca-hbha蛋白产量可达2mg/ml以上，而pmv261-hbha一般不超过1mg/ml)。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。序列表<110>中国人民解放军空军特色医学中心<120>一种表达甲基化hbha蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株、制备方法及其应用<130><160>19<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agaacctgtacttccagggcatggctgaaaactcgaacat40<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gcctggcagtcgatcgtacgctacttctgggtgaccttct40<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cgtacgatcgactgccaggc20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gccctggaagtacaggttct20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agaacctgtacttccagggc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gcctggcagtcgatcgtacg20<210>7<211>6500<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cctcggctaccgcgtccaccaggcggttgcgcagcgtccgcccccgcggggtcaacgcca60cgagcacccgccggcggtcatgcagatcggcagtccggtagatgatcccttgcgacacaa120ggcgatcgacggttctggtgagagtcggacccgtgatcagcgtggcctgcgcgagatcgc180tcatgggcacggtgcgccgtccggccaactcgtcgagcacgcgccagtcctcgatcttga240gcgacgagtccgcgagcacgcgttcgatcgccgactccgcgaggtgggtcagacgcacca300acggcagcaggaggttggggcggcgctgctgtccggcggccatgttgggtctcctcgtgt360cgacggcggggtctgttcagaatgaattatttctgctagaaacctttgaagcgcagacta420cacgggatcgacggtgatctggagtgcaggacggcgaggttgagttccgcgtcgggctgg480tgattccgcttcaagggccagcgggaatcttcgcgccttcgtgcgaggccgtggccgagc540tcgcggccaaggaggtcaacgaccgaggcggcctgcagggccgcaaggtcaccatcgagg600tgctcgacggcggagcgcccggcgacgacgtcgcccggaccgtcgccgaccggttgcgag660gtcacggtctcgacgccgtgaccggctggcacatctcggccgtgcgcaaccgcatctccc720cggtggtccgcgaccgcatcccgtacgtctacacctcgttgtacgagggcggtgaacgca780caccgggcgtgttctgcacaggcgagacaccgcagatccagatcgcgcccgcgctcgcct840ggctgcgcgaccacttcggcatccggtcctggtgcctggtcggcgatgactacatctggc900cgcgccgttccgccgcggccgcccgcgcgtactgccgagatctggacctcgagctcagac960gggagatctacgtcccgtacggcaccgacgatttccgcgcacctgtccgcaaggccatcg1020cgtcgggggcgcaggccgtgttgatgctgctcgtcggccaggacgccgtgttgttcaacc1080gcgagttcgcgcgcgccggcgggcacgaccgcatggcgcggttcagcccgctgatggagg1140agaacatgctgctggccagcggcgccggctccaccgaaaacctctatgtcgccgcggcgt1200acttcagttcactggccaccgcgggtgcgatggacctgatgggcagctacgtcgcccgct1260acggcgccgacgcgccaccgctcaacgcgatggccgaatcctgttacgagggtctgcttg1320cgctcgaggccatcttccagcgggcccactcccccgagataccggacctgatggcatccg1380cgcacgatgtcgggttcgacgggccccggggcccgatgtgtatgcgcgacagtcaattcg1440accagcaggtctacatcgccagcgccgacggctacgacttcgacatcctcgacacgctgg1500cgacgctcgacgcttgagaccgcgtcacttctttatctagatttaaagatctggtaccgc1560ggccgcgccacggatgccaccacaggcactacaacggagttcgccacgtacatcaccaca1620accaccgattctggcggtgagctccccgatattcagcggaaatggcttggtatcgaccaa1680gattcgtagaaccccgtctcgtctggctggtattcaaaacgggcgcaacgaaacacgcaa1740cgagacaggcatggcccaaaccagaaaactagcgtctaccaggacttttacctgtccgac1800ccgttgcaacggaaccccccacggaacccccgcgacacccgctccccaattgcgttagaa1860cagcggtggattgtcggcttcgttgtgggccttttgagccgcttcctgttctgccgcacg1920ctctttcctcgcccgatagccgagtcgcttaacggtgtccagatgcagcccgaaatgttt1980ggccgtttgcggccaagagtggccctcgtcgtcgtgataggcgcggatgcgttcgcggcg2040tgcagcctgctcggcgagccactcgctgcgttcctgcgccacgagccggacgacgtggcg2100ttcggatagtccggtgattcgagcgccttcggcggcggtcacgcgccgctttttgcggac2160agtcggctgccggttgtagccgtcgctgtagccgtcgctcatagcaatgcctccatgcat2220ggctgacgcggactttgcgcgccgcgcaactgtgctcgccgccgtgcgcgctgctgcgcc2280cttccgcgagatggccgactggcgcgcactgagtgtggcctcgtagaccacgatcccgtc2340cgcccaaatgcgcgacttggttgtgatccaacgccaaatgctgttggcgatggcgcggac2400ctcgctgtccggtagcggtccgggacacacgtcgttgcacggaaattcggcgtttcgcgc2460gtggcactcggcatagatcgcgcggccgagtccgtccacgttccgggtcggcaggtagat2520ccgcatgagggcgggacgataggcccacaacctgacggaatcgaacagtgcgcaattccg2580ccctagcggcgtcggagccgctttgtacgtggtctgctgacgccagcgcggcggtggcat2640gttcgcgccgagctcggcctcgatgtggctgagtgtgtagagatctgagtggagccattc2700cgtttcccaggcgatgtggccggggtttttggtcatgaggcctgagtaactgcggtcgcc2760atcgacggcgcgccgaaggccttcggcgcacgccgccatgtatgcgagcggcttacgccg2820cgcgtattcggtgcgtggaacaggggcgttgagtgcccacactgcgtgtgcgtggccgtt2880ggcgcgattgcccacgatcgcgttgggcagcggatgggacccccgggcgctgagcgctcg2940gagcgctgcgtctggatggtctacgtccacgaccagcaggtttgccagcgctgttgggtt3000cgcctcgatgtaccggcggcctagggccgacgcgcggctttggcggtagatcccctcgag3060cagatcgtcgcttgccagcggccagtacggcagccagagctgctcaaattcgtcggcgac3120gtggctcacgcttggtagtagaccacgattaatcaccggtgtatggtccgacacgagctc3180caagtcagatatttcgctgaggggccaccccacaactgcacactcccccgctctcccgtc3240gagccctggtggtggaacaccagcgacagccgagcacccccaaccacctgtaccaaccag3300gaggaacacatgcgtcgtttcgaggacgtttccgggccgctgagagccgctgtggcggcc3360gtacacgccgccttagacccgttagaccccctgccgcctgaatgcgcgggtacgagccac3420acagcgcccgaacttacggagctggtgggctcacgcgtgcggccgcacgcgttgcgctcg3480gtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccaca3540gaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaac3600cgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcac3660aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcg3720tttccccctggaagctccctcgttcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtcc3780gcctttctcccctcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagt3840tcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgac3900cgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcg3960ccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctaca4020gagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgc4080gctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaa4140accaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaa4200ggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcatggaactagagca4260tgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaat4320caatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg4380cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgacgtgg4440ccgaccagcccgtcatcgtcaacgcctgatccgcggtgcggacaggccgtgtcgcgaccg4500gccgtgcggaattaagccggcccgtaccctgtgaatagaggtccgctgtgacacaagaat4560ccctgttacttctcgaccgtattgattcggatgattcctacgcgagcctgcggaacgacc4620aggaattctgggagccgctggcccgccgagccctggaggagctcgggctgccggtgccgc4680cggtgctgcgggtgcccggcgagagcaccaaccccgtactggtcggcgagcccggcccgg4740tgatcaagctgttcggcgagcactggtgcggtccggagagcctcgcgtcggagtcggagg4800cgtacgcggtcctggcggacgccccggtgccggtgccccgcctcctcggccgcggcgagc4860tgcggcccggcaccggagcctggccgtggccctacctggtgatgagccggatgaccggca4920ccacctggcggtccgcgatggacggcacgaccgaccggaacgcgctgctcgccctggccc4980gcgaactcggccgggtgctcggccggctgcacagggtgccgctgaccgggaacaccgtgc5040tcaccccccattccgaggtcttcccggaactgctgcgggaacgccgcgcggcgaccgtcg5100aggaccaccgcgggtggggctacctctcgccccggctgctggaccgcctggaggactggc5160tgccggacgtggacacgctgctggccggccgcgaaccccggttcgtccacggcgacctgc5220acgggaccaacatcttcgtggacctggccgcgaccgaggtcaccgggatcgtcgacttca5280ccgacgtctatgcgggagactcccgctacagcctggtgcaactgcatctcaacgccttcc5340ggggcgaccgcgagatcctggccgcgctgctcgacggggcgcagtggaagcggaccgagg5400acttcgcccgcgaactgctcgccttcaccttcctgcacgacttcgaggtgttcgaggaga5460ccccgctggatctctccggcttcaccgatccggaggaactggcgcagttcctctgggggc5520cgccggacaccgcccccggcgcctgacgccccctctagctgatcaccgcggccatgatgg5580cataaaacgaaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctggcagt5640cgatcgtacgctacttctgggtgaccttcttggccgccgccttcttcgcgggcgccttct5700tggccgccgccttcttggccggagcggccttcttggccggagcggccttcttggccggag5760cagccttcttaggcagctcgatgccgaccagcttggcggcacgctcaccgaccgcgcggg5820tctgcgatgcgaccgtacccaacgcctcctgggtcaactccaccgcctggtccacgtagc5880cttcggcgcgcgccgacacttcctcgaagctctgctggctgcgcagccgctctagagcgg5940cctcaccgcgctcgaccagctcgttgtaccggctagtcgcggcctcgaggtagccctcgg6000cggccttacgcagctcctcggcggtgaacttctcacgcagctcggtgagctgctcgggca6060gatcttcctgcagcttggtcaggcgagcacggctctcctcgacccggctgcgggtgtccg6120tacgagtctcctccgcacgctcacgcaggttcgtgatcaactcgttgacagtggccaagg6180ccaggtcggccgctccaagcgcggcaagcaacggagccttgatgtcatcaatgttcgagt6240tttcagccatgccctggaagtacaggttctcgccggccgacgggtggtggtggtggtggt6300gcttcatggtggactccctttctcttatgtacaggtcacccctttccattcacccgaaat6360atatccagatgaaaataaaagtcaagggtgaacgcccgcgccgggcgcgggtggttacga6420agtcaaattcgaggtggtgtcgacgagttcgcgcaactggtcgacgtccagcccgcacga6480ttcaaaagccgcacactcgg6500<210>8<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aacctgtacttccagggcgcatggctgaaaactcgaacat40<210>9<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gatgcctggcagtcgatcgtctacttctgggtgaccttct40<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10acgatcgactgccaggcatc20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gcgccctggaagtacaggtt20<210>12<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tccagggcgccatggacgatatggctgaaaactcgaacat40<210>13<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13atttgatgcctggcagtcgactacttctgggtgaccttct40<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tcgactgccaggcatcaaat20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15atcgtccatggcgccctgga20<210>16<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16tacttccagggcgccatggaatggctgaaaactcgaacat40<210>17<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gttttatttgatgcctggcactacttctgggtgaccttct40<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18tgccaggcatcaaataaaac20<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19tccatggcgccctggaagta20当前第1页12