一种新型冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及其制备方法和用途

1.本发明属于有机合成药物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒 主蛋白酶的抑制剂及其制备方法和制药用途。


背景技术：

2.由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(sars-cov-2，又称新型 冠状病毒)引起的冠状病毒肺炎(covid-19，又称新型冠状病毒肺 炎)，临床上已经使用了α-干扰素和抗hiv药物洛匹那韦/利托那韦 的组合，但疗效仍然非常有限，并且可能会有毒副作用。 吉列德科学公司(gilead sciences，inc.)开发的广谱抗病毒药物瑞德 西韦也在探索治疗covid-19，但需要更多的数据来证明其疗效。因 此，当前仍旧迫切需要开发安全有效的抗sars-cov-2药物。
3.冠状病毒的基因组rna长约30knt，具有5
′
帽结构和3
′‑
poly-a 尾，至少含有6个开放阅读框(orf)。第一个orf(orf1a/b)约 占基因组长度的三分之二，直接翻译两种多蛋白：pp1a和pp1ab， orf1a和orf1b之间存在a-1移码。这些多蛋白由一种主蛋白酶(简 称m
pro
；也被称为3c样蛋白酶(3cl
pro
))和一个或两个木瓜蛋白酶 样蛋白酶(plps)加工而成，转化为16种非结构蛋白。这些非结构 蛋白参与亚基因组rna的生产，编码四种主要结构蛋白(包膜(e)、 膜(m)、棘突(s)和核衣壳(n)蛋白质)和其他辅助蛋白质，以 完成病毒的复制和侵入过程。
4.m
pro
将重叠的pp1a和pp1ab多聚蛋白水解裂解为功能蛋白，这 是病毒复制过程中的关键步骤。对于rdrp或nsp13等病毒复制必需 的酶，如果没有事先的蛋白水解释放，就不能完全发挥作用完成复制。 因此，抑制病毒的m
pro
可以阻止传染性病毒颗粒的产生，从而减轻疾 病症状。
5.m
pro
在冠状病毒中是保守的，并且不同冠状病毒中m
pro
的底物具 有一些共同的特征：从n端到c端的氨基酸以配对的形式进行编号 (-p4-p3-p2-p1
↓
p1
′‑
p2
′‑
p3
′
)，裂解位点在p1和p1
′
之间。特别地， m
pro
在p1位点(leu-gln
↓
(ser，ala，gly))对谷氨酰胺有独特的底 物偏好，这一点在宿主蛋白酶中是不存在的，这表明通过靶向病毒 m
pro
实现高选择性是可行的。因此，病毒对这种蛋白酶的正确功能的 绝对依赖性，加上缺乏同源的人类蛋白酶，使得m
pro
成为理想的抗病 毒靶点。
6.因此，亟需研究出一种能够有效抑制sars-cov-2病毒的m
pro
活性的药物。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供新型冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及其制备 方法和制药用途。
8.本发明提供了式i所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其立 体异构体、或其旋光异构体、或其同位素替代形式：
[0009][0010]
其中，x为o或s；
[0011]
a环选自未取代或被一个或多个r6取代的以下基团：5～6元饱 和杂环基、5～6元不饱和杂环基、饱和杂稠环基、不饱和杂稠环基； r6各自独立的选自c
1～6
烷基、c
1～6
烷氧基、卤素、羟基、氰基、氨基、 羧基；
[0012]
r3为l3m0l4r
3a
；其中l3选自无、c
1～4
亚烷基、卤代c
1～4
亚烷基、 c
2～4
亚烯基、卤代c
2～4
亚烯基，l4选自无、c
1～4
亚烷基、卤代c
1～4
亚 烷基，m0选自无、o、s、nh、co、conh、nhco，r
3a
为未取代 或被一个或多个r
3b
取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、 不饱和杂稠环基、不饱和稠环烷基；r
3b
各自独立的选自被r
3c
取代或 未取代的c
1～5
烷基、被r
3c
取代或未取代的c
1～5
烷氧基、卤素、被 r
3c
取代或未取代的苯基、nr
14r15
、被r
3c
取代或未取代的萘基、羟 基；r
14
、r
15
各自独立的选自氢或c
1～5
烷基，r
3c
各自独立的选自卤 素、氘、氰基、羟基、氨基、羧基；
[0013]
r4选自未取代或被一个或多个取代基取代的以下基团：5～6元芳 基、5～6元杂芳基、c
1～5
烷基、coor
10
；所述取代基各自独立的选自 ＝o、羟基、硝基、氨基、羧基、卤素、c
1～5
烷基；r
10
为c
1～5
烷基；
[0014]
r5选自cor8或wcoor7；其中，r8选自氢或w 选自无、c
1～4
亚烷基、c
2～4
亚烯基、c
2～4
亚炔基，r7选自c
1～6
烷基； m选自无、co、nh、conh、nhco、coo或oco，l0选自无、 c
1～4
亚烷基、c
2～4
亚烯基，l1选自无、c
1～4
亚烷基、c
2～4
亚烯基，r
8a
选自c
1～5
烷基、卤代的c
1～5
烷基、3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂 环基、5～6元芳基或5～6元杂芳基。
[0015]
进一步地，所述化合物的结构如式ii、式iii或式iv所示：
[0016][0017]
其中，x为o或s；
[0018]
n选自0～3的整数，优选为0～2的整数；
[0019]
r1、r2各自独立的选自氢、c
1～5
烷基、c
1～5
烷氧基、卤素、羟基、 氰基、氨基、羧基；
[0020]
r3为l3m0l4r
3a
；其中l3选自无、c
1～4
亚烷基、卤代c
1～4
亚烷基、 c
2～3
亚烯基，l4选自无、c
1～4
亚烷基、卤代c
1～4
亚烷基，m0选自无、 o、s、nh、co、conh、nhco，r
3a
为未取代或被一个或多个r
3b
取代的以下基团：苯基、、
[0021]r3b
各自独立的选自c
1～4
烷基、卤素取代的c
1～4
烷基、氘代的c
1～4
烷 基、氰基取代的c
1～4
烷基、c
1～4
烷氧基、卤素取代的c
1～4
烷氧基、氘 代的c
1～4
烷氧基、氰基取代的c
1～4
烷氧基、卤素、苯基、卤代的苯基、nr
14r15
、羟基，r
14
、r
15
各自独立的选自氢或c
1～4
烷 基；
[0022]
r4选自未取代或被一个或多个取代基取代的以下基团：5～6元芳 基、5～6元杂芳基、c
1～5
烷基、coor
10
；所述取代基各自独立的选自 ＝o、羟基、硝基、氨基、羧基、卤素、c
1～5
烷基；r
10
为c
1～5
烷基；
[0023]
r8选自氢或m选自无、co、nh、conh、nhco、 coo或oco，l0选自无、c
1～3
亚烷基、c
2～4
亚烯基，l1选自无、c
1～3
亚烷基、c
2～4
亚烯基，r
8a
选自c
1～4
烷基、卤代的c
1～4
烷基、3～6元饱 和环烷基、3～6元饱和杂环基、5～6元芳基或5～6元杂芳基。
[0024]
进一步地，r1、r2各自独立的选自氢、c
1～4
烷基、c
1～4
烷氧基、 卤素、羟基；
[0025]
r3选自自l3m0l4r
3a
； l3选自无、c
1～3
亚烷基、卤代c
1～3
亚烷基、c
2～3
亚烯基，l4选自无、 c
1～3
亚烷基、卤代c
1～3
亚烷基、，m0选自无、o、nh、co、conh， r
3a
为苯基、被一个或多个r
3b
取代的苯基，r
3b
各自独立的选自c
1～4
烷基、卤素取代的c
1～4
烷基、氘代的c
1～4
烷基、氰基取代的c
1～4
烷 基、c
1～4
烷氧基、卤素取代的c
1～4
烷氧基、氘代的c
1～4
烷氧基、氰基 取代的c
1～4
烷氧基、卤素、苯基、卤代的苯基、nr
14r15
、羟基，r
14
、r
15
各自独立的选自氢或c
1～3
烷基；
[0026]
r4选自c
1～2
烷基、coor
10
、取 代或未取代的苯基；所述取代基选自羟基、硝基；r
a1
、r
a2
各自独立 的选自氢、c
1～3
烷基、卤素；r
10
为c
1～3
烷基；
[0027]
r8选自氢、conhr
11
、l2coor
12
、c
1～4
烷基、卤代的c
1～4
烷基； r
11
选自3～6元饱和环烷基、c
1～4
烷基、苄基、l2为c
1～2
亚烷基、c
2～3
亚烯基，r
12
为c
1～3
烷基。
[0028]
进一步地，所述式ii如式ii-1或式ii-2所示：
[0029][0030]
其中，x为o或s，优选为o；
[0031]
r1、r2各自独立的选自氢、c
1～3
烷基，优选为甲基；
[0032]
m选自0～3的整数，r
3b
各自独立的选自苯基、卤代的苯基、卤 素、c
1～3
烷基、卤代或氘代的c
1～3
烷基、c
1～3
烷氧基、卤代或氘代的 c
1～3
烷氧基、羟基；
[0033]ra1
、r
a2
各自独立的选自氢、c
1～3
烷基、卤素；
[0034]
rb选自氢、c
1～3
烷基、卤代的c
1～3
烷基；
[0035]
l3选自无、c
1～2
亚烷基、卤代c
1～2
亚烷基、c2亚烯基，l4选自 无、c
1～3
亚烷基、卤代c
1～3
亚烷基，m0选自无、o、nh、co、conh；
[0036]
所述卤素优选为氯、氟。
[0037]
进一步地，所述化合物的结构为以下结构之一：
[0038]
[0039]
[0040]
[0041]
[0042]
[0043][0044]
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物是以上述化合 物、或其药学上可接受的盐、或其立体异构体、或其旋光异构体、或 其同位素替代形式为活性成分，加上药学上可接受的辅料制成的制剂。
[0045]
本发明还提供了上述化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体 异构体、或其旋光异构体、或其同位素替代形式在制备冠状病毒蛋白 水解酶抑制剂中的用途；优选的，所述冠状病毒蛋白水解酶为冠状病 毒主蛋白酶；更优选的，所述冠状病毒蛋白水解酶为sars-cov-2m
pro
。
[0046]
本发明还提供了上述化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体 异构体、或其旋光异构体、或其同位素替代形式在制备抗冠状病毒的 药物中的用途，优选的，所述冠状病毒为新型冠状病毒sars-cov-2。
[0047]
本发明还提供了上述化合物、或其药学上可接受的盐、或其立体 异构体、或其旋
光异构体、或其同位素替代形式在制备预防和/或治 疗与sars-cov-2m
pro
相关的疾病的药物中的用途，优选的，所述与 sars-cov-2m
pro
相关的疾病为新型冠状病毒肺炎covid-19。
[0048]
进一步地，所述冠状病毒蛋白水解酶抑制剂、抗冠状病毒的药物 或预防和/或治疗病毒性肺炎的药物能够抑制sars-cov-2m
pro
的活 性和/或能够抑制sars-cov-2感染细胞。
[0049]
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者 术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文 没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术 人员能够给予它们的含义。
[0050]
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如， 前缀c
a～b
烷基表示任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。例如，c
1～6
烷基 是指包含1～6个碳原子的直链或支链的烷基。
[0051]
本文“取代”是指分子中的1个、2个或多个氢原子被其它不同 的原子或分子所替换，包括该分子中同位原子或异位原子上的1个、 2个或多个取代。
[0052]“同位素替代形式”指化合物中的一个或两个以上的原子被其对 应的同位素替换后得到的化合物，比如化合物中的氢被替换为氕、氘 或氚。
[0053]“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或 所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相 兼容，并在生理上与受体相兼容。
[0054]“盐”是将化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和/或碱形 成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐， 例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。 也可以是通过将化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当 (例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以 过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷 冻干燥制得。
[0055]“药学上可接受的盐”可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸 盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁 二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石 酸盐或三氟乙酸盐。
[0056]
卤素为氟、氯、溴或碘。
[0057]“芳基”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环(也就是 共享毗邻碳原子对的环)基团，例如苯基。所述芳基不含有杂原子， 如氮，氧，或硫，同时连接母体的点必须在具有共轭的π电子体系 的环上的碳原子上。芳基可以是取代的或未取代的。“5～6元芳基
”ꢀ
指环碳原子数为5或6的芳基。
[0058]“杂芳基”指包含一个到多个杂原子的杂芳族基团。这里所指的杂 原子包括氧、硫和氮。例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡唑基等。所 述杂芳基可以是任选取代的或未取代的。“5～6元杂芳基”指环原子 数为5或6的杂芳基。
[0059]“环烷基”指饱和或不饱和的环状烃取代基；环状烃可以是单环也 可以是多环。例如，“3～6元饱和环烷基”指环碳原子数为3～6的饱和 的环烷基。
[0060]“杂环基”指饱和或不饱和的环状烃取代基；环状烃可以是单环也 可以是多环，且携带至少一个环杂原子(包括但不限于o、s或n)。 例如，“3～6元饱和杂环基”指环原子数为3～6的饱和的杂环基。
[0061]“稠环烷基”指多环的环烷基，且该多环的环烷基中有两个环共用 两个相邻的碳
原子。
[0062]“杂稠环基”指多环的杂环基，其中至少含有1个杂原子，且该 多环的杂环基中有两个环共用两个相邻的碳原子或杂原子。
[0063]“亚烷基”指烷基失去一个原子后的基团。例如c1亚烷基： c2亚烷基：
[0064]“亚烯基”指烯基失去一个原子后的基团。例如c2烯基：
[0065][0066]“亚炔基”指炔基失去一个原子后的基团。例如c2炔基：
[0067][0068]
实验结果表明，本发明提供了一种能够有效抑制新型冠状病毒主 蛋白酶m
pro
活性的化合物，该化合物能够有效抑制sars-cov-2病 毒在细胞内的复制，抑制细胞中的sars-cov-2感染，抵抗转基因 小鼠的体内sars-cov-2感染；降低sars-cov-2感染的转基因小 鼠肺部的病毒载量，降低小鼠肺部趋化因子配体10(cxcl10)和β型 干扰素(ifn-β)的基因表达水平，降低小鼠肺部的中性粒细胞(neu) 和巨噬细胞(mac)的数量，改善小鼠肺部的病理损伤。同时，本 发明提供的化合物还具有良好的体内安全性和药代动力学性质。本发 明的化合物在制备sars-cov-2 m
pro
抑制剂，抗sars-cov-2的药物， 以及预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物中具有非常好的应用前 景。
[0069]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯 用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它 多种形式的修改、替换或变更。
[0070]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作 进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于 以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范 围。
附图说明
[0071]
图1为化合物26对sars-cov-2 m
pro
的抑制活性曲线。
[0072]
图2为化合物33对sars-cov-2 m
pro
的抑制活性曲线。
[0073]
图3为化合物37对sars-cov-2 m
pro
的抑制活性曲线。
[0074]
图4化合物对sars-cov-2在人肺泡上皮细胞中复制的抑制实验。
[0075]
图5 sars-cov-2感染小鼠的肺部病毒载量。
[0076]
图6 sars-cov-2感染小鼠的肺部病理组织切片(3dpi)。
[0077]
图7 sars-cov-2感染小鼠的肺部代表性细胞因子表达水平(3dpi)。
[0078]
图8 sars-cov-2感染小鼠的肺部中性粒细胞和巨噬细胞计数(3dpi)。
具体实施方式
[0079]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0080]
实施例1：化合物1的制备
[0081][0082]
按照上述制备路线制得本发明的化合物1，路线中各步骤的反应 条件如下：
[0083]
i、a，2-氟丙二酸二甲酯，苄醇，甲苯，对甲苯磺酸，110℃；b， 异丙醇，正己烷，-10℃；
[0084]
ii、异丙醇，氢氧化钠，水，45℃；
[0085]
iii、无水四氢呋喃，异丙基氯化镁四氢呋喃溶液，ar，0℃；
[0086]
iv、无水四氢呋喃，n,n'-羰基二咪唑，ar，0℃；
[0087]
v、乙酸乙酯，10％钯碳，氢气，室温；
[0088]
vi、二氯甲烷，盐酸二氧六环溶液；
[0089]
vii、二氯甲烷，n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟 磷酸脲，n,n-二异丙基乙胺，-20℃；
[0090]
viii、二氯甲烷，三氟乙酸；
[0091]
ix、二氯甲烷，n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟 磷酸脲，n,n-二异丙基乙胺，-20℃；
[0092]
以下为具体合成步骤：
[0093]
中间体2：2-氟丙二酸二苄酯的制备
[0094]
2-氟丙二酸二甲酯(10g，66.6mmol，1.0eq)和苄醇(35ml， 338.2mmol，5.0eq)用100ml甲苯溶解，加入1.15g对甲苯磺酸(6.7 mmol，0.1eq)，回流反应，tlc监控反应，约8小时后反应完毕。 冷却至室温，减压蒸去甲苯，加入15ml异丙醇，搅拌均匀，搅拌下 慢慢加入30ml正己烷，置于-10℃冷阱中继续搅拌2小时，析出大 量白色固体。抽滤，滤饼用10ml
×
2冷冻正己烷洗涤两次，滤饼30℃ 真空减压干燥得18.4g产品，收率91.4％。1h nmr(400mhz, dmso-d6)δ7.64
–
6.91(m,10h),6.00(d,j＝46.3hz,1h),5.30
–
5.20 (m,4h).
[0095]
中间体3：2-氟丙二酸单苄酯的制备
[0096]
2-氟丙二酸二苄酯(18.4g，60.9mmol，1.0eq)用100ml异丙 醇溶解，升温至45℃，氢氧化钠(2.55g，63.9mmol，1.05eq)溶 于60ml水后慢慢滴入，滴加时间＞1小时。滴加完毕后继续反应30 分钟，减压蒸去异丙醇，加入50ml水，用饱和碳酸氢钠溶液调节 ph值至9左右。水相用二氯甲烷20ml
×
2二氯甲烷萃取两次，用6 mol/l盐酸调节水相ph值至1-2，用40ml
×
3异丙醚萃取三次，合 并有机相，用30ml饱和盐水洗涤一次。有机相加入无水硫酸镁干燥， 过滤，浓缩得粘稠状残留物，加入60ml正己烷搅拌过夜，析出白色 固体，过滤，滤饼40℃真空减压干燥得6.5g产品，收率50.3％.1h nmr (400mhz,chloroform-d)δ7.41
–
7.32
(m,5h),5.87(s,2h),5.39(d,j ＝47.9hz,1h),5.31(s,1h).
[0097]
中间体4的制备
[0098]
2-氟丙二酸单苄酯溶于无水四氢呋喃(2ml/mmol)，氩气置换 保护，冷却至0℃，慢慢滴加异丙基氯化镁四氢呋喃溶液(2m四氢 呋喃溶液，2.0eq)，得白色悬浊液。0℃下继续搅拌1小时，产品悬 浊液直接用于下步反应。
[0099]
中间体6：1-苄基6-甲基(4s)-4-(((叔丁氧羰基)氨基)-2
‑ꢀ
氟-3-氧代己二酸酯的制备
[0100]
boc-l-天冬氨酸4-甲酯(2.2g，8.8mmol，1.0eq)溶于50ml 无水四氢呋喃，氩气置换保护，冷却至0℃，加入cdi(1.5g，9.3mmol， 1.05eq)，保温反应1小时。反应液冷却至-20℃，慢慢加入1.5eq 中间体4，保温反应1小时后升温至室温反应6小时。冰水浴下将反 应液慢慢倒入300ml 2m稀盐酸中，用100ml
×
3乙酸乙酯萃取三次， 合并有机相，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至弱碱性，再用50ml饱和盐 水洗涤一次后加入无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，所得粗品直接用于 下步反应。
[0101]
中间体7：(s)-3-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基-5-氟-4-氧戊酸 甲酯的制备
[0102]
上步所得中间体6粗品加入50ml乙酸乙酯，加入200mg 10％ 钯碳，氢气置换，氢气下室温反应过夜，过滤，浓缩，所得粗品用石 油醚：乙酸乙酯＝10：1流动相柱层析得1.5g无色油状物，收率65％。 1
h nmr(400mhz,chloroform-d)δ5.51(d,j＝8.0hz,1h),5.28
–ꢀ
5.06(m,2h),4.73
–
4.52(m,1h),3.70(s,3h),3.08(dd,j＝17.2,4.6hz, 1h),2.84(dd,j＝17.2,5.0hz,1h),1.46(s,9h).
[0103]
中间体8：(s)-3-氨基-5-氟-4-氧戊酸甲酯的制备
[0104]
500mg中间体7加入5ml二氯甲烷溶解，然后加入5ml盐酸 二氧六环，反应完全后旋干，得中间体8，收率为91.2％。1h nmr (400mhz,chloroform-d)δ5.25-5.10(m,2h),4.53(dd,j＝8.7,1.0hz, 2h),4.44(d,j＝7.9hz,1h),3.69(s,3h),2.83
–
2.71(m,2h).
[0105]
中间体11：甲基(1h-吲哚-2-羰基)-l-脯氨酸的制备
[0106]
1h-吲哚-2-羧酸(1g，6.21mmol，1.0eq)用二氯甲烷溶解后， 于-20℃加入hatu(2.81g，7.40mmol，1.2eq)后加入l-脯氨酸 甲酯盐酸盐(1.03g，6.21mmol，1.0eq)，最后加入diea(3ml， 18.51mmol，3.0eq)，tlc监控反应。反应完毕后，用水溶液和dcm 进行萃取，有机层浓缩后经柱层析分离得到中间体11(1.53g)，收 率为75.2％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.68(dt,j＝7.4,1.5hz, 1h),7.43(dd,j＝7.4,1.6hz,1h),7.26(td,j＝7.5,1.7hz,1h),7.19
–ꢀ
7.14(m,2h),4.31(t,j＝7.0hz,1h),3.72(td,j＝7.1,2.3hz,2h),3.68 (s,3h),2.11
–
2.00(m,2h),1.93
–
1.81(m,2h)。
[0107]
中间体12：(1h-吲哚-2-羰基)-l-脯氨酸的制备
[0108]
500mg中间体11加入10ml二氯甲烷溶解，然后加入5ml三 氟乙酸，反应完全后旋干，得378mg中间体12，直接作为先一步反 应。收率为91.2％。
[0109]
化合物1：甲基(s)-3-((s)-1-(1h-吲哚-2-羰基)吡咯烷-2-甲酰 胺)-5-氟-4-氧代戊酸的制备
[0110]
中间体12(168mg，0.61mmol，1.0eq)用二氯甲烷溶解后，于
ꢀ‑
20℃加入hatu(280mg，0.73mmol，1.2eq)后加入中间体8(100 mg，0.61mmol，1.0eq)，最后加入diea(301μl，1.83mmol，3.0eq)， tlc监控反应。反应完毕后，用水溶液和dcm进行萃取，浓缩有机 层，
柱层析分离得到化合物1，收率为34％。1h nmr(400mhz,dmso) δ11.55(s,1h),8.69(s,1h),7.65(d,j＝7.6hz,1h),7.46(d,j＝8.3hz, 1h),7.20(m,1h),7.06(d,j＝7.8hz,2h),5.26(m,2h),4.60(m,1h), 4.49(m,1h),3.96(dd,j＝15.0,7.4hz,2h),3.61(s,3h),2.86(m,1h), 2.60(dd,j＝15.9,7.7hz,1h),2.02(m,2h),1.82(m,2h).hrms m/z (esi)calcd for c
20h25
fn4o5[m+h]
+
403.1543found:404.1476。
[0111]
实施例2：化合物3的制备
[0112][0113]
按照上述制备路线制得本发明的化合物3，路线中各步骤的反应 条件如下：
[0114]
i、boc-l-谷氨酸二甲酯，lihmds四氢呋喃溶液，氩气，无水 四氢呋喃，-78℃，；
[0115]
ii、(2s,4r)-二甲基2-(叔-丁氧基羰基氨基)-4-(氰基甲基)戊二酸 酯，无水甲醇，六水氯化钴，硼氢化钠；
[0116]
iii、(s)-甲基2-(叔-丁氧基羰基氨基)-3-((s)-2-羰基吡咯烷-3-基) 丙酸酯，一水合氢氧化锂，四氢呋喃，0℃；
[0117]
iv、无水四氢呋喃，ar，n,n'-羰基二咪唑，0℃；
[0118]
v、乙酸乙酯，10％钯碳，氢气，室温；
[0119]
vi、二氯甲烷，盐酸二氧六环溶液；
[0120]
vii、二氯甲烷，n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟 磷酸脲，n,n-二异丙基乙胺，-20℃；
[0121]
viii、二氯甲烷，三氟乙酸；
[0122]
ix、二氯甲烷，n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟 磷酸脲，n,n-二异丙基乙胺，-20℃；
[0123]
以下为具体合成步骤：
[0124]
中间体14：(2s，4r)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-4-(氰基甲基) 戊二酸二甲酯的制备
[0125]
boc-l-谷氨酸二甲酯(12g，43.6mmol，1.0eq)溶于100ml无 水四氢呋喃，氩气置换保护，冷却至-78℃，慢慢滴加94ml lihmds 四氢呋喃溶液(1m四氢呋喃溶液，94mmol，2.2eq),滴加完毕后保 温反应1小时。3.24ml溴乙腈(46.6mmol，1.1eq)慢慢滴加入反 应液，保温反应6小时后用50ml饱和氯化铵溶液淬灭反应。将淬灭 后的反应液升温至室温，用60ml
×
3乙酸乙酯萃取三次，合并有机 相，用50ml饱和盐水洗涤后加入无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，所 得粗品用石油醚：乙酸乙酯＝4：1流动相柱层析得9.36g浅黄色油状 物，收率68.3％。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ5.11(d,j＝8.6hz, 1h),4.39(s,1h),3.77(s,3h),3.76(s,3h),2.90
–
2.82(m,1h),2.82
–ꢀ
2.74(m,2h),2.28
–
2.06(m,2h),1.45(s,9h).
[0126]
中间体15：(s)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基-3-((s)-2
‑ꢀ
氧吡咯烷-3-基)丙酸甲酯的制备
[0127]
(2s,4r)-二甲基2-(叔-丁氧基羰基氨基)-4-(氰基甲基)戊二酸酯 (9.36g，29.8mmol，1.0eq)溶于150ml无水甲醇，冷却至0℃。 加入六水氯化钴(4.25g，18mmol，0.6eq)，再分批加入硼氢化钠(6.76 g，180mmol，6.0eq)，加完后升温至室温，反应过夜，tlc监控反 应完毕。加入50ml饱和氯化铵溶液淬灭反应，减压蒸去甲醇，用 100ml
×
3乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，依次用200ml
×
3饱和 氯化铵溶液洗涤三次、200ml
×
3饱和盐水洗涤三次，有机相加入无 水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，所得粗品用石油醚：乙酸乙酯＝1：1 流动相柱层析得3.94g白色固体，收率46.2％。1h nmr(400mhz, chloroform-d)δ5.92(s,1h),5.49(d,j＝8.4hz,1h),4.41
–
4.26(m, 1h),3.74(s,3h),3.45
–
3.26(m,2h),2.58
–
2.39(m,2h),2.27
–
2.07 (m,1h),1.98
–
1.78(m,2h),1.44(s,9h).
[0128]
中间体16：(s)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-((s)-2-氧吡咯 烷-3-基)丙酸的制备
[0129]
(s)-甲基2-(叔-丁氧基羰基氨基)-3-((s)-2-羰基吡咯烷-3-基)丙酸 酯(0.88g，3.1mmol，1.0eq)溶于10ml四氢呋喃，冷却至0℃。 一水合氢氧化锂(0.64g，15.4mmol，5.0eq)溶于10ml水后慢慢 滴入，滴完后保温反应4小时，tlc监控反应完毕。饱和柠檬酸水溶 液调节ph值至中性，减压蒸去四氢呋喃，10ml乙酸乙酯萃取一次， 水相用饱和柠檬酸水溶液调节ph值至3-4，20ml
×
3乙酸乙酯萃取 三次，合并有机相，用20ml饱和盐水洗涤后加入无水硫酸镁干燥， 过滤，浓缩得0.78g类白色固体，收率93.2％。1h nmr(400mhz, chloroform-d)δ7.19(s,1h),5.69(d,j＝7.9hz,1h),4.35(q,j＝7.6 hz,1h),3.48
–
3.31(m,2h),2.70
–
2.55(m,1h),2.51
–
2.36(m,1h), 2.27
–
2.12(m,1h),1.99
–
1.80(m,2h),1.44(s,9h).
[0130]
中间体17：(4s)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-2-氟-3-氧代-5-((s)
ꢀ‑
2-氧吡咯烷-3-基)戊酸苄酯的制备
[0131]
(s)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-((s)-2-羰基吡咯烷-3-基)丙酸(2.4 g，8.8mmol，1.0eq)溶于50ml无水四氢呋喃，氩气置换保护， 冷却至0℃，加入cdi(1.5g，9.3mmol，1.05eq)，保温反应1小 时。反应液冷却至-20℃，慢慢加入1.5eq中间体4，保温反应1小 时后升温至室温反应6小时。冰水浴下将反应液慢慢倒入300ml 2m 稀盐酸中，用100ml
×
3乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和碳 酸氢钠溶液洗涤至弱碱性，再用50ml饱和盐水洗涤一次后加入无水 硫酸镁干燥，过滤，浓缩，所得粗品直接用于下步反应。
[0132]
中间体18：((s)-4-氟-3-氧代-1-((s)-2-氧吡咯烷-3-基)丁烷
ꢀ‑
2-基)氨基甲酸叔丁酯的制备
[0133]
上步所得中间体17粗品加入50ml乙酸乙酯，加入200mg 10％ 钯碳，氢气置换，氢气下室温反应过夜，过滤，浓缩，所得粗品用石 油醚：乙酸乙酯＝1：1流动相柱层析得1.3g白色固体，收率50％。 1
h nmr(400mhz,chloroform-d)δ5.99(d,j＝7.5hz,1h),5.91(s, 1h),5.31
–
4.95(m,2h),4.56(s,1h),3.42
–
3.32(m,2h),2.56
–
2.42 (m,2h),2.10
–
1.97(m,1h),1.96
–
1.81(m,2h),1.45(s,9h).
[0134]
中间体19：(s)-3-((s)-2-氨基-4-氟-3-氧丁基)吡咯烷-2-酮 的制备
[0135]
500mg中间体18加入5ml二氯甲烷溶解，然后加入5ml盐酸 二氧六环，反应完全后旋干，得中间体19，收率为85％。
[0136]
中间体22：乙基(1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基)八氢环戊 烯并[c]吡咯-1-羧酸酯的制备.
[0137]
将2,4-二氯苯氧乙酸(中间体21，0.58g,2.62mmol),2-(7-氧化 苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.2g,3.14mmol), n,n-二异丙基乙胺(1.3ml,7.86mmol),and(1s,3ar,6as)-八氢环 戊烯并[c]吡咯-1-羧酸乙酯盐酸盐(中间体20，0.58g,2.62mmol)溶 于15ml超干n,n-二甲基甲酰胺中，反应在25℃氩气保护条件下 反应12小时,d反应加入4倍体积水，用二氯甲烷萃取三次，合并有 机相用饱和氯化铵溶液、饱和碳酸钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过 滤，硅胶拌样柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)得到中间体22(0.60g, 59％)。1h nmr(400mhz,meod)δ7.42(d,j＝5.4hz,1h),7.26
–ꢀ
7.19(m,1h),6.97(d,j＝8.9hz,1h),4.80-7.72(m,2h),4.28(d,j＝3.6 hz,1h),4.22
–
4.10(m,2h),3.87(d,j＝10.6hz,1h),3.63
–
3.48(m, 1h),3.57(d,j＝10.5hz,2h),2.71
–
2.61(m,1h),2.08
–
1.84(m,1h), 1.83
–
1.46(m,4h),1.31
–
1.17(m,3h).esi-ms(m/z):386.02(m+h)
+
.
[0138]
中间体23：(1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基)八氢环戊烯 并[c]吡咯-1-羧酸的制备
[0139]
将乙基(1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基)八氢环戊烯并[c] 吡咯-1-羧酸酯(中间体22，200mg,0.52mmol)溶于20ml甲醇中， 然后加入2m氢氧化钠溶液(10ml)，反应在25℃下搅拌4小 时.tlc监控反应结束后，旋干甲醇，用盐酸调ph至弱酸性，二氯 甲烷萃取三次，合并有机相无水硫酸钠干燥后选干得粗产品直接进行 下一步反应。
[0140]
化合物3：(1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯)乙酰基)-n-((s)-4-氟-3-氧
ꢀ‑
1-((s)-2-羰基-3-基)丁烷-2-基)八氢环戊烯并[c]吡咯-1-甲酰胺的制 备
[0141]
中间体23(168mg，0.61mmol，1.0eq)用二氯甲烷溶解后，于
ꢀ‑
20℃加入hatu(280mg，0.73mmol，1.2eq)后加入中间体19(100 mg，0.61mmol，1.0eq)，最后加入diea(301μl，1.83mmol，3.0eq), tlc监控反应。反应完毕后，用水溶液和dcm进行萃取，有机层浓 缩后经柱层析分离得到化合物3，收率为34％。1h nmr(400mhz, dmso)δ8.61(d,j＝7.4hz,2h),8.29(d,j＝7.7hz,1h),8.15(d,j＝ 8.5hz,1h),7.65(s,1h),7.56(d,j＝7.0hz,2h),7.41(td,j＝11.1,6.0 hz,4h),6.75(dd,j＝15.9,6.1hz,1h),5.15(m,2h),4.39(s,1h),3.62 (d,j＝4.1hz,2h),3.16(m,1h),3.11(m,2h),2.28(d,j＝36.4hz,1h), 2.12(s,1h),1.96(m,1h),1.62(m,2h),1.50(dd,j＝15.5,8.6hz,2h), 0.88(m,6h).hrms m/z(esi)calcd for c
23h30
fn3o4[m+h]
+
432.2293 found:432.2291。
[0142]
实施例3：制备化合物9
[0143][0144]
按照上述制备路线制得本发明的化合物9，路线中各步骤的反应 条件如下：
[0145]
i、1-羟基苯并三唑，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐，n,n-二异丙基乙胺，n,n-二甲基甲酰胺，室温。
[0146]
ii、氢氧化钠，甲醇，水，55度
[0147]
iii、2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯，n,n
‑ꢀ
二异丙基乙胺，n,n-二甲基甲酰胺，0℃
[0148]
iv、硼氢化钠，甲醇，室温
[0149]
v、戴斯马丁氧化剂，超干二氯甲烷，室温
[0150]
以下为具体合成步骤：
[0151]
中间体25：甲基(1r,2s,5s)-6,6-二甲基3-(喹啉-2-羰基)-3-氮杂 双环[3.1.0]己烷-2-羧酸的制备
[0152]
将原料23(喹啉2-羧酸1.0g，11.6mmol)、1-羟基苯并三唑(2.03g, 15.08mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.43g,23.3 mmol)，n,n-二甲基甲酰胺30ml置于圆底烧瓶常温搅拌0.5小时， 加入n,n-二异丙基乙胺2.5ml，再加入0.59g中间体24，反应8h后， 减压蒸馏除去溶剂，用二氯甲烷和氯化铵溶液、碳酸氢钠溶液进行萃 取，水、饱和氯化钠溶液进行洗涤，最后用硫酸钠干燥，抽滤，将有 机相柱层析得白色固体。收率为85％。1h nmr(400mhz,dmso)δ 8.12
–
8.03(m,1h),8.00
–
7.90(m,2h),7.66
–
7.48(m,3h),4.54(s, 1h),4.03(q,j＝7.1hz,1h),3.75(d,j＝6.7hz,3h),3.47(d，j＝5.4 hz 1h),3.39(d，j＝5.7hz 1h),1.99(t,j＝6.2hz,1h),1.54(t,j＝6.8 hz,1h),1.03(s,3h),0.97(s,3h).ms(esi,正离子)m/z:325.04.87[m +h]
+
。
[0153]
中间体26：(1r,2s,5s)-6,6-二甲基3-(喹啉-2-羰基)-3-氮杂双环 [3.1.0]己烷-2-羧酸的制备
[0154]
将中间体25溶于20ml四氢呋喃，缓慢加入10ml 2mol/l的氢 氧化钠溶液，将反应液在逐渐升温至55度搅拌3小时后终止并冷却 至常温，浓缩反应液，加水调ph为弱酸性，析出白色固体，抽滤的 得中间体5，未经进一步纯化被用作下一步反应
[0155]
中间体28：甲基((1r,5s)-6,6-二甲基-3-(喹啉-2-羰基)-3-氮杂双环 [3.1.0]己烷-2-羰基)-l-苯基丙氨酸的制备
[0156]
将中间体26 1.0g、2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲 六氟磷酸酯1.93g加入20ml n,n-二甲基甲酰胺中，0℃搅拌0.5小 时，加入n,n-二异丙基乙胺2.0ml，再加入中间体27 0.89g,氩气 保护0℃条件下反应12h后，加入4倍体积的水，用乙酸乙酯进行萃 取三次。合并有机相，用氯化铵溶液、碳酸氢钠溶液进行萃取，水、 饱和氯化钠溶液进行洗涤，最后用硫酸钠干燥，抽滤，将有机相柱层 析得白色固体。收率为65％。1h nmr(400mhz,dmso)δ8.53(d,j＝ 7.5hz,1h),8.04(d,j＝6.4hz,1h),7.99(d,j＝6.4hz,1h),7.94(d,j ＝3.7hz,1h),7.83(d,j＝8.5hz,1h),7.61
–
7.57(m,1h),7.33(dd,j＝ 8.4,1.5hz,1h),7.28(s,2h),7.23
–
7.18(m,1h),7.13(d,j＝1.6hz, 1h),6.95(d,j＝2.5hz,1h),4.55
–
4.44(m,1h),3.95(d,j＝5.2hz, 1h),3.81(t,j＝11.3hz,1h),3.61(s,3h),3.05(d,j＝13.8,7.5hz,1h), 2.84(dd,j＝13.8,5.6hz,1h),2.82(d,j＝5.6hz,1h),1.42
–
1.37(m, 1h),1.36
–
1.32(m,1h),0.96(s,3h),0.91(s,3h).
[0157]
中间体29：(1r,5s)-n-((s)-1-羟基-3-苯丙-2-基)-6,6-二甲基-3-(喹 啉-2-羰基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺的制备
[0158]
将中间体28(((1r,5s)-6,6-二甲基-3-(喹啉-2-羰基)-3-氮杂双环 [3.1.0]己烷-2-羰基)-l-苯基丙氨酸)500mg，溶于30ml干燥甲醇中， 常温条件下加入硼氢化钠，搅拌3小时后，加水淬灭，旋干甲醇，用 乙酸乙酯萃取水相(50ml
×
3)，收集有机相用硫酸钠进行干燥，抽滤 后旋干有机相是为中间体29，产率80％。
[0159]
化合物9：(1r,5s)-6,6-二甲基-n-((s)-1-氧-3-苯丙-2-基)-3-(喹啉-2
‑ꢀ
羰基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺的制备
[0160]
将中间体29(1r,5s)-n-((s)-1-羟基-3-苯丙-2-基)-6,6-二甲基-3-(喹 啉-2-羰基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰胺200mg，溶于10ml干燥 二氯甲烷中，常温搅拌条件下加入戴斯马丁氧化剂，tlc监控反应进 行完毕，抽滤除去氧化剂，滤液柱层析得化合物9，产率65％。1h nmr (400mhz,dmso)δ9.55(s,1h),9.06(s,1h),8.56(d,j＝7.3hz,1h), 8.44(dd,j＝8.5,2.4hz,1h),7.86(d,j＝8.5hz,1h),7.76(m,1h),7.32
ꢀ–
7.21(m,5h),7.14(d,j＝2.9hz,,1h),7.08(d,j＝5.7hz,1h),5.33(s, 1h),4.44(d,j＝5.6hz,1h),4.33(m,2h),4.13(m,2h),1.82(m,1h), 1.50(m,1h),1.02(s,3h),0.87(s,3h)。
[0161]
实施例4：制备化合物14
[0162][0163]
按照上述制备路线制得本发明的化合物14，路线中各步骤的反 应条件如下：
[0164]
i、三氟乙酸,二氯甲烷,25℃
nmr(400mhz,meod)δ7.17(d,j＝8.0hz,2h), 6.97(d,j＝8.9hz,2h),4.80
–
4.67(m,2h),4.55(d,j＝11.8hz,1h), 3.94-3.83(m,1h),3.72(s,3h),3.68
–
3.57(m,1h),3.23
–
3.12(m,1h), 3.11
–
3.00(m,2h),2.58(d,j＝8.8hz,1h),2.26
–
2.04(m,2h),1.73
–ꢀ
1.40(m,4h),1.10(s,3h),0.92(s,3h).esi-ms(m/z):542.13(m+h)
+
.
[0179]
中间体35：(1r,2s,5s)-n-((s)-1-羟基-3-((s)-2-羰基-3-基)丙酸酯
ꢀ‑
2-基)-3-(2-(4-(三氟甲氧基)苯氧)乙酰基)-3-氮杂双环并[3.1.0]己烷-2
‑ꢀ
甲酰胺的制备
[0180]
将甲基(1r,2s,5s)-6,6-二甲基-3-(2-(4-(三氟甲氧基)苯氧)乙 酰)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷
‑‑
2-酰胺)-3-((s)-2-羰基-3-基)丙酸酯(中间 体34 0.56mg,1.1mmol)加入50毫升中，低温条件下分批加入硼氢化 钠(0.14g,8.8mmol).反应常温条件下搅拌2小时后，加水淬灭，旋 干甲醇，用乙酸乙酯(50ml
×
3)对剩余水相进行萃取.有机相合并后 用无水硫酸钠干燥，过滤旋干得白色固体为粗产品，被直接用于下一 步反应。
[0181]
化合物14：(1r,2s,5s)-6,6-二甲基-n-((s)-1-醛基-3-((s)-2-羰基-3
‑ꢀ
基)丙酸酯-2-基)-3-(2-(4-(三氟甲氧基)苯氧)乙酰基)-3-氮杂双环并 [3.1.0]己烷-2-甲酰胺的制备
[0182]
将(1r,2s,5s)-n-((s)-1-羟基-3-((s)-2-羰基-3-基)丙酸酯-2
‑ꢀ
基)-3-(2-(4-(三氟甲氧基)苯氧)乙酰基)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酰 胺(中间体36，(0.38g,0.75mmol)溶于超干二氯甲烷中,然后分批 加入戴斯马丁氧化剂(0.95mg,0.79mmol)，室温条件下反应3.5小 时，tlc监控反应结束，反应体系过滤，用硫代硫酸钠溶液和饱和碳 酸氢钠溶液洗涤有机相,浓缩后用制备色谱分离体系(乙腈/水＝ 30:70)分离得化合物14(0.28g,45％)as a white solid.1h nmr(400 mhz,meod)δ7.24
–
7.13(m,2h),7.04
–
6.92(m,2h),4.49(d,j＝9.1 hz,1h),4.37-4.30(m,1h),4.06
–
3.89(m,1h),3.65-3.49(m,1h),3.11
ꢀ–
2.98(m,1h),2.55(d,j＝9.5hz,1h),2.29
–
2.10(m,1h),2.06
–
1.99 (m,1h),1.72
–
1.44(m,4h),1.13(s,3h),1.00(s,3h).
13
c nmr(101 mhz,meod)δ181.60,172.58,167.18,156.90,142.99,121.99,115.47 (d,j＝7.7hz),66.06,61.05,60.14,51.26,46.00,39.94,37.75,30.87(d, j＝7.8hz),29.88(d,j＝18.5hz),27.66(d,j＝17.9hz),25.03,19.04, 11.63.hrms(m/z):calculated for c
24h28
f3n3o
6+
[m+h]
+
512.1964； found,512.2137.
[0183]
实施例5：化合物15的制备
[0184][0185]
按照上述制备路线制得本发明的化合物15，路线中各步骤的反 应条件如下：
[0186]
i、2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯，n,n
‑ꢀ
二异丙基乙胺，n,n-二甲基甲酰胺，0℃
[0187]
ii、硼氢化钠，甲醇，室温
[0188]
iii、戴斯马丁氧化剂，超干二氯甲烷，室温。
[0189]
具体合成步骤如下：
[0190]
中间体36：甲基(s)-2-((1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基) 八氢环戊烯并[c]吡咯-1-甲酰胺)-3-((s)-2-羰基-3-基)丙酸酯的制备
[0191]
首先，2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯 (0.099g,0.26mmol)被加入(1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基) 八氢环戊烯并[c]吡咯-1-羧酸(中间体23，0.071g,0.20mmol)的超 干n,n-二甲基甲酰胺溶液中，反应体系先搅拌30分钟，n,n-二异丙 基乙胺(100μl,0.60mmol)，甲基(s)-2-氨基-3-((s)-2-羰基-3-基)丙酸 酯三氟乙酸盐(中间体30，0.060g,0.32mmol)被依次加入反应体系. 反应在0℃氩气保护条件下反应12小时,tlc监控反应结束，加入 4倍体积的水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相用饱和氯化铵溶液、 饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，拌样柱层析(乙酸 乙酯/甲醇＝10:1)获得中间体36(0.063g,59％).1h nmr(400 mhz,meod)δ7.40(d,j＝2.5hz,1h),7.26
–
7.19(m,1h),6.95(d,j ＝8.9hz,1h),4.79-4.71(m,2h),4.54(d,j＝3.7hz,1h),4.25(t,j＝4.3hz,1h),3.72(s,3h),3.54
–
3.46(m,2h),3.21
–
3.12(m,1h),3.10
ꢀ–
2.99(m,1h),2.86-2.70(m,2h),2.04
–
1.97(m,2h),1.96-1-85(m, 3h),1.83
–
1.46(m,6h).esi-ms(m/z):526.03(m+h)
+
.
[0192]
中间体37：(1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基)-n-((s)-1-羟 基-3-((s)-2-羰基-3-基)丙酸酯-2-基)八氢环戊烯并[c]吡咯-1-甲酰胺 的制备
[0193]
将甲基(s)-2-((1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基)八氢环戊 烯并[c]吡咯-1-甲酰胺)-3-((s)-2-羰基-3-基)丙酸酯(中间体36，1,00g, 2.0mmol)溶于无水甲醇中，然后再0℃条件下分批加入硼氢化钠 (0.6g,16mmol)，然后将温度升至室温，继续搅拌2小时，tlc检 测反应结束，加水淬灭，旋干甲醇，用乙酸乙酯(50ml
×
3)对剩余水 相进行萃取.有机相合并后用无水硫酸钠干燥，过滤旋干得白色固体 为粗产品，被直接用于下一步反应。
[0194]
化合物15：(1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基)-n-((s)-1-醛 基-3-((s)-2-羰基-3-基)丙酸酯-2-基)八氢环戊烯并[c]吡咯-1-甲酰胺 的制备
[0195]
在(1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基)-n-((s)-1-羟基
ꢀ‑
3-((s)-2-羰基-3-基)丙酸酯-2-基)八氢环戊烯并[c]吡咯-1-甲酰胺(中 间体37，0.50g,1.0mmol)的超干二氯甲烷溶液中,分批缓慢加入戴 斯马丁氧化剂(0.55g,1.3mmol)，室温条件下反应3.5小时，tlc 监控反应结束，反应体系过滤，用硫代硫酸钠溶液和饱和碳酸氢钠溶 液洗涤有机相,浓缩后用制备色谱分离体系(乙腈/水＝45:55)得 到白色固体化合物30(0.21g,42％)。1h nmr(400mhz,meod)δ7.42 (t,j＝4.3hz,1h),7.28
–
7.17(m,1h),7.03
–
6.90(m,1h),4.47(dd,j ＝9.6,6.1hz,1h),4.26(t,j＝5.8hz,1h),4.03
–
3.86(m,2h),3.51(dd, j＝10.4,4.0hz,1h),3.15(t,j＝8.4hz,1h),3.04
–
2.82(m,2h),2.75
ꢀ–
2.50(m,2h),2.18(dd,j＝13.2,7.0hz,1h),2.18(dd,j＝13.2,7.0hz, 1h),2.08
–
1.77(m,5h),1.76
–
1.43(m,5h).
13
c nmr(101mhz, meod)δ181.64,173.39,167.10(d,j＝2.9hz),152.81,129.30,
127.35, 125.73,123.12,114.81,66.81,60.14,53.90(d,j＝35.6hz),52.20,51.20 (d,j＝18.6hz),43.34,40.00,37.73,31.69(d,j＝4.2hz),31.14(d,j＝ 2.6hz),29.62(d,j＝24.1hz),27.67,24.69,19.48,13.09.hrms(m/z): calculated for c
23h27
cl2n3o
5+
[m+h]
+
496.1361；found,496.0842.
[0196]
实施例6：化合物42的制备
[0197][0198]
按照上述制备路线制得本发明的化合物42，路线中各步骤的反 应条件如下：
[0199]
i、lda,clch2i,thf
[0200]
ii、hcl二氧六环溶液
[0201]
iii、2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯，n,n
‑ꢀ
二异丙基乙胺，n,n-二甲基甲酰胺，0℃。
[0202]
具体合成步骤如下：
[0203]
中间体38：叔丁基((s)-4-氯-3-氧-1-((s)-2-羰基-3-基)丁烷-2-基) 氨基甲酸酯的制备
[0204]
选取干燥三口瓶，分别准备氩气保护和温度计，加入(s)-甲基 2-(叔-丁氧基羰基氨基)-3-((s)-2-羰基吡咯烷-3-基)丙酸酯(中间体16， 5g,17.5mmol),四氢呋喃(50ml)，氯碘甲烷(5ml,68mmol)在
ꢀ‑
77℃下进行搅拌.二异丙基氨基锂(70ml,105mmol)被进一步滴 入。加完以后进一步反应2小时，然后再低温条件下加入乙酸和四氢 呋喃进行淬灭，产生的黑色悬浮物被进一步搅拌10分钟同时升温至 室温。反应进一步用乙酸乙酯稀释，用水、饱和碳酸氢钠溶液和饱和 食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，过滤浓缩拌样柱层析得浅黄色固体 为中间体38。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.89(s,1h),7.72(d,j＝ 7.5hz,1h),4.72-4.94(m,2h),4.35(m,1h),3.26-3.40(m,2h), 2.45(m,1h),2.32-2.42(m,1h),2.00-2.14(m,1h),1.79-1.99(m,2 h),1.61(s,9h)。
[0205]
中间体39：(s)-3-((s)-2-氨基-4-氯-3-氧丁基)吡咯烷-2-酮盐酸盐 的制备
[0206]
将叔丁基((s)-4-氯-3-氧-1-((s)-2-羰基-3-基)丁烷-2-基)氨基甲酸酯 (中间体38)250mg加入20ml二氧六环中，随后加入20ml氯化氢 二氧六环溶液20ml，常温搅拌4小时后，tlc检测反应完，旋干反 应液得粗产品用于下一步反应。
[0207]
化合物42：(1s,3ar,6as)-n-((s)-4-氯-3-氧-1-((s)-2-羰基-3-基)丁 烷-2-基)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基)八氢环戊烯并[c]吡咯-1-甲酰 胺的制备
[0208]
将2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(1g, 2.6mmol)加入(1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯苯氧)乙酰基)八氢环戊烯并 [c]吡咯-1-羧酸(中间体23，0.71g,2.0mmol)的超干n,n-二甲基甲 酰胺溶液中，反应体系先搅拌30分钟，n,n-二异丙基乙胺(1ml,6.0 mmol)，(s)-3-((s)-2-氨基-4-氯-3-氧丁基)吡咯烷-2-酮盐酸盐(中间体 39，0.652g,3.2mmol)被依次加入反应体系.反应在0℃氩气保护 条件下反应16小时,tlc监
控反应结束，加入3倍体积的水，用乙酸 乙酯萃取三次，合并有机相用饱和氯化铵溶液、饱和碳酸氢钠溶液洗 涤，无水硫酸钠干燥后过滤，制备纯化系统(乙腈/水＝30:70)分离 获得化合物42.1h nmr(400mhz,meod)δ7.40(s,1h),7.20(dd,j＝ 8.7,2.4hz,1h),7.05
–
6.91(m,1h),5.00
–
4.89(m,1h),4.79(d,j＝ 16.1hz,1h),4.69
–
4.35(m,2h),4.25(m,1h),3.99
–
3.85(m,1h), 3.58
–
3.45(m,1h),3.25
–
3.03(m,1h),2.93
–
2.77(m,1h),2.76
–ꢀ
2.50(m,2h),2.45
–
2.24(m,1h),2.18(d,j＝10.9hz,1h),2.11
–
1.47 (m,9h),1.39
–
1.27(m,1h).esi-ms(m/z):544.07(m+h)
+
.
[0209]
实施例7：化合物50的制备
[0210][0211]
按照上述制备路线制得本发明的化合物50，路线中各步骤的反 应条件如下：
[0212]
i、叔丁基乙异腈,乙酸,超干二氯甲烷；
[0213]
ii、1m氢氧化钠溶液,甲醇；
[0214]
iii、戴斯马丁氧化剂、超干二氯甲烷。
[0215]
具体合成步骤如下：
[0216]
中间体40：(3s)-1-(叔丁氨基)-3-((1s,3ar,6as)-2-(2-(2,4-二氯)乙 酰基)八氢环戊烯并[c]吡咯-1-甲酰胺)-1-氧代-4-((s)-2-羰基-3-基)丁 烷-2-基羧酸的制备
[0217]
首先，化合物15(0.40mmol)被溶于超干二氯甲烷中，然后依次加入 乙酸(0.028g,0.47mmol)，叔丁基异腈(0.43mmol)。反应在常温条 件下搅拌24小时，减压蒸馏柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15：1)得到中 间体40。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.87(d,j＝12.1hz,1h), 7.46(s,1h),7.44(d,j＝1.4hz,1h),7.37(t,j＝4.6hz,1h),7.27(dd,j ＝7.5,1.5hz,1h),7.11(d,j＝7.5hz,1h),5.09(d,j＝7.1hz,1h),4.82 (s,2h),4.36
–
4.28(m,2h),3.64(ddd,j＝59.5,12.4,7.0hz,2h),3.22 (td,j＝7.1,4.6hz,2h),2.67
–
2.44(m,3h),2.09(s,3h),1.99
–
1.51(m, 10h),1.27(s,9h)。
[0218]
中间体41：(1s,3ar,6as)-n-((2s)-4-(叔丁氨基)-3-羟基-4-氧代
ꢀ‑
1-((s)-2-羰基-3-基)丁烷-2-基)-2-(2-(2,4-二氯)乙酰基)八氢环戊烯并 [c]吡咯-1-甲酰胺的制备
[0219]
1m的氢氧化钠溶液被加入(0.5ml)中间体40(0.164mmol)的 甲醇溶液中，反应在常温条件下搅拌2小时，用1m盐酸调ph到 中性.旋干反应液，残渣用二氯甲烷溶解，用水萃取后旋干反应液得 粗产品41直接用于下一步反应。
[0220]
化合物50：(1s,3ar,6as)-n-((s)-4-(叔丁氨基)-3,4-氧代-1-((s)-2
‑ꢀ
羰基-3-基)丁烷-2-基)-2-(2-2,4-二氯)乙酰基)八氢环戊烯并[c]吡咯
ꢀ‑
1-甲酰胺的制备
[0221]
在中间体41的超干二氯甲烷溶液中,分批缓慢加入戴斯马丁氧 化剂，室温条件下反应4小时，tlc监控反应结束，反应体系过滤， 用硫代硫酸钠溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相,浓缩后用制备 色谱分离体系(乙腈/水＝50:50)得到白色固体化合物50。1h nmr (400mhz,meod)δ7.42(d,j＝1.4hz,1h),7.26(dd,j＝7.5,1.5hz, 1h),7.12(d,j＝7.5hz,1h),4.84(s,2h),4.67(dt,j＝11.9,7.0hz,1h), 4.36(dd,j＝7.0,0.7hz,1h),3.74
–
3.57(m,2h),3.23
–
3.13(m,2h), 2.70
–
2.46(m,3h),2.15
–
1.54(m,10h),1.43(s,9h).esi-ms(m/
z): 595.07(m+h)
+
。
[0222]
根据实施例1～7中的制备路线，改变原料，制得本发明表1所示 的剩余化合物。
[0223]
表1本发明化合物的结构和表征数据
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237]
[0238]
[0239]
[0240]
[0241]
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248]
[0249]
[0250][0251]
以下通过实验例证明本发明化合物的药理效果。
[0252]
实验例1：本发明化合物对m
pro
酶活力抑制水平的测试
[0253]
(1)实验方法
[0254]
将重组sars-cov-2 m
pro
(最终浓度为750nm)与每种化合物的 系列稀释液混合在25μl分析缓冲液(20mm tris
–
hcl，ph 7.5， 150mm nacl，1mm edta，2mm dtt)中，并孵育10分钟。通过 添加最终浓度为20μm的25μl荧光底物(mca-avlq
↓
sgfr-lys (dnp)-lys-nh2)来启动反应，用酶标仪测定320nm(激发)/405nm (发射)处的荧光信号。计算加入不同浓度化合物的反应的vmax与 加入dmso的反应的vmax，并用其生成ic
50
曲线。对于每种化合物， 在9种浓度和3个独立重复下测量抗sars-cov-2 m
pro
的半抑制浓度(ic
50
)值。所有实验数据均采用graphpad prism软件进行分析。
[0255]
(2)实验结果
[0256]
表2化合物对sars-cov-2 m
pro
的酶活抑制效果
[0257]
[0258][0259]
从表2和图1、图2、图3可以看出，本发明的化合物能够有效 抑制sars-cov-2 m
pro
的活性，可以用来制备sars-cov-2 m
pro
抑制 剂，制备抗新型冠状病毒的药物，以及制备预
防和/或治疗新型冠状 病毒肺炎的药物。
[0260]
实验例2：本发明的化合物对sars-cov-2感染vero e6细胞导致细 胞死亡的抑制实验
[0261]
(1)实验方法
[0262]
通过检测化合物对sars-cov-2感染vero e6细胞导致的细胞死 亡的抑制效果，初步评价化合物的抗病毒活性。具体实验方案是：将 vero e6细胞以细胞密度为2
×
104细胞/孔，100μl/孔接种在96孔板内， 于37℃，5％co2培养箱中培育过夜。次日，每孔同时加入100μl药 物和100μl病毒稀释液(moi＝1)，设置不含药物的阳性对照和不含 病毒的阴性对照，37℃，5％co2培养，72h后，通过cck-8试剂盒 检测细胞存活率，计算药物对病毒复制的抑制率和半数起效浓度 (ec
50
)值，所有实验设置3个独立重复，所有实验数据均采用 graphpad prism软件进行分析。
[0263]
(2)实验结果
[0264]
表3本发明化合物对sars-cov-2感染vero e6细胞导致细胞 死亡的抑制活性
[0265]
[0266]
[0267][0268]
注：nt代表未测试细胞活性
[0269]
从表3可以看出，本发明的化合物能够有效抑制sars-cov-2 感染vero e6细胞导致的细胞死亡，说明本发明的化合物可以有效抑 制sars-cov-2病毒在细胞内的复制。
[0270]
实验例3：化合物对vero e6细胞的毒性实验
[0271]
(1)实验方法
[0272]
使用vero e6细胞进行化合物的细胞毒性评估。具体实验方案是： 将vero e6细胞以细胞密度为2
×
104细胞/孔，100μl/孔接种在96孔 板内，于37℃，5％co2培养箱中培育过夜。次日，每孔加入200μl 含药培养基，化合物以200μm为初始浓度，5倍梯度稀释，共6个梯 度，每个浓度设置3个重复孔，每组实验设置不含药物的阴性对照和 空白对照。药物处理72h后，使用cck-8试剂盒检测细胞活力，计 算化合物对vero e6细胞的毒性和细胞半数毒性浓度(cc
50
)值。所 有实验数据均采用graphpad prism软件进行分析。
[0273]
(2)实验结果
[0274]
表4本发明化合物对vero e6细胞的毒性
[0275]
[0276]
[0277][0278]
从表4可以看出，本发明的化合物对vero e6细胞的毒性很低。 实验例4：化合物对sars-cov-2在人肺泡上皮细胞中复制的抑制 实验
[0279]
(1)实验方法
[0280]
对于rt-qpcr方法，将人肺泡上皮细胞以8
×
105个细胞/孔的密 度接种到48孔板(200μl/孔)中，并生长过夜。然后用病毒感染(moi ＝0.01)和不同浓度的化合物处理细胞。在37℃下孵育1小时后，将 含有病毒-药物混合物的培养基除去，并用含有化合物的新鲜培养基 替换。继续孵育48小时后，收集细胞上清液提取病毒rna，将其进 行rt-qpcr定量分析并计算药物对病毒复制的抑制率和ec
50
值。ec
50
值是使用graphpad prism 8.0软件中的剂量反应模型计算的，实 验设置2个独立重复。
[0281]
(2)实验结果
[0282]
测试结果如图4所示，化合物14、15、26、43、44和45均在人 肺泡上皮细胞中表现出纳摩尔级的抑制sars-cov-2复制的活性， 优于已报道的活性最高的sars-cov-2 m
pro
抑制
剂11b(dai et al., 2020,science.368(6497):1331-1335)和gc376(ma et al.,2020,cellres.30(8):678-692)在同样测试条件下的抗病毒活性(11b，ec
50
＝23.6 nm；gc376，ec
50
＝151.3nm)。
[0283]
实验例5：噬斑法评价化合物抗sars-cov-2活性(vero e6细胞)
[0284]
(1)实验方法
[0285]
使用噬斑法评价化合物3和39在vero e6细胞中的抗 sars-cov-2活性。vero e6以每孔1.0
×
105个接种于24孔细胞培养 板中，37℃培养过夜后备用。加入梯度稀释的药物后，加入 sars-cov-2感染细胞，moi约为0.002。置于37℃细胞培养箱培养 1小时后，去掉含药感染上清，pbs洗一遍，加入含有不同浓度药物 的羧甲基纤维素钠0.5ml，羧甲基纤维素钠终浓度为0.9％，置于37℃ 细胞培养箱培养72小时。用20％的甲醛固定2小时，加入0.5％的结 晶紫染色20分钟后，晾干拍照，观察空斑大小并记录空斑数目。实 验设空白对照孔(正常细胞)，病毒对照孔，阳性药物对照孔。
[0286]
计算公式：抑制率(％)＝(病毒对照孔空斑数-样品孔空斑数)/ 病毒对照孔空斑数*100
[0287]
计算所得的细胞活性和抑制率，用graphpad prism8计算ec
50
(半 数起效浓度)值。
[0288]
(2)实验结果
[0289]
表5小分子化合物对sars-cov-2的抑制作用
[0290]
化合物名称ec
50
(μm)30.24391.20remdesivir(瑞德西韦)0.69
[0291]
实验结果如表5所示，本发明化合物可以有效抑制vero e6细胞 中sars-cov-2感染；特别是化合物3，ec
50
为0.2373μm，活性优 于阳性对照瑞德西韦(ec
50
为0.692μm)。
[0292]
实验例6：化合物对大鼠的体内药代动力学特性评估
[0293]
(1)给药方案
[0294]
雄性sprague-dawley(sd)大鼠60只，体重200-230g，随机 分成3组，每组3只。按照如下表6方案分别灌胃(p.o.)、静脉(i.v.) 和腹腔(i.p.)给予系列受试化合物。实验前禁食12h，自由饮水。给 药后2h统一进食。
[0295]
灌胃、静脉和腹腔给药溶液以dmso/hs15/nacl(5/3/92，v/v/v) 配制。按表6所示给药剂量给予药物，记录给药时间，并在以上设定 的时间点经颈静脉采血或其他合适方式，每个样品采集约0.20ml， 肝素钠抗凝，采集后放置冰上。并于1小时之内离心分离血浆(离心 条件：6800g，6分钟，2-8℃)。血浆样本在分析前存放时则放于-80℃ 冰箱内。分组及采血时间点见表6，每个时间点3只动物。
[0296]
表6化合物对大鼠的体内药代动力学特性评估实验方案
[0297][0298]
(2)实验结果
[0299]
表7化合物的主要药动学参数
[0300]
[0301][0302][0303]
结果如表7所示。本发明对化合物3，14，15，26，39，40，43， 44和45进行了药代动力学研究。其中，化合物3的口服暴露量为2293 h*ng/ml，生物利用度为55.1％。化合物14的腹腔暴露量为11581 h*ng/ml，生物利用度为78.0％；口服暴露量为1665h*ng/ml，生物 利用度为11.2％。化合物15的腹腔注射给药暴露量为12166h*ng/ml， 生物利用度为62.3％；口服暴露量为2843h*ng/ml，生物利用度为 14.6％。化合物26的口服暴露量为842h*ng/ml，生物利用度为7.2％。 化合物39的口服暴露量为14586h*ng/ml，生物利用度为14.7％。化 合物40的口服暴露量为2888h*ng/ml，生物利用度为22.1％。化合 物43的口服暴露量为258h*
ng/ml，生物利用度为4.8％。化合物44 的口服暴露量为381h*ng/ml，生物利用度为4.1％。化合物45的口 服暴露量为968h*ng/ml，生物利用度为5.1％。
[0304]
实验结果表明，本发明化合物在大鼠的体内具有良好的药代动力 学性质。
[0305]
实验例7：化合物对大鼠的体内安全性的初步评价
[0306]
(1)实验方法
[0307]
将化合物溶解在5％(v/v)dmso(sigma-aldrich)，3％(v/v) hs15(glpbio)和92％生理盐水中。spf sd大鼠(年龄：7-11周) 雌190-220克)雄(体重200-230克)各半。按表8的给药方案进行 试验，并对所有动物进行临床观察。并在实验结束时，收集心脏，肝， 脾，肺，肾和给药部位的样品。试验结果如表8所示。
[0308]
(2)实验结果
[0309]
表8对大鼠的体内安全性的初步评价
[0310][0311][0312]
实验结果显示，本发明化合物对大鼠的体内安全性良好。
[0313]
实验例8：化合物对转基因小鼠的体内抗sars-cov-2感染的活性 研究
[0314]
(1)实验方案
[0315]
人源化血管紧张素转化酶2(ace2)转基因小鼠(年龄：8-10 周)购自江苏集萃药康生物科技有限公司(#t037659。将化合物溶 于5％(v/v)dmso(sigma-aldrich)，3％(v/v)hs15(glpbio) 和92％生理盐水中。按表9的试验方案进行sars-cov-2(stain107) 滴鼻感染和给药。观察所有小鼠并每天监测其体重直至处死。病毒感 染后第1(1dpi)、3(3dpi)和5(5dpi)天，收集肺组织(n＝3，每 个dpi组)用于病毒载量检测、h&e组织病理学分析、代表性炎性 细胞因子和趋化因子测定及炎性细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)计数。
[0316]
表9化合物对转基因小鼠体内抗sars-cov-2感染的活性研究方案
[0317][0318]
肺部病毒载量检测的具体实验方案是：使用trizol
tm
试剂 (invitrogen)从肺组织中提取rna，并使用probe 一步法qrt-pcr试剂盒(toyobo)对病毒rna进行定量，结果表示 为每微克组织的病毒rna的拷贝数。
[0319]
肺部组织病理学分析的具体实验方案是：将肺部组织用4％多聚 甲醛固定至少7天，包埋在石蜡中并切成3μm的切片。将切片用苏 木精和曙红(h&e)染色，并通过光学显微镜进行分析。根据组织 学特征(肺泡间隔增厚，出血，炎性细胞浸润等)评估肺损伤。
[0320]
肺部代表性炎性细胞因子和趋化因子测定的具体实施方案是：使 用primescript
tm
rt试剂盒(takara)，将从肺部提取的rna反转录 为cdna，然后通过premix ex taq
tm
ii(tlirnaseh plus) (takara)和viia
tm
定量基因表达。表10中显示了用于定量炎性基 因表达的引物序列。
[0321]
表10测定代表性炎性细胞因子和趋化因子的引物序列
[0322][0323]
肺部测定炎性细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)数量的具体实施方 案是：将小鼠肺部组织在4％多聚甲醛中固定至少7天，然后按照标 准程序将石蜡包埋并切成4μm切片。在二甲苯中进行去石蜡，抗原 回收和封闭后，将肺切片与大鼠单克隆抗体f4/80(huabio，1：
100) 或兔多克隆抗体ly6g(servicebio，1：300)在4℃孵育过夜，然后 与辣根过氧化物酶(hrp)偶联的山羊抗大鼠二抗或hrp偶联的山 羊抗兔二抗在室温下反应1小时，以根据酪酰胺信号放大(tsa)催 化cy3-酪胺和cy5-酪胺并放大染色信号。用dapi对细胞核染色后， 所有切片均使用leica dmi 4000b显微镜(德国)拍照，并通过 imagej软件(美国nih)和flowjo软件(美国bd)进行分析。为 了半定量地测量巨噬细胞和嗜中性白细胞的浸润，通过光学显微镜检 查每个肺切片中5个任意选择的肺实质区域，以观察嗜中性白细胞或 巨噬细胞的存在。该评估以盲法进行。每只动物的累积得分表示为每 100个视野的阳性视野数(％)。
[0324]
上述实验以安慰剂作为对照。该安慰剂为与受试药物剂型相同、 但是不含药物活性成分的制剂。
[0325]
(2)实验结果
[0326]
肺部病毒载量检测实验结果如图5所示，口服和腹腔给予化合物 14及腹腔给予化合物15均可以有效降低sars-cov-2感染的转基因 小鼠肺部的病毒载量。
[0327]
肺部组织病理学分析实验结果如图6所示，口服和腹腔给予化合 物14及腹腔给予化合物15均可以有效改善sars-cov-2感染的转 基因小鼠肺部的病理损伤。
[0328]
肺部代表性炎性细胞因子和趋化因子测定实验结果如图7所示， 口服和腹腔给予化合物14及腹腔给予化合物15可以有效降低肺部趋 化因子配体10(cxcl10)和β型干扰素(ifn-β)的基因表达水平。
[0329]
肺部测定炎性细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)数量的实验结果如 图8所示，口服和腹腔给予化合物14及腹腔给予化合物15均可以有 效降低sars-cov-2感染的转基因小鼠肺部的中性粒细胞(neu) 和巨噬细胞(mac)的数量。
[0330]
实验结果表明，本发明化合物能够有效抵抗转基因小鼠的体内 sars-cov-2感染。
[0331]
综上，本发明提供了一种式i所示的新型冠状病毒主蛋白酶抑制 剂及其制备方法和用途。式i所示化合物能够有效抑制sars-cov-2 m
pro
活性，可以用来制备sars-cov-2 m
pro
抑制剂，阻断sars-cov-2 病毒在患者体内的复制和转录。本发明的化合物在制备sars-cov-2 m
pro
抑制剂，抗sars-cov-2的药物，以及预防和/或治疗新型冠状病 毒肺炎的药物中具有非常好的应用前景。