CRISPR系统及其在构建SCN1A基因突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于scn1a基因编辑的crispr/cas9系统及其应用。

背景技术：

癫痫(epilepsy)即俗称的“羊角风”或“羊癫风”，是大脑神经元突发性异常放电导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。由于异常放电的起始部位和传递方式的不同，癫痫发作的临床表现复杂多样，可表现为发作性运动、感觉、自主神经、意识及精神障碍等症状。癫痫患者经过正规的抗癫痫药物治疗，约70％的患者其发作是可以得到控制的，其中50％～60％的患者经2～5年的治疗可以痊愈，患者可以和正常人一样地工作和生活。癫痫的发病机制非常复杂，中枢神经系统兴奋与抑制间的不平衡导致癫痫发作，其主要与离子通道神经递质及神经胶质细胞的改变有关。

癫痫性脑病(epilepticencephalopathies，ees)是癫痫性异常导致进展性脑部功能障碍，是一种儿童期常见的脑部疾病，以多种严重的癫痫症候群为特征的神经系统功能紊乱性疾病。ees是发生在婴儿和儿童的严重痉挛性疾病，首次发病多见儿童、青年时期，男性高于女性，儿童死亡率是成人的10倍，然而病因、发病机制仍不十分明确，年龄依赖性是ees的共同特征，早发性癫痫性脑病(early-onsetepilepticencephalopathies，eoee)包括早发性肌阵挛脑病(earlymyoclonicepilepticencephalopathy，emee)、大田原综合征(ohtaharasyndrome，os)、婴儿恶性游走性部分性癫痫(malignantmigratingpartialseizuresininfancy，mmpsi)、west综合征及dravet综合征。

dravet综合征，以前称为严重的婴儿肌阵挛性癫痫(severemyoclonicepilepsyofinfancy，smei)，由dravet在1978年首次描述，患儿均于1岁内起病，起病高峰年龄为生后6个月内。最常见的首发症状为发热诱发的较长时间惊厥发作(30分钟以上)，表现为单侧肢体阵挛或双侧强直阵挛发作，部分患儿首次发作前有接种疫苗诱因。1岁后逐渐出现无热惊厥，但仍有热敏感特点(遇到发热性疾病或环境温度过热即可出现癫痫发作)，癫痫发作可以表现为多种形式，包括局灶性发作、全面强直阵挛发作(癫痫大发作)、肌阵挛发作、不典型失神发作等，易出现癫痫持续状态。患儿起病前发育多正常，发病后通常会经历语言和运动技能发展滞后、多动症和睡眠困难、慢性感染、生长和平衡问题以及与他人相处困难等问题，60％患儿有共济失调表现，且不会随着时间的推移而消失，被诊断为dravet综合征的儿童需要有极大耐心和密切关注他们生活的看护人。在以后的生活中，dravet综合征患者会出现无症状的癫痫发作，包括肌阵挛性发作、强直性-阵挛性发作、失神、简单和复杂的局部发作。在70％的dravet综合征患者中发现了scn1a基因突变，该基因编码神经元电压门控钠离子通道na(v)1.1α亚基蛋白(电压门控钠离子通道是可兴奋细胞中动作电位产生和传导所必需的一个离子通道，主要发生在神经和肌肉)，特异性定位于神经元胞体。因此，本发明基于scn1a基因突变开发了克隆猪核移植供体细胞，后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育出活体猪模型，可用于进行dravet综合征发病机制研究，并为相关药物的开发及临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类相关疾病奠定基础。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的zfn、talen、crispr/cas9等编辑技术，其中crispr/cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于scn1a基因编辑的crispr/cas9系统。

本发明的另一目的是提供用于scn1a基因编辑的grna及其表达载体。

本发明的又一目的是提供所述的crispr/cas9系统在构建scn1a基因突变的猪重组细胞中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种用于猪scn1a编辑的crispr/cas9系统，包含cas9表达载体和针对猪scn1a的grna表达载体；所述的cas9表达载体为质粒全序列如seqidno.2所示的pu6grna-eef1a-mnls-hspcas9-egfp-puro载体。

为了增加cas9质粒的基因编辑能力，我们在购自addgene(plasmid#42230，fromzhangfenglab)px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9(简称px330)载体的基础上进行改造得到pu6grna-eef1a-mnls-hspcas9-egfp-puro(简称粒pkg-ge3)。px330的图谱如图1，改造方式如下：

1)去除原载体grna骨架中多余无效的序列；

2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的ef1a启动子，增加cas9基因的蛋白表达能力；

3)增加核定位信号：在cas9的n端及c端均增加核定位信号编码序列(nls)，增加cas9的核定位能力；

4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在cas9的c端，插入p2a-egfp-t2a-puro，赋予载体荧光和抗性筛选能力；

5)插入wpre和3’ltr等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入wpre、3’ltr等序列，可增强cas9基因的蛋白翻译能力。

改造后载体pu6grna-eef1a-mnls-hspcas9-egfp-puro(简称pkg-ge3)及改造位点如图2，质粒全序列如seqidno：2所示；pkg-ge3的主要元件有：

1)grna表达元件：u6grnascaffold；

2)启动子：ef1a启动子和cmv增强子；

3)含多个nls的cas9基因：含n端和c端多核定位信号(nls)的cas9基因；

4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件p2a-egfp-t2a-puro；

5)增强翻译的元件：wpre和3’ltr增强cas9及筛选标记基因的翻译效率；

6)转录终止信号：bghpolyasignal；

7)载体骨架：包括amp抗性元件和ori复制子等。

质粒pkg-ge3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；

所述特异融合蛋白自n端至c端依次包括如下元件：两个核定位信号(nls)、cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽p2a、荧光报告蛋白、自裂解多肽t2a、抗性筛选标记蛋白；

质粒pkg-ge3中，由ef1a启动子启动所述特异融合基因的表达；

质粒pkg-ge3中，所述特异融合基因下游具有wpre序列元件、3’ltr序列元件和bghpoly(a)signal序列元件。

质粒pkg-ge3中，依次具有如下元件：cmv增强子、ef1a启动子、所述特异融合基因、wpre序列元件、3’ltr序列元件、bghpoly(a)signal序列元件。

所述特异融合蛋白中，cas9蛋白上游的两个核定位信号为sv40核定位信号，cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。

所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为egfp蛋白。

所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为puromycin蛋白。

自剪切多肽p2a的氨基酸序列为“atnfsllkqagdveenpgp”(发生自剪切的断裂位置为c端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

自裂解多肽t2a的氨基酸序列为“egrgslltcgdveenpgp”(发生自裂解的断裂位置为c端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

特异融合基因具体如seqidno：2中第911-6706位核苷酸所示。

cmv增强子如seqidno：2中第395-680位核苷酸所示。

ef1a启动子如seqidno：2中第682-890位核苷酸所示。

wpre序列元件如seqidno：2第6722-7310位核苷酸所示。

3’ltr序列元件如seqidno：2中第7382-7615位核苷酸所示。

bghpoly(a)signal序列元件如seqidno：2中第7647-7871位核苷酸所示。

作为本发明的一种优选,针对猪scn1a的grna表达载体的载体骨架为pkg-u6grna，质粒全序列如seqidno.3所示。

作为本发明的进一步优选,该表达载体表达seqidno.36所示的grna，其靶点如seqidno.21所示。

作为本发明的一种优选,所述的针对猪scn1a的grna表达载体由seqidno.26和seqidno.27所示的单链dna退火而成的双链插入载体骨架pkg-u6grna所得。

作为本发明的更进一步优选,所述的grna表达载体和cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。

一种重组细胞，由本发明所述的crispr/cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

本发明所述的重组细胞在构建scn1a敲除的克隆猪中的应用；优选在构建scn1a敲除的癫痫性脑病克隆猪中的应用。

针对猪scn1a的grna，序列如seqidno.22所示。

一种针对猪scn1a的grna表达载体，该表达载体表达seqidno.36所示的grna；且该表达载体的载体骨架为pkg-u6grna，质粒全序列如seqidno.3所示；所述的grna表达载体优选由seqidno.26和seqidno.27所示的单链dna退火而成的双链插入载体骨架pkg-u6grna所得。

本发明所述的crispr/cas9系统、本发明所述的grna表达载体在构建猪scn1a突变的猪重组细胞中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。

大小鼠等啮齿类动物不论从生理、病理及体型上，均与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。灵长类动物扩繁速度慢、数量少、成本高，动物保护及伦理等方面的要求也较高。而猪就没有上述缺点，同时猪的克隆技术非常成熟，饲养及克隆成本较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。

(2)本发明中经过实验验证改造的pu6grna-eef1a-mnls-hspcas9-egfp-puro载体相对改造前的px330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明筛选的grna联合改造的cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。

(3)本发明针对scn1a基因的不同靶点grna设计了相应的表达载体，通过筛选获得具有较高编辑效率的grna及其表达载体。配合本发明改造的cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因pcr产物测序结果可分析出所获细胞的基因型(包括双等位基因相同变异的纯合突变、双等位基因不同变异的纯合突变、杂合突变型或野生型)，获得纯合突变的概率为20％～50％，大大优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得纯合突变的概率(低于5％)。

(4)利用本发明所得到的纯合突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。

本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。

附图说明

图1为质粒px330的结构示意图。

图2为质粒pu6grnacas9的结构示意图。

图3为pu6grna-eef1acas9载体的结构图谱。

图4为pu6grna-eef1acas9+nnls载体图谱。

图5为质粒pkg-ge3的结构示意图。

图6为质粒pkg-u6grna的结构示意图。

图7为将20bp左右的dna分子(用于转录形成grna的靶序列结合区)插入质粒pkg-u6grna的示意图。

图8为实施例2中步骤2.3.3的测序峰图。

图9为实施例2中步骤2.4.3的测序峰图。

图10为实施例3中步骤3.2.3以猪的基因组dna为模板分别采用scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r639(组1)、scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r746(组2)、scn1a-e22g-f-69/scn1a-e22g-r639(组3)、scn1a-e22g-f-69/scn1a-e22g-r746(组4)组成的引物对进行pcr扩增后的电泳图。

图11为实施例3中步骤3.2.4以18只猪的基因组dna为模板采用scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r746组成的引物对进行pcr扩增后的电泳图。

图12为实施例4中步骤4.3.4以基因组dna为模板采用scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r746组成的引物对进行pcr扩增后的电泳图。

图13为实施例5中步骤5.4.4以基因组dna为模板采用scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r746组成的引物对进行pcr扩增后的电泳图。

图14为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。

图15为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位相同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图16为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为杂合突变型的示例性测序峰图。

具体实施方式

实施例1、质粒的构建

1.1构建质粒pu6grnaeef1a-mnls-hspcas9-egfp-puro(简称质粒pkg-ge3)

原始质粒px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9(简称质粒px330)，序列如seqidno：1所示。质粒px330的结构示意图见图1。seqidno：1中，第440-725位核苷酸组成cmv增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码sv40核定位信号(nls)，第1325-5449位核苷酸编码cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(nls)。

质粒pu6grnaeef1a-mnls-hspcas9-egfp-puro(图5)，简称质粒pkg-ge3，核苷酸如seqidno：2所示。与质粒px330相比，质粒pkg-ge3主要进行了如下改造：①去除残留的grna骨架序列(gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttt)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的ef1a启动子，增加cas9基因的蛋白表达能力；③在cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(nls)，增加cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在cas9基因的下游插入p2a-egfp-t2a-puro编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入wpre元件和3’ltr序列元件，增强cas9基因的蛋白翻译能力。

pkg-ge3质粒构建方法如下：

(1)去除grna骨架中多余无效的序列

质粒px330用bbsi、xbai酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(seqidno：4)，与回收后载体片段重组得到pu6grnacas9载体(图2)。

(2)改造启动子及增强子

对构建好的pu6grnacas9载体，用xbai和agei内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(cmv增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含cmv增强子及ef1a启动子的序列(seqidno：5)，与酶切后载体pu6grnacas9重组得到pu6grna-eef1acas9载体(图3)。

(3)cas9基因n端增加nls序列

将构建好的载体pu6grna-eef1acas9使用agei、bglii酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了nls的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的cas9编码序列(seqidno：6)，重组得到pu6grna-eef1acas9+nnls载体(图4)。

(4)cas9基因c端加入nls、p2a-egfp-t2a-puro、wpre-3’ltr-bghpolyasignals

以上构建好的载体命名为pu6grna-eef1acas9+nnls，使用fsei、sbfi酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括nls-p2a-egfp-t2a-puro-wpre-3’ltr-bghpolyasignals的片段(seqidno：7)，与载体片段重组得到载体pu6grna-eef1a-mnls-hspcas9-egfp-puro，简称pkg-ge3，质粒图谱如图5，核苷酸序列(seqidno：2)。

seqidno：2中，第395-680位核苷酸组成cmv增强子，第682-890位核苷酸组成ef1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(nls)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(nls)，第1037-5161位核苷酸编码cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(nls)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(nls)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽p2a(自剪切多肽p2a的氨基酸序列为“atnfsllkqagdveenpgp”，发生自剪切的断裂位置为c端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码egfp蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽t2a(自裂解多肽t2a的氨基酸序列为“egrgslltcgdveenpgp”，发生自裂解的断裂位置为c端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码puromycin蛋白(简称puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成wpre序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’ltr序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bghpoly(a)signal序列元件。seqidno：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽p2a和自裂解多肽t2a的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有cas9蛋白的蛋白、具有egfp蛋白的蛋白和具有puro蛋白的蛋白。

1.2构建pkg-u6grna载体

来源puc57载体，通过ecorv酶切位点，连接pkg-u6grna插入序列(含u6启动子、bbsi酶切位点和sgrna骨架序列的dna片段，序列如seqidno：8所示)，反向插入到puc57载体，得到pkg-u6grna载体全序列(seqidno：3)，seqidno：3中，第2280-2539位核苷酸组成hu6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成grna骨架。使用时，将20bp左右的dna分子(用于转录形成grna的靶序列结合区)(图7)插入质粒pkg-u6grna(图6)，形成重组质粒，在细胞中重组质粒转录得到grna。

实施例2质粒配比优化以及质粒px330和质粒pkg-ge3的效果比较

2.1靶点grna设计及构建

2.1.1使用benchling对rag1基因进行靶点grna设计

rag1-g4：agttatggcagaactcagtg(seqidno.9)

合成针对上述rag1基因靶点的插入序列互补dnaoligo如下：

rag1-grna4s：caccgagttatggcagaactcagtg(seqidno.10)

rag1-grna4a：aaaccactgagttctgccataactc(seqidno.11)

rag1-grna4s、rag1-grna4a均为单链dna分子。

2.1.2设计用于扩增和检测包含rag1grna靶点片段的引物

rag1-nf126：ccccatccaaagtttttaaagga(seqidno.12)

rag1-nr525：tgtggcagatgtcacagtttagg(seqidno.13)

2.1.3将grna序列克隆到pkg-u6grna骨架载体上的方法

1)用限制性内切酶bbsi消化1ugpkg-u6grna质粒；

2)酶切的pkg-u6grna质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100ml电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(vazyme)纯化回收酶切产物；

3)将2.1.1所述靶点合成的2条互补dnaoligo，通过以下退火程序形成与pkg-u6grna载体bbsi酶切后粘性末端互补的dna双链，示意如图7：

95℃，5min然后以5℃/min的速率降至25℃；

4)按照以下体系启动连接反应：室温反应10min

5)转化

按照感受态细胞(vazyme)说明书进行操作。

2.1.4grna载体构建

1)将合成的rag1-grna4s和rag1-grna4a混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链dna分子。将具有粘性末端的双链dna分子和载体骨架连接，得到质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)。质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)将会表达seqidno.14所示的rag1-grna4。

2.1.5grna载体鉴定

从lb平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的lb培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认rag1-grna4载体构建成功。

2.2猪原代成纤维细胞制备

2.2.1取初生从江香猪耳组织0.5g，去除外部组织，75﹪酒精浸泡30-40s；

2.2.2用含5％p/s(gibcopenicillin-streptomycin)的pbs洗涤5次，不含p/s的pbs洗一次；

其中5％p/s的pbs配方为：5％p/s(gibcopenicillin-streptomycin)+95％pbs，5％、95％为体积百分比。

2.2.3用剪刀将组织剪碎，加入5ml0.1％的胶原酶(sigma)溶液，37℃摇床消化1h；

2.2.4500g离心5min，去上清，将沉淀用1ml完全培养基重悬，铺入含10ml完全培养基并已用0.2％明胶(vwr)封盘的10cm细胞培养皿中。

其中，细胞完全培养基的配方为：15％胎牛血清(gibco)+83％dmem培养基

(gibco)+1％p/s(gibcopenicillin-streptomycin)+1％hepes(solarbio)，15％、83％、1％、1％为体积百分比。

2.2.5置于37℃，5％co2(体积百分比)、5％o2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；

2.2.6将细胞培养至长满皿底60％左右时使用0.25％(gibco)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15ml离心管中，400g离心4min，弃去上清，使用1ml完全培养基重悬细胞以备下一步核转染实验。

2.3质粒配比优化

2.3.1共转染分组情况

第一组：将质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)和质粒pkg-ge3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)：1.56μg质粒pkg-ge3。即质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)和质粒pkg-ge3的摩尔配比为1：1。

第二组：将质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)和质粒pkg-ge3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)：1.28μg质粒pkg-ge3。即质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)和质粒pkg-ge3的摩尔配比为2：1。

第三组：将质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)和质粒pkg-ge3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)：1.08μg质粒pkg-ge3。即质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)和质粒pkg-ge3的摩尔配比为3：1。

第四组：将质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)转染致猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)。

2.3.2共转染操作方法

使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(neon)与neontmtransfectionsystem电转仪进行转染实验。

1)按照上述分组配制电转反应液，混匀过程中注意切勿产生气泡；

2)将步骤一制备得到的细胞悬液使用pbs磷酸缓冲液(solarbio)洗一遍，600g离心6min，弃去上清，使用11μl电转基本溶液opti-mem重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；

3)吸取10μl细胞悬液，加入步骤1)中的电转反应液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；

4)将试剂盒带有的电转杯放置于neontmtransfectionsystem电转仪杯槽内，加入3mlebuffer；

5)用电转枪吸取10μl步骤3)得到的混合液，插入点击杯内，选择电转程序(1450v10ms3pulse)，电击转染后立即在超净台内将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3ml15％胎牛血清(gibco)+83％dmem培养基(gibco)+1％p/s(gibcopenicillin-streptomycin)+1％hepes(solarbio)的完全培养液；

6)混匀后放置于37℃，5％co2、5％o2的恒温培养箱中进行培养；

7)电转后6-12h换液，36-48h用0.25％(gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5ml离心管中。

2.3.3基因编辑效率分析

提取2.3.2中收集的细胞基因组dna，采用rag1-nf126和rag1-nr525组成的引物对进行pcr扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版synthegoice工具分析测序峰图得出第一组、第二组、第三组的编辑效率依次为9％、53％、66％，测序结果示例性峰图见图8。分析认定第三组的基因编辑效率最高，即确定grna质粒与cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。

2.4质粒px330和质粒pkg-ge3的效果比较

2.4.1共转染分组情况

rag1-330组：将质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)和质粒px330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)：1.08μg质粒px330，其中pkg-u6grna(rag1-grna4)与px330摩尔比为3:1。

rag1-kg组：将质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)和质粒pkg-ge3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)：1.08μg质粒pkg-ge3，其中pkg-u6grna(rag1-grna4)与pkg-ge3摩尔比为3:1。

rag1-b组：将质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pkg-u6grna(rag1-grna4)。

2.4.2共转染操作方法

同本实施例中2.3.2。

2.4.3基因编辑效率分析

提取2.4.2中收集的细胞基因组dna，采用rag1-nf126和rag1-nr525组成的引物对进行pcr扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版synthegoice工具分析测序峰图得出rag1-330组、rag1-kg组的编辑效率分别为28％、68％，测序结果示例性峰图见图9，结果表明，与采用质粒px330相比，采用质粒pkg-ge3使得基因编辑效率显著提高。

实施例3scn1a基因靶点grna的设计及构建

3.1基因组dna的提取

使用vazyme公司fastpurecell/tissuednaisolationminikit(vazymecat.dc102-01)分别进行18只猪(雄性a、b、c、d、e、f、g、h雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)耳组织的基因组dna的柱式提取，使用nanodrop进行定量，-20℃保存备用。

3.2scn1a基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

3.2.1猪scn1a基因信息

电压门控钠离子通道α亚基1(sodiumvoltage-gatedchannelalphasubunit1)；位于15号染色体；geneid为106506270，susscrofa。猪scn1a基因编码的氨基酸序列如seqidno.15所示。已有研究结果表明70％的dravet综合征患者中发现scn1a基因突变，在猪基因组dna中，scn1a基因具有29个外显子，其中第22外显子序列(含部分第21内含子和部分第22内含子序列)如seqidno.16所示。

3.2.2scn1a基因敲除预设靶点外显子及邻近基因组序列pcr扩增引物设计

根据查到的猪scn1a基因组序列

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_010457.5？report＝genbank&from＝72529866&to＝72696715&strand＝true)，设计引物扩增前述18只猪基因组样品scn1a基因外显子22的位点。

使用oligo7软件进行引物设计，设计结果如下：

scn1a-e22g-f-27：gaaagactgaagactactagggg(seqidno.17)

scn1a-e22g-r639：ttattaatttattaatctacttg(seqidno.18)

scn1a-e22g-f-69：aaatatcctagaatagtcttgat(seqidno.19)

scn1a-e22g-r746：gttataatccaaccaggtgtgct(seqidno.20)

3.2.3scn1a基因组pcr扩增引物筛选

使用猪(雌性1#)耳朵组织提取的基因组为模板，使用设计的两条上游引物和两条下游引物组合，max酶(vazyme公司货号：p505)进行pcr，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳以筛选好的扩增引物，结果如图10，组1：scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r639；组2：scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r746；组3：scn1a-e22g-f-69/scn1a-e22g-r639；组4：scn1a-e22g-f-69/scn1a-e22g-r746，优选scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r746引物对进行目的片段扩增。

3.2.418只猪scn1a基因片段pcr扩增

分别以18个基因组模板(雄性a、b、c、d、e、f、g、h雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，引物scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r746，max酶进行scn1a基因组片段的扩增，产物(773bp)进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图11。

3.2.5scn1a基因序列保守性分析

以上pcr扩增产物，使用扩增引物进行测序(通用生物公司测序)，将测序结果与公共数据库中的scn1a基因序列进行比对分析。根据比对结果，扩增片段序列相对保守，所设计的引物本身无可能的突变位点。

3.3靶点grna设计及构建

3.3.1使用benchling进行靶点grna设计

设计靶点已避开可能的突变位点，使用benchling进行靶点grna设计：

https://benchling.com/

scn1a基因敲除靶点设计如下：

scn1a-e22-g1：cagttgtggtgttaacacag(seqidno.21)

scn1a-e22-g2：aaagaaatgagactgcccga(seqidno.22)

scn1a-e22-g3：aaagtaaactttgataatgt(seqidno.23)

scn1a-e22-g4：gtcaaacatgtcaccagttg(seqidno.24)

scn1a-e22-g5：catttctttctattagtatt(seqidno.25)

合成的scn1a基因共4个靶点的插入序列互补dnaoligo如下：

scn1a-e22-g1s：caccgcagttgtggtgttaacacag(seqidno.26)

scn1a-e22-g1a：aaacctgtgttaacaccacaactgc(seqidno.27)

scn1a-e22-g2s：caccgaaagaaatgagactgcccga(seqidno.28)

scn1a-e22-g2a：aaactcgggcagtctcatttctttc(seqidno.29)

scn1a-e22-g3s：caccgaaagtaaactttgataatgt(seqidno.30)

scn1a-e22-g3a：aaacacattatcaaagtttactttc(seqidno.31)

scn1a-e22-g4s：caccgtcaaacatgtcaccagttg(seqidno.32)

scn1a-e22-g4a：aaaccaactggtgacatgtttgac(seqidno.33)

scn1a-e22-g5s：caccgcatttctttctattagtatt(seqidno.34)

scn1a-e22-g5a：aaacaatactaatagaaagaaatgc(seqidno.35)

scn1a-e22-g1s、scn1a-e22-g1a、scn1a-e22-g2s、scn1a-e22-g2a、scn1a-e22-g3s、scn1a-e22-g3a、scn1a-e22-g4s、scn1a-e22-g4a、scn1a-e22-g5s、scn1a-e22-g5a均为单链dna分子。

3.3.2将grna序列克隆到pkg-u6grna骨架载体上的方法

同实施例2中2.1.3。

3.3.3grna载体构建

1)将合成的scn1a-e22-g1s和scn1a-e22-g1a混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链dna分子。将具有粘性末端的双链dna分子和载体骨架连接，得到质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g1)。质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g1)将会表达seqidno.36所示的scn1a-e22-grna1。

seqidno.36：

caguugugguguuaacacagguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

2)将合成的scn1a-e22-g2s和scn1a-e22-g2a混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链dna分子。将具有粘性末端的双链dna分子和载体骨架连接，得到质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g2)。质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g2)将会表达seqidno.37所示的scn1a-e22-grna2。

seqidno.37：

aaagaaaugagacugcccgaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

3)将合成的scn1a-e22-g3s和scn1a-e22-g3a混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链dna分子。将具有粘性末端的双链dna分子和载体骨架连接，得到质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g3)。质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g3)将会表达seqidno.38所示的scn1a-e22-grna3。

seqidno.38：

aaaguaaacuuugauaauguguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

4)将合成的scn1a-e22-g4s和scn1a-e22-g4a混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链dna分子。将具有粘性末端的双链dna分子和载体骨架连接，得到质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g4)。质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g4)将会表达seqidno.39所示的scn1a-e22-grna4。

seqidno.39：

gucaaacaugucaccaguugguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

5)将合成的scn1a-e22-g5s和scn1a-e22-g5a混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链dna分子。将具有粘性末端的双链dna分子和载体骨架连接，得到质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g5)。质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g5)将会表达seqidno.40所示的scn1a-e22-grna5。

seqidno.40：

cauuucuuucuauuaguauuguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

3.3.3grna载体鉴定

从lb平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的lb培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认pkg-u6grna(scn1a-e22-g1)、pkg-u6grna(scn1a-e22-g2)、pkg-u6grna(scn1a-e22-g3)、pkg-u6grna(scn1a-e22-g4)、pkg-u6grna(scn1a-e22-g5)载体均构建成功。

实施例4scn1a基因不同靶点grna的编辑效率比较

4.1猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

4.2使用构建好的grna质粒、cas9质粒(pkg-ge3)共转染猪原代成纤维细胞

4.2.1共转染分组情况

第一组：将质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g1)、质粒pkg-ge3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g1)：1.08μg质粒pkg-ge3，其中pkg-u6grna(scn1a-e22-g1)与pkg-ge3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g2)、质粒pkg-ge3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g2)：1.08μg质粒pkg-ge3，其中pkg-u6grna(scn1a-e22-g2)与pkg-ge3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g3)、质粒pkg-ge3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g3)：1.08μg质粒pkg-ge3，其中pkg-u6grna(scn1a-e22-g3)与pkg-ge3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g4)、质粒pkg-ge3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g4)：1.08μg质粒pkg-ge3，其中pkg-u6grna(scn1a-e22-g4)与pkg-ge3摩尔比为3:1。

第五组：将质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g5)、质粒pkg-ge3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pkg-u6grna(scn1a-e22-g5)：1.08μg质粒pkg-ge3，其中pkg-u6grna(scn1a-e22-g5)与pkg-ge3摩尔比为3:1。

第六组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。

4.2.2共转染操作方法

同实施例2中2.3.2。

4.3scn1a基因不同靶点grna的编辑效率分析

4.3.1分别向步骤4.2中收集在1.5ml离心管中的5组细胞加入10μlkapa2g裂解液裂解细胞提取细胞基因组dna。

kapa2g裂解液配制体系如下：

10xextractbuffer1μl

enzyme0.2μl

ddh2o8.8μl

75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组dna于-20℃保存；

4.3.2采用前述针对scn1a基因e22引物scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r746进行检测突变，pcr目的产物长度为773bp；

4.3.3使用常规pcr反应扩增scn1a靶点基因；

4.3.4将pcr反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图12，将目的产物及其附近产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版synthegoice工具分析测序峰图得出scn1a-e22-g1、scn1a-e22-g2、scn1a-e22-g3、scn1a-e22-g4、scn1a-e22-g5不同靶点的编辑效率依次为32％、15％、0、12％、0。结果表明，scn1a-e22-g1编辑效率最高，为最优靶点。

实施例5构建scn1a基因敲除的从江香猪单细胞克隆株

5.1猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

5.2使用构建好的pkg-u6grna(scn1a-e22-g1)质粒、pkg-ge3质粒共转染猪原代成纤维细胞

同实施例2中2.3.2，但不使用0.25％(gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5ml离心管中。

5.3scn1a基因敲除单细胞克隆株的筛选

5.3.1将步骤5.2所得电转48h的群体细胞，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用200μl完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单克隆转移到100μl完全培养基的96孔板中；

5.3.237℃，5％co2、5％o2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单细胞克隆的孔；

5.3.3待96孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3的细胞收集在1.5ml离心管中；

5.3.4待6孔板长至80％汇合度时使用0.25％(gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％dmso，体积比)将细胞冻存。

5.4scn1a基因敲除的重组细胞鉴定

5.4.1将步骤5.3收集在1.5ml离心管中得到的细胞，然后在细胞中加入10μlkapa2g裂解液裂解细胞提取细胞基因组dna。

kapa2g裂解液配制体系如下：

10xextractbuffer1μl

enzyme0.2μl

ddh2o8.8μl

75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后基因组dna于-20℃保存；

5.4.2采用前述针对scn1a基因e22引物scn1a-e22g-f-27/scn1a-e22g-r746进行检测突变，pcr目的产物长度为773bp；

5.4.3使用pcr常规反应扩增scn1a靶点基因；

5.4.4将pcr反应产物进行电泳，电泳结果如图13，泳道编号与单细胞克隆编号一致。回收pcr扩增产物并测序。

5.4.5将测序结果与scn1a靶点信息进行比对，从而判断该重组细胞是否为scn1a基因敲除。

编号为2、5、10、15、18的单细胞克隆的基因型为双等位相同变异的纯合突变型。编号为1、4、9、11的单细胞克隆的基因型为杂合突变型。编号为3、6、7、8、12、13、14、16、17、19、20的单细胞克隆的基因型为纯合野生型。得到scn1a基因编辑单细胞克隆的比率为45％。

示例性的测序比对结果如图14至图16，其中图14是克隆号为scn1a-2的反向测序与已公布序列的比对结果，判定为野生型；图15是克隆号为scn1a-5的反向测序与已公布序列的比对结果，判定为双等位相同变异的纯合突变型；图16是克隆号为scn1a-4的反向测序与已公布序列的比对结果，判定为杂合突变型。

通过具体序列的分析，scn1a各单细胞克隆基因型如表1：

表1scn1a基因敲除从江香猪单细胞克隆基因型鉴定

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>南京启真基因工程有限公司

<120>crispr系统及其在构建scn1a基因突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用

<160>40

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8484

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagag60

ataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtaga120

aagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcat180

atgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaagga240

cgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataag300

gctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttagagct360

agaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttttagcgcgtgcgccaattctgcagac420

aaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc480

ccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtc540

aatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgc600

caagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagt660

acatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctatta720

ccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccac780

ccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggg840

ggggggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatc900

agagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctata960

aaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgct1020

ccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtga1080

gcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggttta1140

agggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatca1200

ctttttttcaggttggaccggtgccaccatggactataaggaccacgacggagactacaa1260

ggatcatgatattgattacaaagacgatgacgataagatggccccaaagaagaagcggaa1320

ggtcggtatccacggagtcccagcagccgacaagaagtacagcatcggcctggacatcgg1380

caccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaatt1440

caaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgct1500

gttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagata1560

caccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaa1620

ggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaa1680

gcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagta1740

ccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcg1800

gctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgaggg1860

cgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagaccta1920

caaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcct1980

gtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcga2040

gaagaagaatggcctgttcggaaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaactt2100

caagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacga2160

cgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggc2220

cgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagat2280

caccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacct2340

gaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttctt2400

cgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagtt2460

ctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaa2520

gctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatccccca2580

ccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccatt2640

cctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgt2700

gggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaac2760

catcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcat2820

cgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacag2880

cctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccga2940

gggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgct3000

gttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaat3060

cgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctggg3120

cacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaa3180

cgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgat3240

cgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaa3300

gcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccggga3360

caagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaa3420

cttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagccca3480

ggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgc3540

cattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatggg3600

ccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaa3660

gggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctggg3720

cagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgta3780

cctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccg3840

gctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccat3900

cgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctc3960

cgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgat4020

tacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactgga4080

taaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggc4140

acagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccggga4200

agtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagtt4260

ttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgt4320

cgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcga4380

ctacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggc4440

taccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccct4500

ggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagat4560

cgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagt4620

gaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcc4680

caagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacgg4740

cggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaaggg4800

caagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaag4860

cagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaa4920

ggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagag4980

aatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaata5040

tgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataa5100

tgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagca5160

gatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtc5220

cgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacct5280

gtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcga5340

ccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcat5400

caccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgacaaaaggccggc5460

ggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagtaagaattcctagagctcgctga5520

tcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcct5580

tccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgca5640

tcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaag5700

ggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggagcggccgcaggaacccctagtg5760

atggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaag5820

gtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgc5880

ctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgc5940

atacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtgg6000

tggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccttagcgcccgctcctttcgctt6060

tcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggc6120

tccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgg6180

gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttgg6240

agtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaactctatct6300

cgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggtctattggttaaaaaatg6360

agctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttat6420

ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgc6480

caacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaag6540

ctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcg6600

cgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatgg6660

tttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttat6720

ttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttc6780

aataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccct6840

tttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaag6900

atgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggta6960

agatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttc7020

tgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgca7080

tacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacgg7140

atggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcgg7200

ccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaaca7260

tgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaa7320

acgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaa7380

ctggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggata7440

aagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaat7500

ctggagccggtgagcgtggaagccgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagc7560

cctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaata7620

gacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagttt7680

actcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtga7740

agatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgag7800

cgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaa7860

tctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaag7920

agctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactg7980

ttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacat8040

acctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtctta8100

ccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg8160

gttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagc8220

gtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaa8280

gcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatc8340

tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgt8400

caggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcct8460

tttgctggccttttgctcacatgt8484

<210>2

<211>10476

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagag60

ataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtaga120

aagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcat180

atgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaagga240

cgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataag300

gctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttctagcgcgtgc360

gccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcc420

cgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaataggga480

ctttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatc540

aagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcct600

ggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtat660

tagtcatcgctattaccatgggggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttgg720

ggggaggggtcggcaattgatccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaa780

gtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtg840

cagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggttggac900

cggtgccaccatggactataaggaccacgacggagactacaaggatcatgatattgatta960

caaagacgatgacgataagatggcccccaaaaagaaacgaaaggtgggtgggtccccaaa1020

gaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccgacaagaagtacagcatcgg1080

cctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcc1140

cagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgat1200

cggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgc1260

cagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaa1320

cgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtgga1380

agaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggccta1440

ccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaa1500

ggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccactt1560

cctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagct1620

ggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgc1680

caaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgccca1740

gctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctgattgccctgagcctgggcct1800

gacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaa1860

ggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccga1920

cctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagt1980

gaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagca2040

ccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaa2100

agagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccag2160

ccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgagga2220

actgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacgg2280

cagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaaga2340

tttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcat2400

cccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaa2460

gagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgc2520

ccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgct2580

gcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaa2640

atacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccat2700

cgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggacta2760

cttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaa2820

cgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctgga2880

caatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgagga2940

cagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgat3000

gaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaa3060

cggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggctt3120

cgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacat3180

ccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggc3240

cggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgt3300

gaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaacca3360

gaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcat3420

caaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaa3480

cgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaact3540

ggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaa3600

ggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcga3660

caacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaa3720

cgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcct3780

gagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcac3840

aaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaa3900

gctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaa3960

ggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgccta4020

cctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagtt4080

cgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcagga4140

aatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagac4200

cgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcga4260

aaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgag4320

catgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaaga4380

gtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccc4440

taagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaa4500

agtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccat4560

catggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaa4620

agaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaa4680

cggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccct4740

gccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctc4800

ccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacga4860

gatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctgga4920

caaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaa4980

tatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttga5040

caccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgat5100

ccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcga5160

caaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagggcggctccaa5220

gcggcctgccgcgacgaagaaagcgggacaggccaagaaaaagaaaggatccggcgcaac5280

aaacttctctctgctgaaacaagccggagatgtcgaagagaatcctggaccggtgagcaa5340

gggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaa5400

cggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgac5460

cctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccac5520

cctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgactt5580

cttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacga5640

cggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcat5700

cgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagta5760

caactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggt5820

gaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactacca5880

gcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcac5940

ccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagtt6000

cgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagggctccggcgaggg6060

caggggaagtcttctaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggcccaaccgagtacaa6120

gcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgc6180

cgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcg6240

ggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtg6300

ggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcggg6360

ggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgc6420

gcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcct6480

ggccaccgtcggagtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgct6540

ccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgcc6600

ccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcc6660

cgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaacgcgttaagtcga6720

caatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgc6780

tccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccg6840

tatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagtt6900

gtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccac6960

tggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccc7020

tattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggct7080

gttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgct7140

cgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccct7200

caatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtct7260

tcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcgtcgacttta7320

agaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggggga7380

ctggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtct7440

ctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgctt7500

aagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgac7560

tctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagggcc7620

cgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttg7680

cccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaata7740

aaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggt7800

ggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggt7860

gggctctatggcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggt7920

atttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcg7980

cggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccttagcgcccg8040

ctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctc8100

taaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaa8160

aacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc8220

ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacac8280

tcaactctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggtctatt8340

ggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgt8400

ttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagc8460

cccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccg8520

cttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcat8580

caccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtca8640

tgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaaccc8700

ctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccct8760

gataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcg8820

cccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctgg8880

tgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatc8940

tcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagca9000

cttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaac9060

tcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaa9120

agcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtg9180

ataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctt9240

ttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatg9300

aagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgc9360

gcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactgga9420

tggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggttta9480

ttgctgataaatctggagccggtgagcgtggaagccgcggtatcattgcagcactggggc9540

cagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatgg9600

atgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgt9660

cagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaa9720

ggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagtttt9780

cgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatccttttt9840

ttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtt9900

tgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga9960

taccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtag10020

caccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgata10080

agtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgg10140

gctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactga10200

gatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggaca10260

ggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaa10320

acgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttt10380

tgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttac10440

ggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgt10476

<210>3

<211>3120

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggttt60

cttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttt120

tctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaat180

aatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctttt240

ttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatg300

ctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaaga360

tccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgc420

tatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatac480

actattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatg540

gcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggcca600

acttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgg660

gggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacg720

acgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactg780

gcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaag840

ttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctg900

gagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccct960

cccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagac1020

agatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttact1080

catatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaaga1140

tcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgt1200

cagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatct1260

gctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagc1320

taccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttc1380

ttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc1440

tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccg1500

ggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggtt1560

cgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtg1620

agctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcg1680

gcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatcttt1740

atagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcag1800

gggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcctttt1860

gctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgta1920

ttaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagt1980

cagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggc2040

cgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgca2100

acgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttc2160

cggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatg2220

accatgattacgccaagcttgcatgcaggcctctgcagtcgacgggcccgggatccgatg2280

ataaacatgtgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggc2340

tgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatac2400

gtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaat2460

ggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatctt2520

gtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaag2580

ttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttc2640

tagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccatagatctagatgca2700

ttcgcgaggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaa2760

accctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgta2820

atagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaat2880

ggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggt2940

gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaa3000

cacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctg3060

tgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcga3120

<210>4

<211>175

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaa60

gttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttt120

ctagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccgttacataa175

<210>5

<211>554

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tctgcagacaaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctg60

gctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttcc120

attgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgt180

atcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcatt240

gtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtca300

tcgctattaccatgggggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggag360

gggtcggcaattgatccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatg420

tcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtag480

tcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggttggaccggtgc540

caccatggactata554

<210>6

<211>447

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ccagaacacaggttggaccggtgccaccatggactataaggaccacgacggagactacaa60

ggatcatgatattgattacaaagacgatgacgataagatggcccccaaaaagaaacgaaa120

ggtgggtgggtccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccga180

caagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcac240

cgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacag300

catcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccac360

ccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatct420

gcaagagatcttcagcaacgagatggc447

<210>7

<211>2727

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagggcggctccaagcggcctg60

ccgcgacgaagaaagcgggacaggccaagaaaaagaaaggatccggcgcaacaaacttct120

ctctgctgaaacaagccggagatgtcgaagagaatcctggaccggtgagcaagggcgagg180

agctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccaca240

agttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagt300

tcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacct360

acggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagt420

ccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaact480

acaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctga540

agggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactaca600

acagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttca660

agatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaaca720

cccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccg780

ccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccg840

ccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagggctccggcgagggcaggggaa900

gtcttctaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggcccaaccgagtacaagcccacgg960

tgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcg1020

ccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccg1080

agctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcgg1140

acgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgt1200

tcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaac1260

agatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccg1320

tcggagtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggag1380

tggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacc1440

tccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggac1500

cgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaacgcgttaagtcgacaatcaac1560

ctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctcctttta1620

cgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctt1680

tcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccg1740

ttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggg1800

gcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgcca1860

cggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggca1920

ctgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtg1980

ttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccag2040

cggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttc2100

gccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcgtcgactttaagaccaat2160

gacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagg2220

gctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggtt2280

agaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctca2340

ataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaa2400

ctagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagggcccgtttaaa2460

cccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctccc2520

ccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgagg2580

aaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcagg2640

acagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctcta2700

tggcctgcaggggcgcctgatgcggta2727

<210>8

<211>410

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gataaacatgtgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaagg60

ctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaata120

cgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaa180

tggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatct240

tgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaa300

gttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttt360

ctagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccatag410

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

agttatggcagaactcagtg20

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

caccgagttatggcagaactcagtg25

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

aaaccactgagttctgccataactc25

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ccccatccaaagtttttaaagga23

<210>13

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tgtggcagatgtcacagtttagg23

<210>14

<211>100

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

aguuauggcagaacucagugguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60

cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu100

<210>15

<211>2009

<212>prt

<213>猪(sus scrofa)

<400>15

metgluglnthrvalleuvalproproglyproaspserpheasnphe

151015

phethrarggluserleualaalailegluargargilealagluglu

202530

lysalalysasnprolysproasplyslysaspaspaspgluhisgly

354045

prolysproasnseraspleuglualaglylysasnleupropheile

505560

tyrglyaspileproproglumetvalsergluproleugluaspleu

65707580

aspprotyrtyrileasnlyslysthrpheilevalleuasnlysgly

859095

lysalailepheargpheseralathrseralaleutyrileleuthr

100105110

propheasnproleuarglysilealailelysileleuvalhisser

115120125

leuphesermetleuilemetcysthrileleuthrasncysvalphe

130135140

metthrmetserasnproproasptrpthrlysasnvalglutyrthr

145150155160

phethrglyiletyrthrphegluserleuilelysileilealaarg

165170175

glyphecysleugluaspphethrpheleuargaspprotrpasntrp

180185190

leuaspphethrvalilethrphealatyrvalthrgluphevalasp

195200205

leuglyasnvalseralaleuargthrpheargvalleuargalaleu

210215220

lysthrileservalileproglyleulysthrilevalglyalaleu

225230235240

ileglnservallyslysleuseraspvalmetileleuthrvalphe

245250255

cysleuservalphealaleuileglyleuglnleuphemetglyasn

260265270

leuargasnlyscysvalglntrpproprothrasnalaserleuglu

275280285

gluhisserileglulysasnvalthrargasptyrasnglythrleu

290295300

valasngluthrserthrglupheasptrplyssertyrileglnasp

305310315320

serargtyrhistyrpheleugluglypheproaspalaleuleucys

325330335

glyasnserseraspalaglyglncysprogluglytyrmetcysval

340345350

lysalaglyargasnproasntyrglytyrthrserpheaspthrphe

355360365

sertrpalapheleuserleupheargleumetthrglnaspphetrp

370375380

gluasnleutyrglnleuthrleuargalaalaglylysthrtyrmet

385390395400

ilephephevalleuvalilepheleuglyserphetyrleuileasn

405410415

leuileleualavalvalalametalatyrglugluglnasnglnala

420425430

thrleugluglualagluglnlysglualaglupheglnglnmetleu

435440445

gluglnleulyslysglnglnglualaalaglnglnalaalaalaval

450455460

thralasergluhisserarggluproseralaalaglyglyleuser

465470475480

aspsersersergluthrserlysleuserserlysseralalysglu

485490495

argargasnargarglyslysarglysglnlysgluglnserglygly

500505510

gluglulysaspaspaspaspphehislysserglusergluaspser

515520525

ileargarglysglypheargpheserilegluglyasnargleuthr

530535540

tyrglulysargtyrserserprohisglnserleuleuserilearg

545550555560

glyserleupheserproargargasnserargthrserleupheser

565570575

pheargglyargalalysaspvalglysergluasnaspphealaasp

580585590

aspgluhisserthrphegluaspasngluserargargaspserleu

595600605

phevalproargarghisglygluargargasnserasnleusergln

610615620

thrserargserserargmetleualavalpheproalaasnglylys

625630635640

methisserthrvalaspcysasnglyvalvalserleuvalglygly

645650655

proservalprothrserprovalglyglnleuleuprogluvalile

660665670

ileasplysproalathraspaspasnglythrthrthrgluthrasp

675680685

metarglysargargserserserphehisvalsermetasppheleu

690695700

gluaspproserglnargglnargalametserilealaserileleu

705710715720

thrasnthrvalglugluleuglugluserargglnlyscyspropro

725730735

cystrptyrlyspheserasnilepheleuiletrpaspcysserpro

740745750

tyrtrpleulysvallyshisilevalasnleuvalvalmetasppro

755760765

phevalaspleualailethrilecysilevalleuasnthrleuphe

770775780

metalametgluhistyrprometthrasphispheasnasnvalleu

785790795800

thrvalglyasnleuvalphethrglyilephethralaglumetphe

805810815

leulysileilealametaspprotyrtyrtyrpheglngluglytrp

820825830

asnilepheaspglypheilevalthrleuserleuvalgluleugly

835840845

leualaasnvalgluglyleuservalleuargserpheargleuleu

850855860

argvalphelysleualalyssertrpprothrleuasnmetleuile

865870875880

lysileileglyasnservalglyalaleuglyasnleuthrleuval

885890895

leualaileilevalpheilephealavalvalglymetglnleuphe

900905910

glylyssertyrlysaspcysvalcyslysileasnserglucyslys

915920925

leuproargtrphismetasnaspphephehisserpheleuileval

930935940

pheargvalleucysglyglutrpilegluthrmettrpaspcysmet

945950955960

gluvalalaglyglnalametcysleuthrvalphemetmetvalmet

965970975

valileglyasnleuvalvalleuasnleupheleualaleuleuleu

980985990

serserpheseralaaspasnleualaalathraspaspaspasnglu

99510001005

metasnasnleuglnilealavalaspargmethislysglyileala

101010151020

tyrvallysarglysiletyrglupheileglnglnserphevalarg

1025103010351040

lysglnlysileleuaspgluilelysproleuaspaspleuasnasn

104510501055

arglysaspcyscysmetserasnhisthrglygluthrglylysasp

106010651070

leuasptyrleulysaspvalasnglythrthrserglyileglythr

107510801085

glyserservalglulystyrileileaspgluserasptyrmetser

109010951100

pheileasnasnproserleuthrvalthrvalproilealavalgly

1105111011151120

gluseraspphegluasnleuasnthrgluaspphesersergluser

112511301135

aspleuglugluserlysglulysleuasngluserserserserser

114011451150

gluglyserthrvalaspileglyalaproalaglugluglnproval

115511601165

valgluproglugluthrleugluproglualacysphethrglugly

117011751180

cysvalglnargphelyscyscysglnileservalglugluglyarg

1185119011951200

glylysglntrptrpasnleuargargthrcyspheargilevalglu

120512101215

hisasntrpphegluthrpheilevalphemetileleuleuserser

122012251230

glyalaleualaphegluaspiletyrileaspglnarglysthrile

123512401245

lysthrmetleuglutyralaasplysvalphethrtyrilepheile

125012551260

leuglumetleuleulystrpvalalatyrglytyrglnthrtyrphe

1265127012751280

thrasnalatrpcystrpleuasppheleuilevalaspvalserleu

128512901295

valserleuthralaasnalaleuglytyrsergluleuglyalaile

130013051310

lysserleuargthrleuargalaleuargproleuargalaleuser

131513201325

argphegluglymetargvalvalvalasnalaleuleuglyalaile

133013351340

proserilemetasnvalleuleuvalcysleuilephetrpleuile

1345135013551360

pheserilemetglyvalasnleuphealaglylysphetyrhiscys

136513701375

valasnthrthrthrglyaspmetpheaspilesergluvalasnasn

138013851390

hisseraspcysleuileleuilegluargasngluthralaargtrp

139514001405

lysasnvallysvalasnpheaspasnvalglypheglytyrleuser

141014151420

leuleuglnvalalathrphelysglytrpmetaspilemettyrala

1425143014351440

alavalaspserargasnvalgluleuglnprolystyrglugluser

144514501455

leutyrmettyrleutyrphevalilepheileilepheglyserphe

146014651470

phethrleuasnleupheileglyvalileileaspasnpheasngln

147514801485

glnlyslyslyspheglyglyglnaspilephemetthrgluglugln

149014951500

lyslystyrtyrasnalametlyslysleuglyserlyslysprogln

1505151015151520

lysproileproargproglyasnlyspheglnglymetvalpheasp

152515301535

phevalthrargglnvalpheaspileserilemetileleuilecys

154015451550

leuasnmetvalthrmetmetvalgluthraspaspglnserasptyr

155515601565

valthrasnileleuserargileasnleuvalpheilevalleuphe

157015751580

thrglyglucysvalleulysleuileserleuarghistyrtyrphe

1585159015951600

thrileglytrpasnilepheaspphevalvalvalileleuserile

160516101615

valglymetpheleualagluleuileglulystyrphevalserpro

162016251630

thrleupheargvalileargleualaargileglyargileleuarg

163516401645

leuilelysglyalalysglyileargthrleuleuphealaleumet

165016551660

metserleuproalaleupheasnileglyleuleuleupheleuval

1665167016751680

metpheiletyralailepheglymetserasnphealatyrvallys

168516901695

arggluvalglyileaspaspmetpheasnphegluthrpheglyasn

170017051710

sermetilecysleupheglnilethrthrseralaglytrpaspgly

171517201725

leuleualaproileleuasnserlysproproaspcysaspproasn

173017351740

lysvalasnproglyserservallysglyaspcysglyasnproser

1745175017551760

valglyilephephephevalsertyrileileileserpheleuval

176517701775

valvalasnmettyrilealavalileleugluasnpheservalala

178017851790

thrglugluseralagluproleusergluaspasppheglumetphe

179518001805

tyrgluvaltrpglulyspheaspproaspalathrglnphemetglu

181018151820

pheglulysleuserglnphealaalaalaleugluproproleuasn

1825183018351840

leuproglnproasnlysleuglnleuilealametaspleupromet

184518501855

valserglyaspargilehiscysleuaspileleuphealaphethr

186018651870

lysargvalleuglygluserglyglumetaspalaleuargilegln

187518801885

metglugluargphemetalaserasnproserlysvalsertyrgln

189018951900

proilethrthrthrleulysarglysglnglugluvalseralaval

1905191019151920

ileileglnargalatyrargarghisleuleulysargthrvallys

192519301935

glnalaserphethrtyrasnlysasnlysilelysglyglyalaasn

194019451950

leuleuvallysgluaspmetileileaspargileasngluasnser

195519601965

metthrglulysthraspleuthrmetserthralaalacyspropro

197019751980

sertyraspargvalthrlysproilevalglulyshisgluglnglu

1985199019952000

glylysaspglulysalalysglylys

2005

<210>16

<211>1600

<212>dna

<213>猪(sus scrofa)

<400>16

taaactcagtaaatgaaacaactgatatgactggagcttgaaataaacgatgtgatgatc60

taatgaaatacataatgctaaattgtcttgcttcttatgcaaaaatgattattagtcata120

gcaatgcatgaataattaaggacaaaactatattaggtatttaataatatttctatattt180

atacacctgaatttttagtttattaaaatatattggtcaaaccaactcttgtcccaatat240

tttagtttcattctttaatatattgccttttttaatgagttaatcttctgttaggatttc300

ttacttatctttttctaataaacaagtttcctgacttcaatctggcagcaaattcctctg360

attttgtttttcctttagccttttatacttcctcttctcttttttcaaacttttttatcg420

ttgttatattatttatatttatttccctaaatgtattgcttaagaaagaatatatttcat480

tttatgacttttttactttgcttttaaatatcctagaatagtcttgatagtaaaaaagaa540

aaaattagaaagactgaagactactaggggaatgtctttttttttttcttttaatcaata600

agaattctgacttttctttttttccatttgtgtattaggtggttgtgaatgcccttttag660

gagcaattccatccatcatgaatgtgctcctggtttgtcttatattctggctaattttca720

gcatcatgggcgtaaatttgtttgctggcaaattctaccactgtgttaacaccacaactg780

gtgacatgtttgacatcagcgaagtgaataatcattctgattgcctaatactaatagaaa840

gaaatgagactgcccgatggaaaaatgtgaaagtaaactttgataatgtaggatttgggt900

atctctctttgcttcaagttgtaagtgaatactcttttctctgaaatgtgtttattgttt960

ggaatgataacaaagtaatgacatgtagctatgatttagttaccaagaagaaagtttata1020

atatatttccttttttcaaattttgatttattagtacaagtttatgagcccagatgggtg1080

aaacaaacgtatatttaagcagtgcagatgtagtcaatagtggccaggtattttagttcg1140

ttccaaagatcttctctttcttctcatattattctctcttcccatatgaacaagtagatt1200

aataaattaataaatgtattatttttcctattgcaattggaaagcttgtttcactgaggg1260

atcacactcccaccccctgctcaaaacacaactgcttagcacacctggttggattataac1320

taattggtagacattaactgctactaaattgtatcatttggactgaagcttggggaatga1380

tatgtaggctttaagattagatcctcatagtgaaatggaataataccagttaacacctag1440

acacggaaatgaaacacaagtagctgttgtccccaaatgacctttcagtacaattactta1500

agtcttttttcccccctatatattaatgttttcactactgggtctctaagactgatttac1560

gcaaaagaaaaagttcataatttatgaaaatacaaaagat1600

<210>17

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

gaaagactgaagactactagggg23

<210>18

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

ttattaatttattaatctacttg23

<210>19

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

aaatatcctagaatagtcttgat23

<210>20

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

gttataatccaaccaggtgtgct23

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

cagttgtggtgttaacacag20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

aaagaaatgagactgcccga20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

aaagtaaactttgataatgt20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

gtcaaacatgtcaccagttg20

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

catttctttctattagtatt20

<210>26

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

caccgcagttgtggtgttaacacag25

<210>27

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>27

aaacctgtgttaacaccacaactgc25

<210>28

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>28

caccgaaagaaatgagactgcccga25

<210>29

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>29

aaactcgggcagtctcatttctttc25

<210>30

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>30

caccgaaagtaaactttgataatgt25

<210>31

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>31

aaacacattatcaaagtttactttc25

<210>32

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>32

caccgtcaaacatgtcaccagttg24

<210>33

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>33

aaaccaactggtgacatgtttgac24

<210>34

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>34

caccgcatttctttctattagtatt25

<210>35

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>35

aaacaatactaatagaaagaaatgc25

<210>36

<211>100

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>36

caguugugguguuaacacagguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60

cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu100

<210>37

<211>100

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>37

aaagaaaugagacugcccgaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60

cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu100

<210>38

<211>100

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>38

aaaguaaacuuugauaauguguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60

cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu100

<210>39

<211>100

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>39

gucaaacaugucaccaguugguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60

cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu100

<210>40

<211>100

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>40

cauuucuuucuauuaguauuguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60

cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu100