一种新型FFA1和PPARα/γ/δ四重激动剂、其制备方法及其作为药物的用途

本发明涉及一种新型ffa1和pparα/γ/δ四重激动剂、其制备方法及其应用，属于医药技术领域。本发明中涉及的化合物结构在该领域具有新颖性和独特性。

背景技术：

代谢综合征是以胰岛素抵抗和内脏脂肪堆积为特征的常见病，伴有低密度脂蛋白升高和高密度脂蛋白胆固醇降低，其常见的病症为肥胖病、糖尿病、高血脂症、动脉粥样硬化和脂肪肝等，其中，糖尿病患者还常并发有高脂血症、心血管病、糖尿病肾病、糖尿病神经病变等疾病。代谢综合征可以通过饮食调节和锻炼治疗，当这些不能缓解症状时，需要进行药物治疗。在代谢综合症的药物治疗方面，目前临床使用的降糖药或降脂药等作用单一，均不同时具备较理想的改善代谢综合征各项病理指标的作用。因此，针对多个领域的改善代谢综合征药物研究正在进行，以期为代谢综合征患者带来更安全有效的新型药物。其中游离脂肪酸受体1(ffa1)激动剂和过氧化物酶体增殖物激活受体(ppar)多重激动剂成为近年来该领域的研究热点。

游离脂肪酸受体(freefattyacidreceptors1，ffa1)是一种g蛋白偶联受体，又称为g蛋白偶联受体40(gproteincoupledreceptor40，gpr40)。其与gq家族的g蛋白α-亚基相偶联，以在各种生理过程中发挥重要功能。ffa1主要在胰腺β细胞中表达，可通过gq蛋白增加磷脂酶c(plc)活性以促进胰岛素分泌。最近研究表明ffa1也在肝脏中表达，改善肝脏胰岛素敏感性。在高脂饮食(hfd)诱导的糖尿病小鼠中，ffa1的激活能够降低血糖，降低血浆胰岛素并改善葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。在2型糖尿病患者中也验证了ffa1激动剂的功效和安全性。此外，研究还发现ffa1的激活有助于改善高脂饮食诱导的c57bl/6小鼠的肝脂肪变性。近期研究表明ffa1可作为潜在的抗器官纤维化靶标，ffa1激动剂pbi-4050现已处于器官纤维化ii期临床研究中。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptor，ppar)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，根据亚型结构的不同，ppar可分为α、β(或δ)和γ三种类型，其中pparα主要分布于肝脏及褐色脂肪中，与调节血脂水平、胰岛素抵抗即炎症反应密切相关；pparγ主要表达于脂肪组织及免疫系统，与脂肪细胞分化、机体免疫及胰岛素抵抗关系密切，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物(troglitazone，tzds)作用的靶标；pparδ主要分布于脂肪、骨骼肌、心脏和肝脏中，主要调节糖脂代谢、改善炎症反应等。现已研究证实：ppar多重激动剂能够激活并调控相关基因表达，在脂肪形成、糖脂代谢中发挥重要作用，并能调控多种疾病包括肥胖、糖尿病、高血脂等[azadehmatin等，j.med.chem.2009，52，6835-6850；shen等，j.nutr.2006，899-905]。pparα/δ双重激动剂gft505也处于非酒精性脂肪肝iii期临床研究中，表现出较优异的药理活性(bertrandcariou等，expertopininvestig.drugs.2014，23，1441-1448)。pparα/γ/δ泛激动剂lanifibranor在2b期临床试验中达到主要终点和多个关键性次要终点，总体耐受性良好，是目前唯一同时满足美国fda和欧盟ema为加速nash药物批准设立的双重组织学终点的在研疗法。2020年10月13日，fda授予lanifibranor治疗nash的“突破性疗法称号”，自2015年以来，lanifibranor是首个获得该称号的nash治疗药物。然而，临床试验中所用剂量为800mg和1200mg/天，用药剂量较大。

鉴于ffa1对肝脂肪变性和纤维化的改善作用，能够与ppar-α/γ/δ产生协同增效作用，因此设计ffa1/ppar-α/γ/δ四重激动剂有望靶向脂肪肝复杂的多重发病机制，提高治疗效果。近期研究表明ffa1/ppar-α/γ/δ四重激动剂rla8对脂肪肝模型小鼠的治疗效果优于在研药物奥贝胆酸[menghuali等，j.pharmacol.exp.ther.2019，369，67-77]。发明人对该化合物开展了大量研究发现，rla8的长链羧酸易发生β氧化，使得其具有明显的药代动力学缺陷。针对rla8这一成药性缺陷，发明人有针对性地在羧酸的β位引入不同取代基，降低长链羧酸的β氧化，经过大量构效关系研究，从中优选出体内疗效更好、代谢更稳定的ffa1/ppar-α/γ/δ四重激动剂。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种疗效更好，代谢更稳定的ffa1/ppar-α/γ/δ四重激动剂，为预防或/和治疗脂肪肝、胆汁淤积性肝病、肝移植物抗宿主病、病毒引起的慢性肝病、酒精性肝病、药物性肝损伤、糖尿病、糖尿病并发症、前驱糖尿病、高脂血症、肥胖、代谢综合征、动脉粥样硬化、器官纤维化、炎症及癌症等疾病提供一类新的潜在药物。本发明人完全通过自身大量研究、实践和经验，优选出本发明所述的ffa1和ppar-α/γ/δ四重激动剂，其具有意想不到的代谢稳定性和药理学特征。

发明概述：

本发明一方面提供了以下化合物(i)或其药学可接受的盐、前药、酯和溶剂合物，其中所述的盐包括药学可接受的钠盐、钾盐、有机碱盐等；前药包括药学可接受的羧酸酯、酰胺等。

本发明涉及的化合物或药学可接受的盐、前药、酯和溶剂合物作为ffa1及pparα/γ/δ四重激动剂的用途。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其含有治疗有效剂量的所述化合物或其药学可接受的盐、前药、酯和溶剂合物，及适当的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明同时涉及所述化合物或其药学可接受的盐、前药、酯和溶剂合物用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗、预防或缓解一种或多种疾病或功能障碍，所述一种或多种疾病或功能障碍选自脂肪肝、胆汁淤积性肝病、线粒体病、肝移植物抗宿主病、病毒引起的慢性肝病、酒精性肝病、药物性肝损伤、糖尿病、糖尿病并发症、前驱糖尿病、高脂血症、肥胖、代谢综合征、痛风、动脉粥样硬化、器官纤维化、炎症及癌症。

本发明所述化合物可通过以下步骤合成：

式(ii)表示的化合物与式(iii)表示的化合物在碱性条件下发生缩合反应得到化合物i(zly18)。

作为所述的碱包括无机碱和有机碱，所述的无机碱可以提及例如，碱金属碳酸盐类例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯等；碱金属碳酸氢盐类如碳酸氢钾等；碱金属氢氧化物例如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等；所述的有机碱可以提及例如三乙胺、吡啶、二甲基吡啶、正丁基锂、叔丁醇钾，甲醇钠、乙醇钠等。

附图说明

图1：zly18对tritonwr-1339诱导高脂血症小鼠血脂指标的影响(n＝7)，****p≤0.0001为相对于模型对照组的统计学检验结果，^####p≤0.0001为相对于阳性对照(rla8)的统计学检验结果。

图2：zly18对高脂+高糖+四氯化碳诱导脂肪肝模型血脂和肝脏脂质的影响。*为相对于模型对照组的统计学检验结果，^#为相对于阳性对照(rla8)的统计学检验结果。

图3：肝切片he染色(a)、f4/80免疫组化(b)及nas活性评分(c)结果。

图4：肝切片马松染色(a)、α-sma免疫组化(b)及阳性面积分析(c)结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。需要说明的是，下述实施例仅是用于说明，而并非用于限制本发明。本领域技术人员根据本发明的教导所做出各种变化均应在本申请权利要求的保护范围之内。

实施例1

(e)-2-(2-氟-4-((3-甲氧基-5-(4-甲氧基苯乙烯基)苯氧基)甲基)苯氧基)乙酸

将1a(0.5g，1.9mmol)及1b(0.49g，1.9mmol)溶于乙腈(20ml)中，加入碳酸钾(0.79g，5.7mmol)，，60℃反应4h，tlc检测反应完全后，抽滤，母液旋干后残余物经柱层析(石油醚/乙酸乙酯，1∶1，v/v)纯化得到白色固体0.71g，产率为85.2％。

¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ7.53(d，j＝8.1hz，2h)，7.36-7.09(m，3h)，7.10-6.91(m，4h)，6.84(s，1h)，6.75(s，1h)，6.47(s，1h)，5.02(s，2h)，4.36(s，2h)，3.77(s，6h).¹³cnmr(75mhz，dmso-d6)δ170.78，161.12，161.09，160.09，159.52，139.93，130.01，130.01，129.43，129.35，129.12，128.36，126.54，120.05，114.90，114.68，110.45，105.39，105.38，102.53，100.73，68.99，68.00，55.69，55.63.esi-msm/z：437.1[m-h]^-.anal.calcd.forc25h23fo6：c，68.49；h，5.29；found：c，68.57；h，5.21.

实施例2

本发明中化合物的ffa1和ppar激动活性、代谢稳定性、体内降脂、抗脂肪肝及抗纤维化活性可以通过使用如下所述的测定系统测定。

以下生物学测试实施例描述解释本发明。

本发明测试例中具体条件的实验方法通常按常规条件或按照商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常用试剂。

测试例1本发明化合物对hffa1-cho稳转细胞和ppar的激动活性

本发明使用以下方法测定本发明化合物ffa1的激动活性：

hffa1-cho稳转细胞以3×10⁴/孔的密度接种至96孔板，置于37℃、5％co2的细胞培养箱过夜培养；弃去培养基，每孔加入100ulhbss清洗后，加入100ul含probenecid的fluo-4染料溶液37℃孵育90min；孵育结束后，吸出fluo-4染料溶液，加100μlhbss缓冲液，洗去染料；每孔加入100μl含probenecid的hbss，37℃孵育10min；96孔板中每孔加入不同浓度的药物，按照参数设置表用flipr(moleculardevices)读数。分析实验结果。激动活性＝(化合物孔荧光值-空白对照孔荧光值)/(亚油酸孔荧光值-空白对照孔荧光值)×100％，结果见表1。

本发明使用以下方法测定本发明化合物ppar的激动活性：

转染：转染前，hek293细胞以5×10⁴/孔的密度接种至96孔板，置于37℃、5％co2的细胞培养箱培养一天(用于pparγ和pparδ转染)；hepg2细胞以6×10⁴/孔的密度接种至96孔板，置于37℃、5％co2的细胞培养箱培养一天(用于pparα转染)；分别采用fugenehd转染试剂(购自roche)进行转染：25ng/wellpbind-pparα或pparδ或pparγ，25ng/wellpg5luc及0.15μl/wellfugenehd。

激动活性测定：转染24h后，将受试化合物加入转染后细胞孔板中，温孵18h，加入20μl细胞裂解液进行裂解及30μl萤光素酶分析试剂ii(购自promega公司)，混匀，测荧光，2秒延迟，读10秒。转染效率利用内参renilla荧光素酶活性校正。所有转染实验至少独立重复三次，每个实验组至少2个复孔。相对荧光强度＝萤火虫萤光强度/肾氏萤光强度。ppar激动活性(％)＝[(x-min)/(max-min)]×100％，其中x表示化合物组相对荧光强度，min表示空白对照组相对荧光强度，max表示10μm浓度的阳性对照化合物组相对荧光强度。实施例化合物pparα、pparδ及pparγ激动活性见表1。

表1：ffa1和ppar激动活性

结论：本发明化合物对ffa1、pparα、pparγ和pparδ具有相对平衡的激动活性，体外活性与rla8相当。

测试例2本发明化合物体外肝微粒代谢稳定性

大鼠肝微粒体(0.25mg/ml)与待测化合物(500ng/ml)在0.1mpbs缓冲液(ph7.4)中充分混匀，于37℃预孵育5分钟，然后根据代谢稳定性试剂盒说明书要求添加nadph催化代谢反应。在37℃下共孵育不同时间(0、15、30和60分钟)后，加入带有内标的冷甲醇涡旋3分钟，终止反应，以lc/ms检测上清液中游离药物浓度，计算半衰期和清除率，结果见表1。

表2：本发明化合物体外肝微粒代谢稳定性。

结论：本发明化合物zly18相比于rla8具有更好的代谢稳定性，代谢半衰期延长2.6倍。

测试例3降脂活性的评价

8周龄icr小鼠，随机分为正常组、溶媒对照组(空白溶媒：0.5％的羧甲基纤维素钠溶液)和受试化合物组(80mg/kg)。各组灌胃给药80mg/kg连续5天并于第4天腹腔注射tritonwr-1339600mg/kg制备高脂血症模型，第5天给药2h后取血，按试剂盒方法测定血清中tg(甘油三酯)、tc(总胆固醇)含量，结果见附图1。tritonwr-1339诱导高脂血症实验结果表明：zly18体内降血脂作用远远强于rla8，出乎意料地发现zly18治疗组小鼠血脂水平达到正常状态。

测试例4本发明中化合物的体内抗脂肪肝和肝纤维化活性可以通过使用如下所述的测定系统测定：

8周龄c57bl/6小鼠，雄性，随机分为4组，每组7只，空白对照组(空白溶媒：0.5％的羧甲基纤维素钠溶液)，模型组，阳性对照rla8组(100mg/kg)，受试化合物zly18组(100mg/kg)，给予西方饮食(tekladdiets，td.120528)饲料并辅以23.1g/l果糖和18.9g/l葡萄糖的饮用水，同时腹腔注射ccl4-橄榄油溶液(0.2μl/g)每周两次共12周。实验开始8周后，每天一次分别灌胃给予空白溶媒及受试化合物，连续造模的同时给药4周。于末次给药后，禁食12h后小鼠采血取血浆，以全自动生化分析仪测定小鼠血脂水平，并按试剂盒说明书方法测定肝脏中tg(甘油三酯)、tc(总胆固醇)和游离脂肪酸(nefa)含量，结果见附图2；取肝脏组织分别以he染色、马松染色以及f4/80和α-sma观察脂肪肝和肝纤维化改善情况，染色结果见附图3及附图4。

实验结果表明：非酒精性脂肪肝模型小鼠长期给药后，zly18较rla8具有更强的改善血脂、肝脏脂质沉积作用(附图2)；肝脏组织he染色(附图3)结果表明zly18相比于rla8，肝脂肪变性程度、炎症浸润和气球样病变得到更明显改善，同时肝脏nas评分明显降低。f4/80染色显示zly18具有更强的改善炎症作用；肝组织马松染色和α-sma染色(附图4)结果表明，相比于rla8，zly18给药组的肝纤维化程度得到更明显改善。综上所述，zly18改善非酒精性脂肪肝和纤维化的作用明显优于rla8，具有更广阔的药用开发前景。