甘蓝型油菜上卷叶位点的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及植物育种领域，具体涉及甘蓝型油菜上卷叶位点的分子标记及其应用。

背景技术：

甘蓝型油菜是世界上最重要的油料作物之一，为人类提供食用油的同时，还可以作为饲料以及生产工业原料等(allenderetal.,2010)。优化甘蓝型油菜的株型、提高甘蓝型油菜的光合效率是提高产量的重要途径，培育高光合效率株型的油菜品种，就需要恰当的油菜种质资源，并且开发相应的分子标记。

油菜的叶型调控机制比较复杂，大多数是受多基因控制。经过人工ems诱变和自然突变，已获得多个矮杆突变体，并进行了遗传研究。育种家通过ems诱变获得了单显性位点控制下卷叶突变体bndcl1，通过连锁图谱将控制位点定位在了c05染色体上，并使用基于itraq的比较蛋白质组分析了下卷叶形成的机理(wangetal.,2016；chenetal.,2018)。“矮源1号”是江苏省农科院从澳大利亚太平洋种子公司引进的一个矮杆品种，该品种在苗期同样出现叶片下卷的表型(浦惠明等，1995)。曲高平等通过ems诱变甘蓝型油菜品种中双9号获得了一个上卷叶油菜bnucl1(曲高平等，2014)。yang等(2019)和huang等(2020)将甘蓝型油菜上卷叶突变体bnuc1和bnuc2的控制位点定位在a05染色体上不同区段内。

尽管育种家对卷叶性状遗传和育种作出了一些积极的探索，但相关育种工作还没有取得突破，还需要继续开发控制油菜卷叶性状的新主效位点及其分子标记，为育种工作提供基础。开发油菜卷叶新主效位点的紧密连锁分子标记，在分离世代中可以提高选择的效率。因此，与油菜上卷叶位点紧密连锁的分子标记的开发和应用是油菜上卷叶应用于育种的关键技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供甘蓝型油菜上卷叶位点的分子标记及其应用，本发明发现了一个控制甘蓝型油菜上卷叶性状的新位点，并且发展了其紧密连锁的分子标记技术，可用于检测上卷叶油菜及选育上卷叶油菜品种。

为了实现上述发明目的，本发明提供一种甘蓝型油菜上卷叶位点bnuc3，所述bnuc3位点位于甘蓝型油菜a02染色体上6126244bp-7833204bp。参考基因组序列(甘蓝型油菜a02染色体序列)见ncbi数据库(genbank:lt220456.1)。

本发明还提供甘蓝型油菜上卷叶位点bnuc3的分子标记，包括3个紧密连锁的分子标记bna02v099、bna02v573和bna02indel1，其中分子标记bna02v099位于甘蓝型油菜a02染色体上6274194bp-6174384bp；分子标记bna02v573位于甘蓝型油菜a02染色体上6907939bp-6908155bp；分子标记bna02indel1位于甘蓝型油菜a02染色体上6406298bp-6407901bp；这3个紧密连锁的分子标记bna02v099、bna02v573和bna02indel1的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示。

本发明还提供用于扩增甘蓝型油菜上卷叶位点bnuc3的分子标记bna02v099、bna02v573和bna02indel1的引物对，用于扩增分子标记bna02v099的引物对为seqv099-f、seqv099-r，其序列分别如seqidno.4、seqidno.5所示；用于扩增分子标记bna02v573的引物对为seqv573-f、seqv573-r，其序列分别如seqidno.6、seqidno.7所示；用于扩增分子标记bna02indel1的引物对为seqindel1-f、seqindel1-r，其序列分别如seqidno.8、seqidno.9所示。

本发明还提供甘蓝型油菜上卷叶位点bnuc3的分子标记bna02v099、bna02v573和bna02indel1在含甘蓝型油菜上卷叶位点bnuc3的甘蓝型油菜品种或种质检测中的应用。

本发明还提供甘蓝型油菜上卷叶位点bnuc3的分子标记bna02v099、bna02v573和bna02indel1在选育上卷叶油菜品种或种质中的应用。

本发明还提供一种利用上述的分子标记或引物对选育上卷叶油菜品种的方法，采用bna02v099、bna02v573和bna02indel1对应的引物对扩增油菜基因组dna，扩增产物在40％聚丙烯酰胺凝胶或1％琼脂糖凝胶电泳后，如果获得njau-m1295的扩增片段，则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜上卷叶位点，预测该油菜是上卷叶油菜。如果获得亲本njau-m3756的扩增片段，则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜正常叶片位点，预测该油菜是正常平展叶片油菜。

本发明甘蓝型油菜上卷叶位点连锁的分子标记是通过下列步骤筛选的：

(1)在育种过程中发现了一株上卷叶突变株，通过连续自交获得了一个稳定的上卷叶材料njau-m1295；利用njau-m1295分别与正常叶片的优异种质资源njau-m3756和中双11杂交，得到杂种f1，两个f1分别与轮回亲本njau-m3756和中双11回交一代获得bc1群体，f1自交得到f2群体，f2(njau-m3756×njau-m1295)群体衍生获得2个f2:3群体。

(2)f1均呈现中间表型，对f2和f2:3世代群体统计表型并进行卡方测验，表明上卷叶性状、中间性状与平展叶性状之间比例符合1:2:1的孟德尔分离比，杂交组合的回交世代呈现出相同的遗传规律，说明上卷叶性状遗传上受单显性基因控制。

(3)通过芯片检测获得bc1(zs11×(zs11×njau-m1295))群体中37个单株的snp标记分型结果，与其表型数据一起进行定位分析，控制甘蓝型油菜上卷叶性状的bnuc3位点被定位到a02染色体上6126244bp-7833204bp的区段内。定位区间内的snp标记位点均无多态，之后的标记开发与定位使用的群体更改为njau-m3756与njau-m1295杂交的后代。

(4)利用油菜a02染色体6126244bp-7833204bp的ssr信息，设计分子标记。使用基因组序列测序和比对获得的indel位点，设计分子标记。

(5)利用“njau-m3756×njau-m1295”产生的f2群体，鉴定新设计分子标记的遗传带型。

(6)根据f2和f2:3群体共584个单株的表型数据和分子标记数据，发现紧密连锁的共显性/显性分子标记bna02v099、bna02v573和bna02indel1，而且其遗传带型清晰可见。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1)首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜a02染色体6126244bp-7833204bp区域内控制甘蓝型油菜上卷叶的位点，同时发现与上卷叶位点紧密连锁的共显性/显性分子标记bna02v099、bna02v573和bna02indel1；

2)在f2和f2:3群体中，甘蓝型油菜上卷叶性状与这3个分子标记呈极显著相关，f2和f2:3单株基因型和表型一致，因此这3个分子标记在今后的上卷叶油菜辅助选择育种中具有巨大的应用前景；

3)本发明能够在甘蓝型油菜中找到纯合上卷叶油菜，对上卷叶株型育种有很大帮助。

附图说明

图1：苗期上卷叶油菜表型图；左侧为正常平展叶片的油菜表型图，中间为中间性状油菜表型图，右侧为上卷叶油菜表型图；

图2：分子标记bna02v099对部分单株基因分型，其中泳道1和11为纯合上卷叶带型；2、5、6、7、8、9、10和12为杂合上卷叶带型；泳道3和4为纯合平展叶带型；

图3：分子标记bna02v573对部分单株基因分型，其中泳道1、2、3、6、8、10、11和12为杂合上卷叶或纯合上卷叶带型；泳道4、5、7和9为纯合平展叶带型；

图4：分子标记bna02indel1对部分单株基因分型，其中泳道1、4、7和11为纯合上卷叶带型；泳道3、6、8、9和12为杂合上卷叶带型，泳道2、5和10为纯合平展叶带型。

具体实施方式

下面结合说明书附图对本发明创造作进一步说明。下述实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及实验材料均为常规生化试剂。

实施例1：甘蓝型油菜上卷叶位点的获得

(1)遗传群体构建

利用两个甘蓝型油菜材料njau-m1295与甘蓝型油菜品种中双11进行杂交，得到杂种f1，f1与中双11回交获得bc1群体，f1自交得到f2群体。

(2)甘蓝型油菜bc1群体表型测定

对上述bc1单株群体中单株进行表型观察以及农艺性状调查。

(3)遗传图谱的构建

选择bc1群体中的37个单株叶片dna样品用于snp标记的数据获取。snp芯片共有52157个位点，但此bc1群体的dna样品并不是在所有位点上都有多态性，去除无效标记后进行关联分析。

(4)结果与分析

将37个用于snp芯片的dna样品的表型数据与其snp分型数据一起进行定位分析，控制甘蓝型油菜上卷叶性状的bnuc3位点被定位到a02染色体，定位区间位于6126244bp-7833204bp的区段内。

实施例2：甘蓝型油菜上卷叶位点紧密连锁分子标记的获得

(1)分子标记开发

本研究利用snp芯片技术将上卷叶位点定位在油菜a02染色体的6126244bp-7833204bp区段内，下载油菜品种darmor的参考基因组序列(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/)，利用ssrhunter1.3软件查找ssr位点，在其上下游各增加150bp设计引物，ssr标记位点命名为“bna02v+ssr位点”。通过对定位区间内重要基因的基因组序列测序发现的indel位点用于分子标记开发；采用primerpremier5.0软件在bnaa02:6126244bp-7833204bp区段内设计多个分子标记。定位区间内的snp标记位点均无多态，之后的标记筛选使用的群体更改为njau-m3756与njau-m1295杂交的后代。

(2)分子标记鉴定

采用ctab法提取f2(njau-m3756×njau-m1295)群体甘蓝型油菜叶片的基因组dna，pcr反应体系(10μl)，其中含有0.5μldna模板、上下游引物(1mmol/l)各0.25μl、5μlmix，和4μlddh2o。pcr反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。pcr扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶或1％琼脂糖电泳。胶片在bio-radvisadoc3.0(bio-rad，usa)成像系统中扫描分析。

(3)结果与分析

在设计的多个分子标记中，bna02v099、bna02v573和bna02indel1分子标记与表型一致性达到99％，认为这3个分子标记与甘蓝型油菜上卷叶位点是紧密连锁。在f2群体中这3个紧密连锁分子标记有2种或3种带型，bna02v099是共显性标记，条带大小分别为191bp，206bp和同时拥有两条带，拥有191bp条带的单株是纯合上卷叶单株，拥有206bp条带的单株是纯合平展叶油菜，同时具有191bp与206bp条带的为上卷叶杂合体；bna02v573是显性标记，条带大小分别为217bp和没有条带，拥有217bp条带的单株是纯合上卷叶单株或上卷叶杂合体，无带型的单株是平展叶油菜。bna02indel1是共显性标记，条带大小分别为1604bp，198bp和同时拥有两条带，拥有198bp条带的单株是纯合上卷叶单株，拥有1604bp条带的单株是平展叶油菜，同时具有1604bp与198bp条带的为上卷叶杂合体。这3个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为seqv099-f、seqv573-f、和seqindel1-f，下游引物序列分别为seqv099-r、seqv573-r和seqindel1-r。

实施例3：紧密连锁分子标记在上卷叶油菜选择上的应用

(1)双亲本基因组扩增检测

用于验证上卷叶油菜亲本“njau-m1295”(bna02v099等位条带为191bp；bna02v573等位条带为217bp；bna02indel1等位条带为198bp)，亲本“njau-m3756”(bna02v099等位条带为206bp；bna02v573无等位条带；bna02indel1等位条带为1604bp)。

(2)群体扩增检测及标记分析

用以上两个亲本进行杂交，得到f1代种子种植后长成一个f1代单株，其自交结实收获得f2代种子，后者种植长成一个包含分离性状的f2群体，在其中选择单株，自交得到f2:3分离群体，测定群体单株农艺性状和表型。

采用ctab法分别提取f2和f2:3群体单株叶片的基因组dna。pcr反应体系(10μl)，其中含有0.5μldna模板、上下游引物(1mmol/l)各0.25μl、5μlmix，和4μlddh2o。pcr反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。pcr扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶或1％琼脂糖凝胶电泳。胶片在bio-radvisadoc3.0(bio-rad，usa)成像系统中扫描分析。分析bna02v099、bna02indel1和bna02v573在亲本中的条带类型。

(3)结果与分析

在njau-m1295和njau-m3756的杂交组合后代f2和f2:3检测中，发现bna02v099、bna02indel1和bna02v573分子标记与表型一致性达到99％。结果表明了用bna02v099、bna02indel1和bna02v573分子标记预测油菜上卷叶有较好的预测效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>南京农业大学

<120>甘蓝型油菜上卷叶位点的分子标记及其应用

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<170>siposequencelisting1.0

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<211>191

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<211>217

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<213>人工序列(artificialsequence)

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